賈曉琳，王東澍，高志奇，馮爾玲，鄭繼平，王恒樑，郭桂英，劉先凱

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PlcR在炭疽芽胞桿菌A16R中的功能研究

賈曉琳1,2，王東澍2，高志奇2，馮爾玲2，鄭繼平1,3，王恒樑2，郭桂英1，劉先凱2

1. 海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071；3. 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)培育基地；?？?570228

炭疽芽胞桿菌()、蠟樣芽胞桿菌()和蘇云金芽胞桿菌()均屬于蠟樣芽胞桿菌群，在遺傳學(xué)上有很高的相似性。PlcR (Phospholipase C regulator)在蠟樣芽胞桿菌中是十分重要的調(diào)控因子，但基因在炭疽芽胞桿菌中發(fā)生一個(gè)無(wú)義突變導(dǎo)致在炭疽芽胞桿菌中產(chǎn)生一個(gè)截短PlcR蛋白。為了研究基因?qū)μ烤已堪麠U菌功能的影響，文章以蠟樣芽胞桿菌CMCC6330基因組為模板，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2A-后導(dǎo)入炭疽芽胞桿菌疫苗株A16R中獲得重組菌株，對(duì)其進(jìn)行表型分析。結(jié)果顯示，炭疽芽胞桿菌重組菌株的溶血活性基本沒有恢復(fù)，但恢復(fù)了部分神經(jīng)鞘磷脂酶活性，表明將蠟樣芽胞桿菌的基因?qū)胩烤已堪麠U菌后，可以直接激活神經(jīng)鞘磷脂酶活性。

蠟樣芽胞桿菌；；炭疽芽胞桿菌；神經(jīng)鞘磷脂酶；溶血素

PlcR是廣泛存在于蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌中十分重要的多功能調(diào)控因子[1]，它可激活多種編碼毒力因子的基因表達(dá)，如神經(jīng)鞘磷脂酶、蛋白酶和溶血素等。在蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌中，PlcR蛋白受PapR的激活，PapR在的控制下以前肽形式表達(dá)后通過SecA分泌機(jī)制輸出到細(xì)胞外，在胞外成為激活的五肽形式后，再通過寡肽透性酶系統(tǒng)Opp進(jìn)入細(xì)胞，與PlcR結(jié)合并激活PlcR，從而與PlcRbox結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控染色體上的幾十個(gè)基因。改變基因的序列可使蠟樣芽胞桿菌與蘇云金芽胞桿菌中的溶血素和細(xì)胞毒素的表達(dá)與活性減弱[2,3]。在蠟樣芽胞桿菌PlcR缺失株中，一些蛋白質(zhì)如：神經(jīng)鞘磷脂酶、溶血素、腸毒素及許多蛋白酶是不表達(dá)的[4]。炭疽芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌屬于蠟樣芽胞桿菌群，炭疽芽胞桿菌中存在與蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌同源的基因序列，但在炭疽芽胞桿菌當(dāng)中基因發(fā)生了一個(gè)無(wú)義突變[5]，導(dǎo)致其提前終止，故無(wú)法發(fā)揮其正常的功能。本文將蠟樣芽胞桿菌的基因?qū)胩烤已堪麠U菌減毒疫苗株A16R(pXO1+pXO2-)中并對(duì)其生長(zhǎng)狀態(tài)、溶血酶活性及神經(jīng)磷脂酶活性進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)中用到的菌株及質(zhì)粒見表1。

1.2 方法

1.2.1 PlcR在A16R中的表達(dá)

1.2.1.1 表達(dá)載體pBE2A-構(gòu)建 以CMCC-63301基因組為模板，用引物_F/R(表2)擴(kuò)增編碼區(qū)片段，用HⅠ和Ⅰ酶切后連接到本實(shí)驗(yàn)室保存的載體pBE2A上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2A-，在該重組質(zhì)粒中，基因處于枯草芽胞桿菌淀粉酶基因啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控。將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pBE2A-轉(zhuǎn)化到DH5α中，測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌SCS110中去甲基化，后提質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到炭疽芽胞桿菌中疫苗株A16R中構(gòu)建pBE2A-/A16R，同時(shí)把表達(dá)載體pBE2A也導(dǎo)入A16R中，構(gòu)建pBE2A/A16R的用作對(duì)照。

