卓丹如闕慧卿林綏章寧錢麗萍林善財(cái)

（1福州瑞來(lái)春堂生物科技有限公司，福建 福州 350001；2福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院）

HPLC考察燕窩加工前后唾液酸的含量變化

卓丹如1闕慧卿2林綏2章寧1錢麗萍2林善財(cái)1

（1福州瑞來(lái)春堂生物科技有限公司，福建 福州 350001；2福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院）

目的：建立燕窩中唾液酸的分離分析方法，考察燕窩原料（去除雜質(zhì)的干燥燕窩）、燉煮和加工成即食罐頭前后唾液酸的含量變化。方法：燕窩經(jīng)過(guò)磷酸水解，使唾液酸（即N-乙酰神經(jīng)氨酸）從唾液酸糖蛋白的結(jié)合狀態(tài)游離，用高效液相色譜法測(cè)定唾液酸的含量，應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》評(píng)價(jià)燕窩3種樣品的指紋圖譜，比較3種樣品的唾液酸含量變化。結(jié)果：燕窩原料的唾液酸含量為9.898%，經(jīng)燉煮或加工成即食罐頭后，唾液酸的含量分別為9.921%，9.913%，略高于原料。結(jié)論：燕窩加工成即食罐頭后其唾液酸含量與直接燉煮的接近，略高于燕窩原料，提示應(yīng)用現(xiàn)代工藝將燕窩加工成即食罐頭，唾液酸保存較好。

燕窩原料；燉煮燕窩；燕窩即食罐頭；唾液酸（N-乙酰神經(jīng)氨酸）；高效液相色譜法；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

燕窩為雨燕科（Apodidae）金絲燕屬（Collocalia）動(dòng)物金絲褐雨燕及多種同屬燕類用唾液或唾液與絨羽等混合凝結(jié)所筑成的巢窩。目前市場(chǎng)上銷售的燕窩以屋燕為主，主要規(guī)格為白燕盞或稱龍牙盞。燕窩始載于《本草逢原》，其性味甘、平，歸心、肺、腎經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥，益氣補(bǔ)中的功效，臨床可用于治療虛損，癆瘵，咳嗽痰喘，咯血，吐血，久痢，久瘧，噎膈反胃等癥，向以貴重藥材及美味佳肴而在民間廣為流傳使用，是宜藥宜膳的高級(jí)保健品[1]。燕窩的傳統(tǒng)使用方法基本是由使用者自行購(gòu)買后燉煮食用，使用不方便，因?yàn)闆](méi)有明確的操作規(guī)范，極大地影響了燕窩的生物利用。隨著中藥現(xiàn)代化技術(shù)在中藥與保健食品行業(yè)的滲透，將燕窩加工成即食罐頭，越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞。對(duì)燕窩罐頭中主要成分的保存和燕窩罐頭的質(zhì)量控制等提高燕窩的生物利用度的研究具有重要意義。

燕窩主要成分按含量高低依次為蛋白質(zhì)、碳水化合物、灰分和油脂[2]，其中糖蛋白為主要成分，唾液酸由糖蛋白唾液酸、氨基酸和糖構(gòu)成，胡國(guó)昌等[3]發(fā)現(xiàn)在 100℃、2 h的提取條件下，唾液酸的提取量約為總量的50%，唾液酸為糖蛋白的指標(biāo)成分。本文應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定燕窩加工前后唾液酸的含量，應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》評(píng)價(jià)樣品的指紋圖譜，初步考察燕窩加工前后的物質(zhì)基礎(chǔ)變化情況以及燕窩加工成即食罐頭后主要成分唾液酸的穩(wěn)定性，通過(guò)分析唾液酸的保存情況，為探討燕窩即食罐頭加工工藝的可行性提供參考依據(jù)。

1 儀器和試藥

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）；LC-20A紫外檢測(cè)器（日本島津）；數(shù)顯恒溫油浴鍋（金壇市江南儀器廠）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品（又名N-乙酰神經(jīng)氨酸，純度≥99%，購(gòu)自Sigma公司）；磷酸：分析純，水：新制超純水。燕窩原料（福州瑞來(lái)春堂生物科技有限公司提供，原產(chǎn)地為馬來(lái)西亞，批號(hào)：110701），燕窩即食罐頭（福州瑞來(lái)春堂生物科技有限公司提供,原料原產(chǎn)地為馬來(lái)西亞，批號(hào)：110701）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相為0.05%磷酸水溶液，流速為0.5 m L／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 192 nm，進(jìn)樣體積為20μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，加超純水制得0.48mg/m L的對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備[4]

燕窩原料供試液制備：將燕窩干燥至恒重，研磨粉碎成粗粉，精密稱取約0.05 g各 5份，分別置于100 m L具塞錐形瓶中，精密加入1.0%磷酸40 m L，稱定質(zhì)量，浸泡2.0 h，于沸水中水解20 m in，不時(shí)輕輕搖動(dòng)三角瓶，避免燕窩粉末掛壁。水解后迅速冷卻至室溫，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，制得供試品溶液5份。

