任小旦，張瑩雯，王秀萍，鄭保根

(武漢大學中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

當歸補血湯對高糖條件下系膜細胞Nrf2表達及T-SOD、MDA的影響

任小旦，張瑩雯，王秀萍，鄭保根

(武漢大學中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

[摘要]目的 研究當歸補血湯對高糖條件下大鼠腎小球系膜細胞(GMCs)核因子相關因子2(Nrf2)表達及總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的影響，探討其在糖尿病腎病(DN)治療中的作用機制。方法 將60只大鼠分為正常組、高糖組、當歸補血湯高劑量組[7 g/(kg·d)]、當歸補血湯中劑量組[3.5 g/(kg·d)]、當歸補血湯低劑量組[1.75 g/(kg·d)]、格列奇特組[(2 mg/kg·d)]，每組10只。應用RT-PCR法檢測各組GMCs的Nrf2 mRNA表達情況，Western blot法檢測各組GMCs的Nrf2蛋白表達情況，應用黃嘌呤氧化酶法檢測各組GMCs培養(yǎng)上清液的T-SOD活性，應用硫代巴比妥酸法檢測各組GMCs培養(yǎng)上清液的MDA含量。結果 正常組Nrf2 mRNA和蛋白有一定量的表達，高糖組和正常組相比Nrf2 mRNA和蛋白表達均增加，當歸補血湯高劑量組對高糖條件下系膜細胞Nrf2 mRNA和蛋白表達均有明顯上調作用(P均<0.01)；與正常組相比，高糖組T-SOD活性明顯降低(P<0.01)，MDA含量明顯增多(P<0.01)，而當歸補血湯各劑量組能提高T-SOD的活性，抑制高糖條件下MDA的過多生成，尤其以高劑量組最為明顯(P<0.01)。結論 當歸補血湯能上調高糖條件下系膜細胞Nrf2的表達，提高T-SOD的活性，抑制MDA的過多生成，從而抵抗高糖誘導的氧化應激反應，保護系膜細胞。

當歸補血湯；系膜細胞；Nrf2；T-SOD；MDA

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN) 是糖尿病(diabetes mellitus,DM)引起的危害性最大的慢性微血管并發(fā)癥，已成為導致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。近年研究表明，氧化應激在 DN 的病理改變中發(fā)揮關鍵作用[2-3]。核因子相關因子2(Nrf2)是外源性有毒物質和氧化應激的感受器，維持細胞內氧化還原平衡的重要轉錄因子[4]，因此在細胞的抗氧化應激過程中發(fā)揮重要作用，在糖尿病及其并發(fā)癥的研究中也成了一個重要的靶點。超氧化物歧化酶(SOD)的活性反映了細胞內清除氧自由基即抗氧化的能力；丙二醛(MDA)是機體自由基作用于生物膜多價不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應的終產物，MDA的含量可反映脂質過氧化的程度,間接反映細胞受損情況和氧自由基水平。SOD和MDA是衡量機體氧自由基基礎代謝狀態(tài)的主要指標。糖尿病腎病屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學“消渴”中“下消”的范疇，臨床治療多采用補氣養(yǎng)陰生血、活血化瘀等中藥治療。當歸補血湯由補氣的黃芪和活血的當歸組成，具有補氣生血活血功效，正契合DN的病因病機。腎小球系膜細胞(GMCs)是DN的各種致病因子作用的主要靶細胞，因此本實驗旨在通過血清藥理學研究，探討當歸補血湯對高糖條件下GMCs的Nrf2表達及T-SOD、MDA的影響，從而為當歸補血湯用于治療DN提供理論依據。

1 實驗資料

1.1材料及試劑

1.1.1實驗動物和細胞 60只SPF級SD成年雄性大鼠,體質量180～200 g,4～6周齡,由武漢大學動物實驗中心提供,合格證號:[SCXK(鄂)2003-0004]。大鼠GMCs株(HBZY-1，購自武漢大學典藏中心)。

