彭麗莎, 袁天成, 李成瓊, 任雪松, 宋洪元, 司 軍

(西南大學(xué)園藝園林學(xué)院,重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715)

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十字花科作物根腫病生防菌研究進(jìn)展

彭麗莎, 袁天成, 李成瓊, 任雪松, 宋洪元, 司 軍*

(西南大學(xué)園藝園林學(xué)院,重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715)

根腫病嚴(yán)重危害油菜、白菜、甘藍(lán)、芥菜在內(nèi)的十字花科作物,因此研究一種有效的防治方法以降低該病害的發(fā)生是非常重要的。十字花科作物根腫病的病原菌—根腫菌能以休眠孢子的形式長(zhǎng)期存在于土壤中,一旦環(huán)境條件適宜即可萌發(fā)并迅速傳播。生防菌是從拮抗病原菌和誘導(dǎo)植物抗性的角度尋求防治病害的一種方法。作者首先對(duì)獲得十字花科作物根腫病生防菌的方法進(jìn)行闡述,重點(diǎn)總結(jié)了生防菌的來源和篩選的方法。為了更好地利用生防菌,又簡(jiǎn)要綜述了生防菌菌株的分類鑒定、發(fā)酵及拮抗物質(zhì)等方面的研究進(jìn)展,分析了施用生防菌的方式和時(shí)間。并指出了目前存在的問題及開發(fā)應(yīng)用的前景。

十字花科; 根腫病; 生防菌; 生物防效

十字花科作物根腫病是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)侵染引起的土傳病害[1-4],該病主要危害十字花科作物的根部。導(dǎo)致生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素[5-7]以及油菜素甾醇[8]的過度合成,從而引起主根和側(cè)根形成大量腫瘤,嚴(yán)重者整株枯死[9-10],造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。根腫菌專性寄生于十字花科作物,在土壤中可長(zhǎng)期存活,土壤一旦帶菌將不再適合栽植十字花科作物。因此,該病嚴(yán)重威脅著十字花科作物的可持續(xù)發(fā)展。

國(guó)內(nèi)外雖已進(jìn)行了大量針對(duì)該病原菌防治技術(shù)的研究,但目前仍無根治的方法。選用抗病品種是防治根腫病的有效方法之一,根據(jù)Williams[11]和Buczacki等[12]建立的歐洲鑒別寄主系統(tǒng)(European clubroot differential set,ECD)將根腫菌分為24個(gè)生理小種,因此要選育具有普遍抗性(即水平抗性)的品種難度非常大。輪作能在一定程度上緩解根腫病情[13-15],但增加了侵染十字花科雜草的機(jī)會(huì),仍然不能從根本上消滅根腫菌?；瘜W(xué)藥劑治理雖有一定效果,但同時(shí)也有諸多副作用,如農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、病原菌產(chǎn)生抗藥性、破壞土壤微生態(tài)環(huán)境等。隨著生活質(zhì)量的提高,人們對(duì)生態(tài)農(nóng)業(yè)的關(guān)注也日益加深,利用微生物防治病蟲害也越來越受到重視。Arie等[16]首次報(bào)道利用葡萄莖枯病菌(Phomaglomerata)JCM 9972可以抑制根腫菌休眠孢子的萌發(fā)。最新的研究表明生防菌不僅有抗菌活性,還可以誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生抗性[17-18]。生防菌為控制該病提供了一條新的有效途徑。近年來在利用微生物防治十字花科作物根腫病方面的研究取得了較大進(jìn)展。本文將對(duì)十字花科作物根腫病的微生物防治研究進(jìn)展做簡(jiǎn)要綜述,旨在為根腫病生防菌的開發(fā)利用提供參考。

1 生防菌的獲得

1.1 生防菌的來源

按材料來源,生防菌主要分為內(nèi)生生防菌和非內(nèi)生生防菌兩類。非內(nèi)生生防菌即從根際土壤中分離篩選所得的生防菌。土壤中微生物的多樣性為從土壤中分離生防菌提供了保證,取材時(shí)應(yīng)取發(fā)病地中未發(fā)病或病害等級(jí)較低植株的根際土壤,以提高從中篩選出生防菌的可能性。國(guó)內(nèi)外常有從富含微生物的土壤中篩選生防菌的報(bào)道。國(guó)外學(xué)者得到的25株對(duì)根腫菌有拮抗活性的木霉屬生防菌均是從種植商品品種無根腫病癥狀的土壤中分離的[19]。蘇婷等[20]從不同地區(qū)土壤中分離出細(xì)菌596株,其中解淀粉芽胞桿菌BS2004經(jīng)周青等[21]證實(shí)其兼具抑制番茄青枯病和蕓薹根腫菌的作用。王靖等[22]從白菜根際土壤中分離得到拮抗根腫菌的放線菌A316。

