申聰聰，陽明輝

（中南大學化學化工學院，湖南長沙410083）

蛋白激酶活性及抑制性檢測研究進展

申聰聰，陽明輝*

（中南大學化學化工學院，湖南長沙410083）

蛋白激酶催化蛋白磷酸化是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)大多數(shù)蛋白的功能，在眾多生理過程中發(fā)揮著至關重要的作用。磷酸化過程的異常以及激酶的過度表達往往與許多疾病密切相關，如癌癥、糖尿病和老年癡呆癥。因而，測定蛋白激酶的活性及篩選蛋白激酶抑制劑對基礎生物醫(yī)學研究和酶靶藥物的開發(fā)是非常重要的。近年來，研究工作者們采用電化學法、比色法以及熒光檢測法等方法研究了對蛋白激酶活性及抑制性的檢測。該文回顧了蛋白激酶活性測定及抑制性檢測的研究進展，主要關注了熒光檢測法的應用，并對其未來的發(fā)展進行展望。

蛋白激酶；磷酸化；抑制劑篩選；熒光分析

0 引言

蛋白激酶（PKA）催化蛋白磷酸化是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)大多數(shù)蛋白的功能。蛋白的磷酸化修飾與眾多生理過程緊密相關，如細胞間信號傳導、代謝調(diào)控、DNA損傷修復、基因轉(zhuǎn)錄和細胞凋亡等[1-4]。蛋白激酶是一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，通常是將三磷酸腺苷(ATP)上的γ-磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白特定的酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)和絲氨酸(Ser)殘基上。蛋白激酶是酶家族的重要成員，隨著人類基因測序工程的完成，已鑒定有518種蛋白激酶，占整個人類基因編碼蛋白的1.7%[5]。活性正常的蛋白激酶體系是細胞信號傳導運作的核心，但當其活性異常或者過度表達時就會引起某些蛋白磷酸化過程的異常。人類許多疾病就和蛋白磷酸化異常密切相關，如癌癥[6]、糖尿病[7]及老年癡呆[8]等。由于蛋白激酶調(diào)控著每個組織、每個器官、甚至每個細胞的生死，從而已成為治療這些復雜疾病的重要藥物靶點。因此，測定蛋白激酶的活性及篩選蛋白激酶抑制劑在生物醫(yī)學診斷以及酶靶藥物開發(fā)等領域激起了人們的興趣。

傳統(tǒng)測定蛋白激酶的方法有放射性同位素標記法[9-11]、電化學法[12]、表面等離子共振法[13]、質(zhì)譜法[14-15]和免疫法[16]等，這些檢測手段和方法在一定程度上促進了對蛋白激酶活性研究，然而各自又具有一定的局限性。放射性元素標記ATP技術，檢測方法直接，靈敏度高，但存在放射性污染，不能進行組織標記；免疫法對磷酸化識別抗體的要求較高，專一性不強，費用高。因此，開發(fā)快速、簡便、經(jīng)濟、靈敏度高且無需標記的蛋白激酶活性檢測及高通量篩選抑制劑方法是非常必要的。

近年來，多種納米材料因其具有粒徑較小、生物相容性好和表面積大等優(yōu)點而廣泛用于化學和生物分析檢測方法中。在眾多檢測方法中，熒光分析法具有信號讀出簡便、非放射性、操作簡單、容易實現(xiàn)均相分析和高通量分析等優(yōu)點。近年來，科學研究者逐漸地將兩者結合在一起來增強測定蛋白激酶活性的靈敏度和選擇性[17-19]。該文綜述了蛋白激酶活性測定及抑制劑篩選的研究進展，著重介紹了近年來基于熒光法測定蛋白激酶活性及抑制劑篩選的方法，并對其未來的發(fā)展進行了展望。

1 蛋白激酶活性的檢測的常用方法

由于蛋白磷酸化過程伴有ATP的參與和磷酸根基團的轉(zhuǎn)移，因此要實現(xiàn)蛋白激酶活性檢測，常用方法包括將底物多肽、ATP或其它與蛋白磷酸化相關的一些分子進行修飾或標記，或者在磷酸化過程中通過磷酸根基團的轉(zhuǎn)移引入電活性或熒光性物質(zhì)，還可以在磷酸化后引入能與磷酸根離子有特異性作用的基團。該文主要從電化學法、比色法、共振光散射法、表面等離子體共振(SPR)法和熒光分析法幾個方面來介紹蛋白激酶活性以及抑制性測定最新研究進展。