1.1.2實驗藥材、試劑和儀器 當歸補血湯(黃芪∶當歸=5∶1，由武漢大學中南醫(yī)院中藥房提供，用自來水將中藥浸泡30 min后分煎2次混勻，濃縮至2 kg/L藥液， 冷卻后裝瓶放冰箱備用)； 格列奇特(法國施維雅藥廠，批號: 2005883)；RPM I 1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，Gibco公司；超凈工作臺,蘇州凈化;37 ℃ 5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱,美國Thermo Forma公司；紫外分光光度計，BIO-RAD公司；T-SOD和MDA檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，ASPEN公司；電泳儀，北京六一儀器廠，型號：DYY-6C；兔抗鼠單克隆Nrf2抗體(一抗)，CST公司，目錄號#8882S；HRP標記的山羊抗兔(二抗)，KPL公司，目錄號074-1506；Trizol,MRC公司；SYBR GreenⅠ熒光染料,晶賽公司；BIO-RAD CFX Connect熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。

1.2實驗方法

1.2.1含藥血清的制備 60只SPF級SD成年雄性大鼠隨機分為正常組、高糖組、當歸補血湯高劑量組[7 g/(kg·d)]、當歸補血湯中劑量組[3.5 g/(kg·d)]、當歸補血湯低劑量組[1.75 g/(kg·d)]、格列奇特組[2 mg/(kg·d)]，每組10只，每日定時灌胃，各組藥物按大鼠與人等效劑量折算。正常組、高糖組不給藥，每日灌等量生理鹽水,每日1次,連續(xù)7 d。于末次灌胃2 h后經腹主動脈采血，離心取血清，56 ℃水浴30 min滅活處理后，經0.22 μm孔徑的針頭濾器過濾除菌，分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細胞實驗分組 正常組(5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇+20%FBS)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖+20% FBS)、當歸補血湯高劑量組(10%當歸補血湯高劑量含藥血清+30 mmol/L葡萄糖+10% FBS)、當歸補血湯中劑量組(10%當歸補血湯中劑量含藥血清+30 mmol/L葡萄糖+10%FBS)、當歸補血湯低劑量組(10%當歸補血湯低劑量含藥血清+30 mmol/L葡萄糖+10% FBS)、格列齊特組(10%格列齊特含藥血清加30 mmol/L葡萄糖+10% FBS)。

1.2.3腎小球系膜細胞上清液的收集 取傳代培養(yǎng)的腎小球系膜細胞,吸去培養(yǎng)液,用PBS洗滌培養(yǎng)瓶2次,然后加0.25%胰蛋白酶,放入細胞培養(yǎng)箱中,37 ℃消化數分鐘后加入含20% FBS 1640液5 mL終止消化,4 ℃、1 000 r/min離心5 min,棄去上清,加入培養(yǎng)液以1×104/孔接種于48孔培養(yǎng)板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h,使細胞貼壁。后更換無血清1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞同步于G0/G1期,吸棄培養(yǎng)板內培養(yǎng)液,按1.2.2實驗分組加入各自不同條件培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,終止培養(yǎng),離心2 000 r/min,10 min后取上清,收集培養(yǎng)上清液分裝,-70℃低溫冰箱保存。

1.2.4RT-PCR檢測各組GMCs的Nrf2的mRNA表達量 收集培養(yǎng)72 h的各組細胞，0.01 mol/L PBS洗各組細胞,按Trizol說明書提取細胞總RNA。按cDNA逆轉錄試劑盒說明逆轉錄RNA合成cDNA后，采用BIO-RAD CFX Connect熒光定量PCR檢測儀進行擴增。擴增條件為:94 ℃ 2 min后,進行40個循環(huán):94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s(監(jiān)測熒光信號);反應完成后于16 ℃保存。采用β-actin為內參。引物和內參序列如下：Nrf2上游為5’-TGTCAGCTACTCCCAGGTTG-3’，下游為5’-ATCAGGGGTGGTGAAGACTG-3’；β-actin上游為5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，下游為5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。目的基因擴增用Ct值,應用ΔΔCT法進行定量分析。ΔCT(目的基因)=CT目的基因-CT內對照基因,ΔΔCT=ΔCT目的基因-ΔCT標準值,使用2-ΔΔCT計算基因表達情況。