1.2.1.2 PlcR表達(dá)、純化及抗PlcR多克隆抗體制備 為了將來(lái)檢測(cè)基因是否在炭疽芽胞桿菌中中表達(dá)，我們制備了抗PlcR多克隆抗體，具體方法是：以CMCC63301基因組為模板，用引物pET_F/R (表2)擴(kuò)增片段，用HⅠ和d Ⅲ酶切連接到pET32a載體上，將構(gòu)建好的質(zhì)粒化學(xué)轉(zhuǎn)化到DH5α中，測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)中，構(gòu)建pET32a-/BL21，同時(shí)用相同的方法構(gòu)建pET32a/BL21。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用到的菌株及質(zhì)粒

表2 本實(shí)驗(yàn)中所用到的引物列表

注：下劃線部分表示限制性酶切位點(diǎn)。

pET32a-/BL21誘導(dǎo)表達(dá)判斷蛋白的可溶性，用可溶性蛋白純化試劑盒純化蛋白。獲得純化好的蛋白后采用背點(diǎn)注射和腹腔注射免疫小鼠。一周后鼠尾取血ELISA測(cè)效價(jià)，效價(jià)比較高時(shí)開始眼球取全血，制備鼠多克隆抗體血清。

1.2.1.3 Western blot分析確認(rèn)PlcR在炭疽芽胞桿菌中表達(dá) 將構(gòu)建的重組菌株pBE2A-/A16R和pBE2A/A16R培養(yǎng)13 h，各收集1 mL培養(yǎng)菌液，離心棄上清，菌體用200 μL純水重懸，加入等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10 min，離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用上述制備的PlcR小鼠多抗進(jìn)行免疫印跡分析，使用低溫凝膠成像儀照相。

1.2.2 表型分析

1.2.2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 在LB瓊脂平板上挑取A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單克隆，轉(zhuǎn)接到含5 mL LB液體培養(yǎng)基試管中，在搖床中37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，吸取50 μL轉(zhuǎn)接至新鮮5 mL LB試管中同樣條件下培養(yǎng)12 h。吸取1 mL的菌液，轉(zhuǎn)接于含100 mL LB的500 mL三角瓶中培養(yǎng)(37℃，220 r/min)。每隔1 h取出三角瓶，測(cè)定600并記錄，繪制成生長(zhǎng)曲線。

1.2.2.2 溶血現(xiàn)象觀察 在平板上挑取蠟樣芽胞桿菌CMCC63301、炭疽芽胞桿菌中A16R、pBE2A/ A16R和pBE2A-/A16R單克隆，接到5 mL LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃、220 r/min培養(yǎng)13 h，將已滅菌的濾紙片貼到綿羊血平板后，吸取5 μL菌液滴到濾紙片中間待菌液晾干后放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察是否有溶血環(huán)及溶血環(huán)大小。

1.2.2.3 神經(jīng)鞘磷脂酶活性觀察 在平板上挑取蠟樣芽胞桿菌CMCC63301、炭疽芽胞桿菌中A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單克隆，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃、220 r/min培養(yǎng)菌株13 h，各吸取5 μL菌液滴加到配制好的卵磷脂瓊脂培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基+50%葡萄糖水溶液+50%卵黃鹽水懸液)中待菌液晾干后放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察是否有乳白色神經(jīng)鞘磷脂酶消化環(huán)及消化環(huán)大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 PlcR在炭疽芽胞桿菌的表達(dá)

2.1.1 重組表達(dá)菌株構(gòu)建

表達(dá)質(zhì)粒pBE2A和測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pBE2A-電擊轉(zhuǎn)化DH5a，用引物pBE2_F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆提取質(zhì)粒后電轉(zhuǎn)入SCS110去甲基化，用相同引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆提取質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)A16R，用相同引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pBE2A-導(dǎo)入DH5a、SCS110和炭疽芽胞桿菌中A16R中都擴(kuò)增出特異的條帶，證明重組表達(dá)載體pBE2A-已成功轉(zhuǎn)入炭疽芽胞桿菌中A16R中。