圖1 基于Zr4+和DNA-AuNPs電化學測定蛋白激酶的原理圖Fig.1 Schematic of electrochemical detection of kinase activity using Zr4+and DNA-AuNPs

1.1 電化學法

電化學法由于具有儀器簡單、靈敏度高、可以實現(xiàn)原位檢測等優(yōu)點而廣泛用于生物分析檢測中。近年來許多文獻報道了利用電化學方法測定蛋白激酶活性及抑制性。Kraatz課題組提出了利用納米金(Au NP)作為探針，采用方波伏安法氧化還原氯化物檢測蛋白激酶的活性及抑制性[20]。姚守拙課題組開發(fā)了一種基于鋯陽離子 (Zr4+)介導的新型非標記電化學傳感器測定蛋白激酶活性的方法[21]。如圖1，將一端帶有半胱氨酸的多肽底物組裝在金電極表面，利用巰基乙醇進行封閉，以減少非特異性吸附。由于Zr4+能夠特異性地結合磷酸根，加入DNA修飾的Au NPs后，在Zr4+的存在下，帶負電荷的DNA-AuNPs就和蛋白磷酸化后的多肽通過Zr4+結合起來。再加入帶正電荷的電活性物質(zhì)六氨合釕離子([Ru(NH3)6]3+，RuHex)，通過電化學計時電量法(CC)測出電極表面RuHex的總電量，從而測定蛋白激酶的活性。在蛋白磷酸化的過程中加入抑制劑，通過蛋白激酶活性的抑制可以進行有效的蛋白激酶抑制劑的篩選。此電化學傳感器省略了蛋白修飾、ATP標記以及生物分子特異性識別過程，操作簡單，靈敏度高，給其它酶活性檢測提供了一種新的思路。接著為了更加簡化測定蛋白激酶活性的過程，姚守拙課題組又建立了一種石英晶體微天平電極法一步測定蛋白激酶活性，此法省略了蛋白磷酸化的過程，耗時短(僅僅只需10 min)[22]。

1.2 比色法

比色法檢測不需要昂貴復雜的儀器，可通過裸眼觀察顏色變化來判斷反應的進程。由于設計簡單、成本低、實用性強受到了科學研究者廣泛的關注并有望應用于實時診斷。Au NPs、金納米棒(Au NRs)和銀納米顆粒(Ag NPs)由于它們獨特的表面等離子體共振(SPR)特性(Au NP聚集顏色從紅色變?yōu)樗{色，Ag NP聚集從黃色變?yōu)榛疑?而大量用于比色分析法中?；诩{米顆粒的比色法生物檢測一般通過交聯(lián)聚集 (納米顆粒間特異性作用)和非交聯(lián)聚集(改變納米顆粒穩(wěn)定環(huán)境)兩種途徑來實現(xiàn)。首次報道利用交聯(lián)聚集比色法測定蛋白激酶活性和抑制性的是brust課題組[23]。如圖2A，將底物多肽固定在Au NP上，在ATP的γ磷酸基團上修飾生物素，進行蛋白磷酸化反應后，修飾有生物素的γ磷酸基團轉(zhuǎn)移到Au NP表面的多肽上。此時再將修飾有親和素 (avidin)的Au NP加入溶液中，生物素(biotin)與親和素的特異性結合使得Au NP迅速團聚，溶液由紅色變?yōu)樗{色。當加入蛋白激酶的抑制劑時，溶液顏色變色的程度就取決于抑制劑的濃度。這也意味著比色法不僅可以測定抑制劑的活性，也能夠在篩選高效抑制劑的過程中提供定量信息。盡管此法為測定蛋白激酶活性提供了新的思路，但是過程復雜、需要標記、耗時長，Katayama課題組就基于非交聯(lián)聚集開發(fā)了一種快速、簡單檢測蛋白激酶活性的方法[24]。如圖2B，檸檬酸鹽還原的Au NP表面帶負電荷，與帶正電荷且一端帶有半胱氨酸的多肽底物相互作用后會發(fā)生電荷中和而聚集。當多肽底物磷酸化后，磷酸根優(yōu)先與多肽上的正電荷中和而使Au NP穩(wěn)定，不易聚集?；诖爽F(xiàn)象Katayama課題組又利用金納米棒(AuNRs)縱向的SPR帶對溶液、底物、粒子間距的敏感性，建立了一種更高靈敏度的比色法生物傳感器。這種方法幾乎可以高選擇、高靈敏地篩選所有的蛋白激酶[25]。