農(nóng)藥和化肥的大量使用降低了土壤中微生物的多樣性,給根際土壤生防菌的篩選帶來了一定困難。內(nèi)生菌因受到植物組織的保護(hù)而免受外界環(huán)境的影響,所處的生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定且能與病菌直接作用。因而從植物組織中篩選出生防菌的可能性更大,更易于發(fā)揮生防作用。內(nèi)生生防菌廣泛分布于植物組織中,與植物形成互惠共生關(guān)系[23-25],大量研究表明內(nèi)生菌是植物土傳病害防治的天然有效菌[26-27],具有一定研究?jī)r(jià)值和開發(fā)應(yīng)用前景。Narisawa等[28-29]以及Hashiba等[30]從白菜根系中分離出2株內(nèi)生生防菌Heteroconiumchaetospira和Phialocephalafortinii,分別接種該生防菌的白菜田間根腫病發(fā)病率可降低52%～97%。Hahm等[31]也從白菜組織中分離出黃桿菌屬內(nèi)生細(xì)菌FlavobacteriumhercynimEPB-C313,可以在一定程度上抑制根腫病的發(fā)生。生命力旺盛且抗病力強(qiáng)的植株體內(nèi)可能蘊(yùn)含著豐富的微生物資源,因此可以擴(kuò)大范圍甚至跨科采集生防菌原始材料,以篩選優(yōu)良的生防菌菌株。如王靖等[32]從雅安紅豆樹根部和銀杏樹根部分別成功分離出放線菌A10和真菌T1,具有較高生防潛力。

1.2 生防菌的分離純化和篩選

從材料中獲取的微生物需要進(jìn)一步分離純化,方法同常用的分離純化微生物的方法,多采用稀釋涂布法和平板畫線法。兩種方法都應(yīng)該在分別適合細(xì)菌、真菌、放線菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行。所不同的是用稀釋涂布法分離純化微生物時(shí),需要根據(jù)微生物數(shù)量的多少做預(yù)試驗(yàn)找到適當(dāng)?shù)南♂尡萚33]。

蕓薹根腫菌是一種專性活體寄生菌,不容易體外培養(yǎng)[34-35],因而也很難得到人工純培養(yǎng)的根腫菌來篩選根腫病生防菌。目前根腫病生防菌的篩選方法主要有活體鑒定法、休眠孢子萌發(fā)抑制率篩選法及病原指示菌篩選法等?；铙w鑒定法費(fèi)地費(fèi)時(shí)費(fèi)力,一般在復(fù)篩階段開始采用,以準(zhǔn)確確定初篩菌株的生物防效。休眠孢子萌發(fā)抑制率篩選法即通過檢測(cè)微生物對(duì)根腫菌休眠孢子萌發(fā)的抑制作用來篩選生防菌。該種方法也存在一定缺陷,并不是所有具生防潛力的微生物都可以抑制根腫菌休眠孢子的萌發(fā)。如J?schke等[36]在篩選擬南芥根腫病的生防菌時(shí)發(fā)現(xiàn)芳香頂孢霉(Acremoniumalternatum)孢子對(duì)根腫菌休眠孢子的萌發(fā)無抑制作用,卻能在一定程度上抑制根腫病的發(fā)生。孫良菲等[37]將病原指示菌篩選法和休眠孢子萌發(fā)抑制率篩選法結(jié)合使用篩選出2株生防菌株放線菌YN-6和真菌XP-F2對(duì)感病品種‘四季奶油小白菜’有生物防效。病原指示菌篩選法和休眠孢子萌發(fā)抑制率篩選法結(jié)合起來的具體做法是挑選能人工培養(yǎng)的病菌作為病原指示菌,先篩選出對(duì)幾種病菌有拮抗效果的菌株作為測(cè)定休眠孢子萌發(fā)抑制率的候選菌株。兩者結(jié)合使用既克服了前者目標(biāo)性不強(qiáng)的缺點(diǎn),又克服了后者由于根腫菌不能體外培養(yǎng)而難以篩選的不足。