2.1.2 PlcR蛋白的表達(dá)、純化及抗PlcR多克隆抗體制備

將基因插入到表達(dá)載體pET32a中，構(gòu)建成重組載體pET32a-，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a和BL21后，用引物pET_F/R進(jìn)行菌落PCR鑒定，都擴(kuò)增出特異明亮的條帶，表明表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入到宿主菌DH5a和BL21中。

PlcR在pET32a中表達(dá)，融合蛋白大小為51.5 kDa，pET32a-/BL21誘導(dǎo)表達(dá)，用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行蛋白印跡，結(jié)果顯示蛋白條帶大小相符，說明PlcR在BL21成功表達(dá)(圖1)。

圖1 重組表達(dá)載體pET32a-plcR的構(gòu)建及PlcR蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

2.1.3 Western blot確認(rèn)PlcR在炭疽芽胞桿菌中表達(dá)

挑取pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單菌落，LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)13 h后，取菌體1 mL進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖2A)，并使用抗PlcR多克隆抗體檢測(cè)PlcR是否在炭疽芽胞桿菌中A16R中表達(dá)。結(jié)果顯示，pBE2A-/A16R所在的泳道有一條明顯的雜交條帶，與PlcR大小相符(33.5 kDa)，因而確定PlcR在炭疽芽胞桿菌中A16R中得到表達(dá)(圖2B)。

圖2 PlcR在炭疽芽胞桿菌中A16R中表達(dá)

2.2 表型分析

2.2.1 生長(zhǎng)曲線

從0時(shí)開始每隔1 h測(cè)600值最后繪制生長(zhǎng)曲線圖(圖3)。在13 h時(shí)炭疽芽胞桿菌中A16R進(jìn)入對(duì)數(shù)末期，并且A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/ A16R 3株菌的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)基本相同，差異不太明顯。

圖3 生長(zhǎng)曲線

2.2.2 溶血驗(yàn)證

用蠟樣芽胞桿菌CMCC63301做陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)選A16R做陰性對(duì)照，檢測(cè)PlcR蛋白表達(dá)對(duì)炭疽芽胞桿菌中A16R溶血能力的影響。結(jié)果顯示：37℃培養(yǎng)過夜后，蠟樣芽胞桿菌CMCC63301菌苔周圍形成明顯的溶血環(huán)，A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R均沒有明顯溶血環(huán)形成。這表明導(dǎo)入外源基因后A16R的溶血活性沒有恢復(fù)(圖4A)。

圖4 重組炭疽芽胞桿菌中溶血酶活性和神經(jīng)鞘磷脂酶活性檢測(cè)

2.2.3 神經(jīng)鞘磷脂酶活性驗(yàn)證

用蠟樣芽胞桿菌CMCC63301做陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)選A16R做陰性對(duì)照，檢測(cè)PlcR蛋白表達(dá)對(duì)炭疽芽胞桿菌中A16R神經(jīng)鞘磷脂酶活性的影響，結(jié)果顯示：37℃培養(yǎng)過夜后，蠟樣芽胞桿菌CMCC63301菌苔周圍形成很大的神經(jīng)鞘磷脂酶消化環(huán)，A16R、pBE2A/A16R沒有明顯的神經(jīng)鞘磷脂酶消化環(huán)形成，pBE2A-/A16R菌落周圍有明顯的神經(jīng)鞘磷脂酶消化環(huán)形成，但沒有CMCC63301強(qiáng)。這表明導(dǎo)入外源基因后A16R的神經(jīng)鞘磷脂酶活性得到恢復(fù)(圖4B)。