圖2 比色法測定蛋白激酶原理圖(A)基于生物素和親和素特異性結合交聯(lián)聚集AuNP測定蛋白激酶[23](B)基于縮氨酸吸附非交聯(lián)聚集AuNP測定蛋白激酶活性[24]Fig.2 Schematic of colorimetric kinase assays.(A)Kinase assay based on phosphorylation-induced crosslinking AuNP aggregation via biotin-avidin interaction[23].(B)Colorimetric assay of kinase activity based on noncrosslinking AuNP aggregation induced by peptide adsorption[24]

圖3 基于Biotin-ATP用RLS法測定蛋白激酶活性示意圖Fig.3 Schematic of RLS based on biotin-ATP detection of protein kinase activity

1.3 共振光散射法

當入射光的能量與一個震蕩偶極子的能量相似時，就會發(fā)生共振光散射(RLS)，且兩個或更多偶極子強烈耦合共振光散射會劇烈增強，信號也明顯地放大。利用該微列陣技術能夠高通量地進行蛋白激酶的活性分析，也可以并列多組高效篩選抑制劑。王和他的課題組利用共振光散射法提出了一種新穎、靈敏的測定蛋白激酶活性方法[26]。如圖3，先用生物素修飾ATP，再把固定在基底上的底物多肽在蛋白激酶PKA和生物素-ATP存在下發(fā)生蛋白磷酸化，那么蛋白磷酸化位點就引入了生物素。然后將親和素修飾的AuNPs能通過生物素和親和素的相互作用特異性結合在磷酸化的多肽上。隨后通過銀染反應，增大AuNPs的粒徑，從而實現(xiàn)了RLS信號的放大。該方法具有極高的靈敏度，也可以有效地測定實際樣品，比如細胞和組織提取物等中的PKA，并有望對抑制劑進行高通量的篩選，這對新藥的開發(fā)意義重大。

1.4 表面等離子體共振法

SPR是發(fā)生在金屬和電介質(zhì)界面上的光學傳感技術，通過探測發(fā)生在傳感芯片表面折射率以及質(zhì)量的變化來研究發(fā)生在芯片表面的相互作用，可實時檢測生物分子間結合與解離的動態(tài)過程，具有靈敏、快速、免標記、耗樣量少和靈敏度高等優(yōu)點。同時使用羧甲基化葡聚糖芯片(Dextran)、親和素芯片 (SA)和氨基三乙酸芯片(NTA)等在檢測待測物的過程中能大大地降低非特異性吸附，使其成為一種研究分子間相互作用的理想技術。Yoshiki Katayama課題組基于此開發(fā)了一種快速、簡便測定蛋白激酶活性的方法[27]。如圖4，在金膜表面固定一端帶有半胱氨酸的多肽底物，蛋白磷酸化后，加入鋅(Ⅱ)化合物(生物素化的Zn2L3+)，最后加入鏈酶親和素(SA)進一步放大信號。還可以利用SPR成像技術同時檢測多個芯片上的反應，來分析固定在芯片上的多肽探針，此法常用來評估芯片表面蛋白磷酸化的程度，對測定蛋白激酶活性及抑制劑篩選非常有效。

圖4 基于磷酸根捕獲分子用SPR法測定蛋白激酶活性示意圖Fig.4 Schematic of SPR based on phosphate capture molecule detection of protein kinase activity

1.5 熒光法

在過去的十幾年間，熒光分析法由于它靈敏度高、操作簡單、容易實現(xiàn)均相分析、樣品用量少等優(yōu)點而廣泛用于生物分析檢測中。為了實現(xiàn)更加靈敏、簡便的檢測，近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一系列熒光檢測法。接下來就主要從聚集猝滅熒光法[28-29]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)[30-32]、熒光偏振法(FP)[33]、熒光成像法[34]及免蛋白磷酸化熒光法[35]介紹基于熒光法測定蛋白激酶活性及抑制劑篩選。

1.5.1 聚集猝滅熒光法

納米材料的性質(zhì)隨其尺寸、形貌、聚集態(tài)的不同表現(xiàn)各異，而且聚集態(tài)與分散態(tài)的納米顆粒的熒光強度、拉曼信號及紫外吸收等性質(zhì)也不同，比如量子點(QDs)在聚集狀態(tài)下會顯著地猝滅熒光?；诖诵再|(zhì)，聶舟課題組設計了一種基于CdTe量子點自聚集免標記熒光法測定細胞裂解液中PKA的活性[28]。如圖5，多肽底物帶正電荷，加入表面富含負電荷的CdTe QDs溶液中，帶正電的多肽包裹住CdTe QDs促使其發(fā)生自聚集，熒光強度降低。然而蛋白磷酸化后的多肽引入了帶負電的磷酸根，中和了多肽上的正電荷，再加入CdTe QDs，此時避免了CdTe QDs的自聚集，熒光強度明顯增強。該實驗現(xiàn)象明顯，甚至裸眼就可以觀察到，即將比色法與熒光法相結合，進一步提高了靈敏度。而且利用聚集猝滅熒光法成功并高效地篩選出了人血清中4種不同的蛋白激酶抑制劑[28]。