1.2.5Western blot檢測各組GMCs的Nrf2蛋白表達量 提取各組細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度;配制SDS-PAGE膠，取等量蛋白電泳，轉膜3 h，將膜置于5%的脫脂奶粉中，室溫輕搖封閉1 h，加入兔抗鼠單克隆Nrf2一抗(1∶1 000)，4 ℃輕搖過夜,TBST漂洗3次，每次10 min，加入HRP標記的二抗(1∶10 000)，室溫輕搖2 h，TBST漂洗，化學法發(fā)光，曝光，顯影，定影后獲得相應蛋白條帶底片，將膠片進行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.2.6各組GMCs上清液T-SOD活性和MDA含量檢測采用黃嘌呤氧化酶法檢測各組GMCs培養(yǎng)上清液的總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。采用硫代巴比妥酸法檢測各組GMCs培養(yǎng)上清液的MDA含量。嚴格按照說明書操作步驟進行操作。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，若方差齊，組間比較采用單因素方差分析；若方差不齊，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組GMCs的Nrf2的mRNA表達情況 Nrf2 mRNA在正常組細胞中有一定量的表達，高糖組Nrf2 mRNA表達量高于正常組(P<0.05)。當歸補血湯中劑量組、高劑量組及格列齊特組Nrf2 mRNA表達量均明顯高于高糖組(P均<0.05)。當歸補血湯中劑量組和格列齊特組比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 各組RMCs的Nrf2的mRNA相對表達量

2.2各組GMCs的Nrf2蛋白表達情況 高糖組細胞Nrf2蛋白表達量明顯高于正常組(P<0.01)，當歸補血湯中劑量組、高劑量組及格列齊特組Nrf2蛋白表達量明顯高于高糖組(P均<0.01)。當歸補血湯高劑量組和格列齊特組比較差異無統(tǒng)計學意義。見圖2及圖3。

圖2 Wertern blot檢測各組Nrf2蛋白表達情況

圖3 各組RMCs的Nrf2的蛋白相對表達量

2.3各組GMCs上清液T-SOD活性 高糖組細胞上清液T-SOD活性顯著低于對照組(P<0.01)，當歸補血湯各劑量組及格列齊特組T-SOD活性明顯高于高糖組(P均<0.01)。當歸補血湯高劑量組和格列齊特組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組RMCs的上清液T-SOD活性

2.4各組GMCs上清液MDA含量 高糖組細胞上清液MDA的含量顯著高于正常組(P<0.01)，當歸補血湯中劑量組、高劑量組及格列齊特組MDA含量明顯低于高糖組(P均<0.01)。當歸補血湯高劑量組與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與格列齊特組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組RMCs的上清液MDA含量

3 討 論

糖尿病是目前對人類影響最大的代謝性疾病，其并發(fā)癥也很多，其中20%～40%會發(fā)生DN。DN是糖尿病常見的難治性微血管并發(fā)癥,其中約40%的DN會進展成ESRD[5]。DN早期特征性的病理學改變有腎小球肥大、增殖，細胞外基質(ECM)大量積聚,腎小球基底膜增厚，最終導致腎小球硬化和腎小管間質彌漫性纖維化。系膜細胞是腎小球的固有細胞，對維持腎小球結構和功能的動態(tài)穩(wěn)定性有重要作用，同時為腎小球毛細血管襻調節(jié)腎小球濾過提供結構保障[6]，在DN的發(fā)病過程中有重要作用。

氧化應激已被公認為是DN發(fā)病機制中十分重要的環(huán)節(jié)。核轉錄因子Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵因子,是細胞抗氧化還原的中樞調節(jié)者[7]。目前研究證實,腎組織活性氧族(reactive oxygen species,ROS)過度蓄積是導致糖尿病腎損害的重要原因。有研究表明，高糖可刺激機體系膜細胞產生大量的ROS及大量表達的Nrf2，且兩者的改變相一致，提示正常情況下，Nrf2的表達與氧化應激的程度相平行，以維持機體內氧化還原狀態(tài)的平衡[8]。正常狀態(tài)下，Nrf2位于細胞質中，在與其抑制蛋白Keapl相互作用后降解、失活。 在機體受到活性氧或親核物質的刺激時，胞質中的Nrf2就會與Keapl解離，發(fā)生去泛素化，并進入細胞核。在胞核內，Nrf2結合其他的bz-IP蛋白形成異二聚體后，與抗氧化反應元件ARE靶向結合使ARE相關的抗氧化酶基因的表達上調，啟動Nrf2下游靶基因包括過氧化氫酶(CAT)、SOD、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)、血紅素加氧酶(HO-1)等表達[9-11]。