燕窩即食罐頭樣品供試液制備：倒出罐頭燕窩干燥至恒重，研磨粉碎成粗粉，精密稱取約0.10 g粗粉（除去糖等輔料 0.049 8 g，約相當(dāng)于燕窩原料0.05 g），分別置于100 m L具塞錐形瓶中，精密加入1.0%磷酸40 m L，稱定質(zhì)量，浸泡2.0 h。于沸水中水解20 m in，不時(shí)輕輕搖動(dòng)三角瓶，避免燕窩粉末掛壁。水解后迅速冷卻至室溫，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，制得供試品溶液5份。

燕窩燉煮樣品供試液制備：將燕窩干燥至恒重，研磨粉碎成粗粉，精密稱取約0.05 g各5份，分別置于40 m L具塞錐形瓶中，精密加入超純水20 m L，稱定質(zhì)量，浸泡2.0 h，于沸水中燉煮15 m in，不時(shí)輕輕搖動(dòng)三角瓶，避免燕窩粉末掛壁。水解后迅速冷卻至室溫，補(bǔ)足減失質(zhì)量，準(zhǔn)確加入2.0%磷酸20 m L，稱定質(zhì)量，于沸水中水解20 m in，水解后迅速冷卻至室溫，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用 0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，制得供試品溶液5份。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水溶解制成4 mg/m L對(duì)照品儲(chǔ)備液。吸取上述儲(chǔ)備液，配制成0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 mg/m L等一系列濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：

Y=6×107X＋ 106（r=0.999 5）。

2.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取2.4項(xiàng)下的唾液酸對(duì)照品溶液（0.2 mg/m L），重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，其RSD為0.60%，顯示精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份樣品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h測(cè)定其峰面積，RSD為0.78%，表明該樣品溶液至少在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取燕窩粗粉6份，按燕窩原料的處理方法處理后進(jìn)樣，結(jié)果RSD為1.05%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 最低檢測(cè)限

取唾液酸對(duì)照品溶液適量，加水并逐步稀釋，用液相色譜儀記錄其峰高及信噪比，信噪比為3時(shí)，唾液酸的最低檢測(cè)限為0.01 mg/m L。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱取已測(cè)定含量的燕窩原料約50 mg（共 6份），分別精密加入唾液酸對(duì)照品儲(chǔ)備液10 m L，按燕窩原料的處理方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為96.82%（n=6），RSD為1.20%，符合含量測(cè)定的有關(guān)技術(shù)要求。

3 測(cè)定

精密吸取供試品溶液20μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算各樣品中唾液酸的含量，通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，比較3個(gè)樣品的指紋圖譜，計(jì)算相似度。色譜圖見圖1，結(jié)果見表1，相似度匹配圖譜見圖2，相似度見表2。

4 結(jié)果

從HPLC圖數(shù)據(jù)分析可知，燕窩經(jīng)燉煮或加工成即食罐頭后唾液酸的含量均大于9.9%，略高于燕窩原料。燕窩原料、燉煮燕窩和燕窩即食罐頭主成分出峰時(shí)間一致，其余幾個(gè)成分的出峰時(shí)間基本相同，HPLC圖差別不大。以燕窩原料指紋圖譜為參照譜圖，比較燉煮燕窩和燕窩即食罐頭與原料的異同，結(jié)果兩種加工后樣品的指紋圖譜與原料的指紋圖譜相似，相似度分別為0.990和0.989，與生成的參照指紋圖譜相似度為0.997。

圖1 各種燕窩與對(duì)照品HPLC圖

表1 燕窩的唾液酸含量

圖2 各種燕窩相似度指紋圖譜

表2 燕窩相似度

5 討論

燕窩傳統(tǒng)的食用方法是清洗過(guò)后用食用水浸泡2 h，再燉煮15 m in，本實(shí)驗(yàn)燉煮燕窩也采用了傳統(tǒng)燉煮方法，先用20 m L的超純水浸泡2 h，燉煮15min，補(bǔ)足減少的質(zhì)量后，加2%的磷酸20m L，配成燕窩中磷酸的濃度為1.0%。稱定質(zhì)量，于沸水中水解 20 m in，水解后迅速冷卻至室溫，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣。為了實(shí)驗(yàn)的平行，燕窩原料與燕窩即食罐頭干燥粗粉也相應(yīng)地浸泡2小時(shí)處理。燕窩即食罐頭先干燥至恒重，去除糖分等輔料的含量，得出100 g罐頭粗粉相當(dāng)于燕窩原料0.050 2 g，為了使實(shí)驗(yàn)具有可比性，確定稱取約100 mg罐頭粗粉（相當(dāng)于燕窩原料0.05 g）進(jìn)行試驗(yàn)，并比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本文利用HPLC對(duì)燕窩中的唾液酸含量進(jìn)行研究，參考文獻(xiàn)[6]的實(shí)驗(yàn)方法開展實(shí)驗(yàn)，測(cè)出唾液酸的含量在9%左右。將燕窩原料、經(jīng)燉煮品及加工成即食罐頭后唾液酸的含量進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)燕窩燉煮或加工成即食罐頭后唾液酸含量均高于燕窩原料直接測(cè)定，這可能是即食罐頭燕窩中糖分等高滲透性物質(zhì)的存在，促進(jìn)了燕窩的浸潤(rùn)，使唾液酸的溶出增加，含量略高于燕窩原料；燉煮燕窩的唾液酸含量高于原料，初步推斷是其在酸解前先用超純水燉煮了15分鐘，然后在溶液狀態(tài)下直接酸解，造成唾液酸充分溶出有關(guān)。