圖5 基于CdTe QDs自聚集熒光法測定蛋白激酶活性示意圖Fig.5 Schematic of Fluorescence based on CdTe QDs self-aggressive detection of protein kinase activity

1.5.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)

目前，在熒光法測定中FRET是應用較多的方法之一，根據(jù)實驗設計特定的熒光探針，通過控制供體和受體的排列方式、距離等促使FRET的發(fā)生。早期使用編碼熒光蛋白測定蛋白激酶活性，隨著熒光新材料的出現(xiàn)，QDs、金屬納米粒子、有機染料及熒光共軛聚合物等也作為新型熒光探針用于蛋白激酶活性測定和抑制劑篩選?；诖死钫秸n題組開發(fā)了一種基于熒光共軛聚合物及金屬離子介導的熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法實現(xiàn)高靈敏檢測蛋白激酶活性[30]。如圖6，金屬鋯離子(Zr4+)與熒光共軛聚合物(PFPaa)，通過配位作用形成的配合物作為熒光探針。熒光標記的底物多肽磷酸化后，在溶液中利用Zr4+與磷酸化位點的特異性識別將PFPaa與標記在底物上的熒光基團拉近，產(chǎn)生強烈的FRET，并對熒光信號進行放大，由此建立了一種簡單、均相、通用型分析方法，適合于各類蛋白激酶活性分析，并可應用于蛋白激酶抑制劑的高通量篩選。此方法對于細胞信號傳導研究、疾病診斷及以蛋白激酶為靶標的靶向藥物篩選都具有較好的應用前景。但是FRET的熒光探針制備比較復雜，還需進一步創(chuàng)新開發(fā)出更加簡便的熒光探針制備方法。

圖6 熒光共振能量轉(zhuǎn)移法測定蛋白激酶活性示意圖Fig.6 Schematic of FRET detection of protein kinase activity

1.5.3 熒光偏振法

熒光偏振法(FP)通過熒光偏振程度的變化來進行分析檢測，操作簡單，可在均相溶液中進行。IMAP親和溶液 (含有表面固定三價金屬離子的納米顆粒)是一項專利技術，且蛋白磷酸化提供與金屬離子特異性結合的位點?；诖耍琒portsman課題組設計了一種均相、免標記的蛋白激酶活性法[33]。如圖7，熒光標記的底物表現(xiàn)出低的熒光偏振，磷酸化之后，加入IMAP親和溶液，由于磷酸根位點與納米粒子的結合使得熒光偏振的程度大大增強，故能夠定量、快速地測定蛋白激酶的活性也可用于高通量的篩選蛋白激酶抑制劑。但由于在測定實際樣品時，偏振信號對溶液中的組分很敏感，許多內(nèi)源性的細胞成分會結合到熒光修飾的肽底物上，可能出現(xiàn)假陽性，使得熒光偏振法應用受到限制。

圖7 熒光偏振法測定蛋白激酶活性示意圖Fig.7 Schematic of Fluorescence Polarization detection of protein kinase activity

1.5.4 熒光成像

隨著熒光標記技術和光學成像技術的發(fā)展，熒光成像由于標記能力強、信號強度大、成像速度快、實驗成本低、可實現(xiàn)活體器官成像等優(yōu)點吸引了大量的科研工作者的關注。之前報道的蛋白激酶活性測定方法往往會因為非特異性吸附而影響檢測的靈敏度，為了減少非特異性吸附的影響，簡便快捷的磁分離技術走進了人們的視野，TiO2與磷酸化的位點有特異性吸附作用，并具有很好的選擇性富集能力[36]。因此李正平課題組設計了一種基于功能化磁性微球的蛋白激酶活性熒光分析法[34]。如圖8，制備TiO2修飾的Fe3O4/SiO2磁性微球，熒光標記的肽底物被蛋白激酶磷酸化之后，用磁性微球選擇性富集分離磷酸化肽，直接對富集的多肽進行熒光成像，或者將富集的多肽用0.5%的氨水洗脫下來，測上清液的熒光，最低檢測限可以達到0.0001 U/μL。該方法實現(xiàn)了對蛋白激酶活性的高靈敏、快速檢測，并可以對其抑制劑進行篩選。此外，還成功用于多種蛋白激酶同時檢測，而且還可用于細胞中PKA活性的檢測。