3 討 論

在近期對(duì)炭疽芽胞桿菌PlcR研究報(bào)道中，實(shí)驗(yàn)證明導(dǎo)入外源基因能夠使炭疽芽胞桿菌中的溶血酶及神經(jīng)鞘磷脂酶的活性得到恢復(fù)[5]。而在本研究中，在導(dǎo)入外源基因后重組菌株pBE2A/ A16R恢復(fù)了神經(jīng)鞘磷脂酶活性，而溶血活性沒有恢復(fù)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果并不完全一致。我們猜測(cè)基因在炭疽芽胞桿菌中可能具有多種功能，PlcR蛋白單獨(dú)就能夠激活神經(jīng)鞘磷脂酶活性，而受基因調(diào)控的溶血素基因的激活可能需要與其他基因的共同作用。有研究稱受基因調(diào)控的毒素基因的表達(dá)還需要一個(gè)小肽PapR的作用，即PlcR的活性依賴于PapR[7]。位于基因下游70 bp，編碼一條48個(gè)氨基酸的多肽[8,9]，其功能是細(xì)胞與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，基因的突變會(huì)影響基因的表達(dá)，導(dǎo)致溶血素的表達(dá)量大量減少[10]，因此，我們推測(cè)溶血酶的活性的激活可能需要PlcR與PapR共同作用，但PapR對(duì)神經(jīng)鞘磷脂酶會(huì)起到什么樣的作用，仍是未知，這需要我們做更進(jìn)一步的研究。

PlcR不僅能調(diào)控其他蛋白其自身的表達(dá)也受自身所調(diào)控，且N端較為保守，屬于DNA結(jié)合區(qū)域，受PlcR調(diào)控基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在高度保守的回文序列TATGNAN4TNCATA，有報(bào)道推測(cè)它可能構(gòu)成了PlcR的識(shí)別位點(diǎn)即PlcRbox[2,7]。眾所周知，炭疽芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌在遺傳學(xué)上有很高的相似性[11]，而且對(duì)基因的進(jìn)化分析表明，蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌中的基因起源于共同的祖先[12]，那么在炭疽芽胞桿菌中發(fā)生的無(wú)義突變是在進(jìn)化過程中自身選擇的原因造成的還是另有他因，尚不明確。本實(shí)驗(yàn)探究了外源基因?qū)μ烤已堪麠U菌的功能影響，另一方面，將炭疽芽胞桿菌中突變的基因重新突變回正?；?，進(jìn)而研究其對(duì)炭疽芽胞桿菌中功能的影響同樣是我們值得考慮的。

因此，我們將構(gòu)建PlcRpapR融合蛋白及恢復(fù)炭疽芽胞桿菌中突變的基因的功能，來(lái)進(jìn)一步研究PlcR在A16R中的功能。

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(責(zé)任編委: 劉鋼)

The function of PlcR invaccine strain A16R

Xiaolin Jia1,2, Dongshu Wang2, Zhiqi Gao2, Erling Feng2, Jiping Zheng1,3, Hengliang Wang2, Guiying Guo1, Xiankai Liu2

,andare members of thegroup. They share high genetic similarity. Whereas(Phospholipase C regulator) usually encodes a functional pleiotropic activator protein inandisolates, a characteristic nonsense mutation is found in allstrains investigated, making the gene dysfunctional. To study the function of PlcR in, we used theCMCC63301genome as a template and constructed a recombinant expression plasmid pBE2A-, and introduced it intothevaccine strain A16R, and then analyzed the activity of the hemolysin and sphingomyelinase. The results showed that transformation ofwith plasmid pBE2A-carrying the nativegene active the expression of sphingomyelinase gene, but did not activate expression of hemolysin genes ofA16R.

;;; sphingomyelinase; hemolysin

2015-01-19;

2015-03-12

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：313043)和海南大學(xué)青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：qnjj1229)資助

賈曉琳，碩士研究生，專業(yè)方向：微生物遺傳學(xué)。E-mail: leibaihe.2008@163.com；王東澍，博士研究生，專業(yè)方向：微生物學(xué)。E-mail: wangdongshu@foxmail.com賈曉琳和王東澍為并列第一作者。

郭桂英，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：微生物學(xué)。E-mail: 815827434@qq.com；劉先凱，博士，副研究員，研究方向：病原微生物功能基因組學(xué)。E-mail: liuxk007@163.com

10.16288/j.yczz.15-040

2015-3-26 10:08:03

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150326.1008.001.html