另外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示燉煮燕窩的唾液酸含量也略高于即食罐頭的唾液酸含量，也是由于燕窩即食罐頭是經(jīng)干燥后，扣除了糖分等輔料，干燥粗粉直接進(jìn)行浸泡酸解，然后測(cè)定唾液酸；而燉煮燕窩是經(jīng)燉煮，燕窩充分溶解后進(jìn)行浸泡酸解、測(cè)定。

燕窩燉煮和加工成即食罐頭后，樣品的指紋圖譜與燕窩原料的指紋圖譜極其相似，相似度分別為0.990和0.989，與生成的參照指紋圖譜相似度為0.997，提示兩種加工方法所得燕窩唾液酸指紋圖譜與燕窩粗制品及兩種加工品的指紋圖譜極其相似，加工后樣品的物質(zhì)基礎(chǔ)與原料相同。

燕窩傳統(tǒng)的食用方法是燉煮，燉煮燕窩可以很好地將其中的主要活性成分充分溶解出來(lái)，但燉煮食用對(duì)條件要求比較高，影響了行動(dòng)不便又急需增強(qiáng)免疫力的病人或老人的使用。應(yīng)用現(xiàn)代工藝在完好保存有效成分的情況下，將燕窩加工成即食罐頭，使攜帶方便，食用衛(wèi)生、口感好，是燕窩應(yīng)用的一大進(jìn)步。

[1] 胡雅妮，李峰，康廷國(guó).燕窩的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2003，28（11）：1003-1005.

[2] 陳念，劉鵬，王羚酈，等.燕窩生物活性及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2013，24（1）：143-146.

[3] 胡國(guó)昌，陳文銳，陳捷，等.燕窩及其制品的檢測(cè)方法[J].食品科學(xué)，1996，17（11）：47-50.

[4] 查圣華，姜水紅，王澤鳳，等.燕窩中白燕和血燕對(duì)比研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2011，25（2）：23-25.

[5] 姜水紅，查圣華，謝麗芬，等.燕窩中唾液酸含量測(cè)定方法的研究[J].中國(guó)生化藥物雜志，2009，30（5）：315-317.

[6] 華永有，楊艷，林美華.高效液相色譜法測(cè)定燕窩類保健品中唾液酸[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20（10）：2454-2456.

Study on the Content Changes of Sialic Acid in Bird’s Nest before and after Process by HPLC

Zhuo Danru1，Que Huiqing2，Lin Sui2，Zhang Ning1，Qian Liping2，Lin Shancai1（1 Fuzhou Ruilaichuntang Biological Technology Co.，Ltd.，F(xiàn)ujian Fuzhou 350001，China；2 Fujian Academy of Medical Sciences）

Objective：To establish the separation and analysis methods of sialic acid in bird’s nest and investigate the content changes of sialic acid in raw material （dry bird’s nest after removal of impurities）and processed products of bird’s nest.Methods：Sialic acid （that is N-acetyl neuraminic acid）in bird’s nest was free from the combination of sialic acid glycoprotein through phosphoric acid hydrolysis.The content of sialic acid was determined by HPLC，and the evaluation was made on the fingerprints of three samples using the Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM，and the content changes of sialic acid were compared.Results：Sialic acid content of bird’s nest raw material was 9.898%and which was 9.921%and 9.913%after process by stew ing and making into canned bird’s nest，which was a little higher than the bird’s nest raw material.Conclusion：The content of sialic acid of processed bird’s nest was slightly higher than that of bird’s nest raw materials.It is indicated that sialic acid content can be better preserved in the ready-to-eat canned bird’s nest produced w ith modern technology.

Bird’s Nest Raw Material；Stewed Bird’s Nest；Ready-To-Eat Canned Bird’s Nest；Saliva Acid（N-Acetyl Neuram inic Acid）；HPLC；Sim ilarity Evaluation of TCM Chromatographic Fingerprint

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.06.004

2015-01-31）

卓丹如，女，中藥師。主要從事中藥生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量管理工作。E-mail：532056077@qq.com

闕慧卿，女，中藥師。主要從事中藥與天然藥物成分的基礎(chǔ)研究工作。通訊作者E-mail：284978108@qq.com