當歸補血湯是中國傳統(tǒng)醫(yī)學的經典方，方中黃芪味甘、溫，具有益氣固表、補氣升陽等作用；當歸味甘、辛溫，能補血生血，氣輕而辛，又能行血。近年有關當歸補血湯對腎功能保護作用的研究有眾多報道，如魏明剛等[12]、趙紅心等[13]分別從動物實驗和臨床觀察中發(fā)現當歸補血湯對DN有明顯的治療作用。周必發(fā)等[14]研究發(fā)現當歸補血湯能夠明顯抑制高糖條件下GMC增殖及其細胞中NF-κB蛋白表達的增加,從而發(fā)揮預防和治療腎小球硬化作用,進而延緩DN的進展。本實驗研究結果發(fā)現，當歸補血湯能上調高糖條件下Nrf2的表達，無論是從蛋白層面還是從基因層面上均證實了這一點，尤其在高劑量組尤為明顯。大量研究表明，Nrf2及其下游通路可以對抗氧化應激導致的腎臟細胞損傷[8，15-16]，而當歸補血湯具有上調Nrf2表達的作用，因而具有抗氧化應激的功效。本研究還發(fā)現，高糖條件下各組系膜細胞經當歸補血湯含藥血清干預后上清中MDA含量均有所下降，而SOD總活性均有所上升，高劑量組尤為明顯，對MDA的調節(jié)作用甚至優(yōu)于格列奇特。由于MDA含量是直接反映脂質過氧化的程度，而SOD活性是間接反映O2-的產生量，而氧化應激本就是指機體組織或細胞內氧自由基生成增加和/或清除能力降低[17]，因此，這些結果更進一步支持了上述結論。

綜上所述，經典的補氣生血方當歸補血湯能上調高糖條件下系膜細胞Nrf2的表達，提高T-SOD的活性，抑制MDA的過多生成，抵抗高糖誘導的氧化應激反應，保護系膜細胞，其上述調節(jié)作用在某些方面甚至優(yōu)于西藥格列奇特。但當歸補血湯上調Nrf2表達、提高T-SOD活性、抑制MDA過多生成的具體信號傳導通路及其機制還有待于進一步深入研究。

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Effects of Danggui Buxue decoction on glomerular mesangial cell Nrf2 expression and T-SOD, MDA in high glucose condition

REN Xiaodan，ZHANG Yingwen，WANG Xiuping，ZHENG Baogen

(Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 430071，Hubei，China)

Objective It is to observe the effects of Danggui Buxue decoction on glomerular mesangial cell Nrf2 expression and T-SOD activity, MDA content in high glucose condition,and to explore its treatment significance in the process of diabetic nephropathy (DN). Methods Sixty rats were randomly divided into normal group, high glucose group, high, medium and low dose of Danggui Buxue decoction groups [7 g/(kg·d), 3.5 g/(kg·d),1.75 g/(kg·d)respectively], Gliclazide group[2 mg/(kg·d)], each group had 10 rats. RT-PCR was used to detect expression of Nrf2 mRNA and Western blot used to detect expression of Nrf2 protein of GMCs in each group；Xanthine Oxidase assay was used to detect T-SOD activity and Thiobarbituric Acid method was used to detect MDA content in cell supernatant of GMCs in each group. Results Both of Nrf2 mRNA and protein in normal group had a certain amount of expression；Nrf2 mRNA (P<0.05) and protein (P<0.01) were both increased in high glucose group compared with normal group. High-dose group has a significantly upregulation effect on Nrf2 mRNA and protein expression of GMCs in high glucose condition(P<0.01). Compared with the normal group, T-SOD activity of high glucose group was significantly decreased (P<0.01), MDA content was significantly increased (P<0.01)；while SOD activity was improved, MDA production in high glucose condition was inhibited in every Dangui Buxue decoction group, especially in the high dose group (P<0.01). Conclusion Danggui Buxue decoction could upregulate the expression of Nrf2 mRNA and protein，improve SOD activity，inhibit MDA excessive generation of GMCs in high glucose condition, thereby resisting oxidative stress induced by high glucose and protecting mesangial cells.

Dangui Buxue decoction；glomerular mesangial cells；Nrf2；T-SOD；MDA

任小旦，男，碩士研究生，研究方向為中西醫(yī)結合內分泌。

張瑩雯，E-mail ：hhao3838@sina.com

國家自然科學基金資助項目(81373793)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.26.002

R-33

A

1008-8849(2015)26-2855-04

2015-05-10