1.5.5 免蛋白磷酸化熒光法

據(jù)文獻報道，大多數(shù)有關于蛋白激酶活性測定都包含了蛋白磷酸化過程，即將ATP上的γ磷酸基團轉(zhuǎn)移到多肽底物上，酶促反應需要耗時較長。為了簡化實驗過程，本課題組開發(fā)了一種基于AgNCs免蛋白磷酸化熒光法測定蛋白激酶活性及抑制性[35]。如圖9所示，以富含胞嘧啶的單鏈DNA(dC12,CCCCCCCCCCCC)作為模板，NaBH4化學還原AgNO3合成水溶性好、熒光性質(zhì)穩(wěn)定的AgNCs，加入ATP后熒光強度明顯增加。如果讓ATP與PKA反應，催化ATP轉(zhuǎn)化為ADP，再加入AgNCs中則熒光強度只有部分增強。根據(jù)熒光增強程度能夠快速、有效地檢測出蛋白激酶的活性，檢測限可以達到0.5 mU/μL。同時，H-89在該方法中體現(xiàn)出優(yōu)良的抑制性，并且成功實現(xiàn)了HeLa細胞裂解液中PKA活性測定，這為高效篩選其它抑制劑和有關蛋白激酶靶藥提供了新的思路。這種“混合-檢測”的模式操作簡單、成本低、避免了傳統(tǒng)蛋白磷酸化過程，有望推廣到其他蛋白激酶活性測定和抑制劑篩選。

圖8 基于CdTe QDs自聚集熒光法測定蛋白激酶活性示意圖Fig.8 Schematic of Fluorescence based on CdTe QDs self-aggressive detection of protein kinase activity

圖9 基于AgNCs免磷酸化熒光法測定蛋白激酶活性示意圖Fig.9 Schematic of Fluorescence based on AgNCs free phosphorylation detection of protein kinase activity

2 結語

隨著人們對蛋白激酶在生物體內(nèi)重要性的深入了解，對其活性測定及抑制劑篩選方法也在不斷更新，該文分別從電化學法、比色法、共振光散射法、表面等離子體共振法和熒光檢測法概括了近年來測定蛋白激酶活性及抑制劑篩選的常規(guī)方法。同時，由于熒光分析法具有信號讀出簡便、非放射性、操作簡單、容易實現(xiàn)均相分析、樣品用量少等優(yōu)點，該文著重從機理方面闡述了熒光分析法在蛋白激酶活性檢測方面的應用。盡管現(xiàn)已開發(fā)出許多比較簡便、快捷、靈敏度高的檢測方法，在蛋白激酶活性測定及抑制劑篩選方面也取得了突破性進展，但仍有很多問題亟待解決。第一，大多數(shù)的蛋白激酶檢測方法可以測定細胞裂解液中蛋白激酶的活性，但很少可以直接在活細胞中進行檢測。第二，由于蛋白激酶是在細胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此實現(xiàn)單細胞檢測對活體細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)的研究至關重要。第三，開發(fā)新型的探針材料，使其能夠在近紅外區(qū)域檢測，這樣有助于實現(xiàn)活體成像。此外，還有蛋白激酶靶藥的開發(fā)等還需進一步研究和探索。

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Recent progress in monitoring the activity and inhibitor of protein kinase activity

Shen Cong-cong,Yang Ming-hui*(College of Chemistry and Chemical Engineering,Central South University,Changsha 410083,China)

Protein phosphorylation catalyzed by protein kinase is one of the most important post-translational modifications,which adjusts the function of most proteins in cells and plays a significant regulatory role in many vital biological processes.Aberrant protein-phosphorylation states and kinase activity are closely associated with many human diseases,including cancer,diabetes and Alzheimer's disease.Thus,detecting the kinase activity and inhibitor screening are essential for fundamental biochemical research and kinase-targeted drug discovery. Recently,utilizing electrochemical,colorimetric and fluorescence techniques,researchers have developed different methods for monitoring the activity and inhibition of protein kinase.This article reviews the recent advances in the development of assays for protein kinase activity and inhibition,mainly focused assays based on fluorescence methods,and then offers perspectives on future developments.

protein kinase;phosphorylation;inhibitor screening;fluorescence assay

*通信聯(lián)系人,E-mail:yangminghui@csu.edu.cn;Tel:0731-88836356