2 菌株的分類鑒定

經(jīng)分離純化篩選得到的生防效果較好的生防菌需要確定其在進(jìn)化中的地位,以便后續(xù)工作的順利開展。以往的研究常依靠形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征進(jìn)行菌株分類鑒定。常規(guī)鑒定方法檢測(cè)指標(biāo)多、工作量大,且單純依靠常規(guī)方法難以達(dá)到準(zhǔn)確鑒定的目的。如果生防菌是真菌,因?yàn)榫?、菌絲體和孢子特別是大型真菌的子實(shí)體和孢子的形態(tài)特征容易觀察和比較,所以常規(guī)鑒定方法對(duì)于真菌的鑒定依然很重要。常規(guī)鑒定方法的局限性限制了菌株分類鑒定的發(fā)展,越來越多的分類單元鑒定需要結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)和自動(dòng)鑒定系統(tǒng)才能實(shí)現(xiàn)?；蛐蛄蟹治龇ê虰iolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)是目前國(guó)際上常用的分類鑒定方法[38]。rDNA-ITS序列分析法、18S rDNA和16S rDNA序列分析法是基因序列分析法中常用的3種分類鑒定方法。其中rDNA-ITS序列分析法是對(duì)核糖體RNA基因(即rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的多態(tài)性序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得ITS全序列信息,經(jīng)測(cè)序后與基因庫(kù)中的片段進(jìn)行對(duì)比分析,就可得知未知菌與基因庫(kù)中已知菌的相似度,從而完成對(duì)菌株分類單位的鑒定以明確真菌的分類地位。16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的基因。16S rRNA長(zhǎng)度在1 500 bp左右,所代表的信息量適中,是研究原核分類的理想材料。根據(jù)16S rDNA兩端的保守序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增16S rRNA基因的未知部分,再測(cè)序和已知細(xì)菌的序列對(duì)比分析確定病原細(xì)菌的分類地位。Lee等[39]運(yùn)用16S rDNA序列分析法把從韓國(guó)田間種植的白菜上分離得到的81株內(nèi)生放線菌劃分為8個(gè)不同的屬,其中最常見的是小雙孢菌屬(67%),其次是鏈霉菌屬(12%)和小單孢菌屬(11%)。并且通過室內(nèi)盆栽試驗(yàn),以細(xì)胞壁成分、形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育為依據(jù),將其中能有效抑制根腫病的3株生防菌確定為玫瑰小雙孢菌(A004和A011)和橄欖色鏈霉菌(A018)。范成明等[40-41]采用細(xì)菌通用引物P0和P6,于2007年在國(guó)內(nèi)首次將16S rDNA序列分析法用于根腫病生防菌的鑒定,經(jīng)比對(duì)并結(jié)合形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)生防菌XF-1屬枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。王靖等[22]采用PCR引物27F、1492R,將生防放線菌菌株A316鑒定為灰紅鏈霉菌,結(jié)合形態(tài)與培養(yǎng)特征、生理生化特性把菌株A10劃分至鏈霉菌灰褐類群。18S rDNA 序列分析法與16S rDNA 序列分析法類似,所不同的是,前者用于鑒定真菌。

然而基因序列分析法和Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)仍然有缺陷。基因序列分析法可以準(zhǔn)確地將菌株鑒定到屬,但使用的前提是基因庫(kù)中存在和擴(kuò)增序列同源的片段;并且這種方法不能將種間遺傳距離非常近的菌株的分類地位確定到種的水平。美國(guó)Biolog公司以碳源的利用情況為基礎(chǔ)研制開發(fā)的Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)可用于包括根腫病生防菌在內(nèi)的各種微生物的鑒定,然而檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)只能測(cè)定微生物的部分性狀,容易產(chǎn)生誤判[42],具有一定的局限性。因此,將借助于分子生物學(xué)等手段的新方法與常規(guī)方法結(jié)合使用以更加準(zhǔn)確地鑒定根腫病生防菌更為可取。

3 生防菌的發(fā)酵

獲得了優(yōu)良的生防菌菌株之后,建立合理的培養(yǎng)及發(fā)酵體系,擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵才能實(shí)現(xiàn)大面積的推廣應(yīng)用。對(duì)生防菌的發(fā)酵過程進(jìn)行合理優(yōu)化,可以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量并有效降低發(fā)酵成本,為其在生產(chǎn)中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。發(fā)酵過程包括菌株自身的性能、發(fā)酵培養(yǎng)基的組成以及合適的環(huán)境條件等。王靖[43]首先采用單因素分析方法確定最佳的培養(yǎng)基組成(含大豆粉、酵母膏、葡萄糖及蛋白胨等),再采用復(fù)合因素分析方法(正交設(shè)計(jì))確定最優(yōu)的培養(yǎng)條件組合(包括種子液種齡、接種量、初始pH、裝液量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速及發(fā)酵時(shí)間等),確定菌株A316和A10的較佳培養(yǎng)基組成及理想的發(fā)酵培養(yǎng)條件。除此之外,響應(yīng)面設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、模式識(shí)別法、二次正交旋轉(zhuǎn)組合法、遺傳算法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等[44]分析方法也可用于培養(yǎng)條件的優(yōu)化,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況合理選擇以上分析方法。另外,在生防菌株的生理代謝和合成調(diào)控機(jī)制未知的情況之下,可通過搖瓶培養(yǎng)先用Plackett-Burman法確定出重要因素,然后用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法或均勻設(shè)計(jì)法得到各重要因素的最佳水平[45],從而篩選適宜的培養(yǎng)體系。

4 拮抗物質(zhì)的分離與鑒定

微生物代謝物質(zhì)對(duì)土傳病害的防治作用也是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。曾有報(bào)道指出生防菌葡萄莖枯病菌JCM 9972對(duì)根腫病有一定防治作用,其控制根腫病發(fā)生的拮抗物質(zhì)是發(fā)酵液中的頂環(huán)氧菌素[16]。賈媛等[46]采用鹽酸和甲醇抽提法從枯草芽胞桿菌XF-1中分離出拮抗物質(zhì)而后用其處理根腫菌休眠孢子,9 d后發(fā)現(xiàn)休眠孢子萌發(fā)的相對(duì)抑制率在90%以上。Li等使用層析分離技術(shù)從枯草芽胞桿菌XF-1分離出一種抗菌肽芬薺素類型環(huán)肽(fengycin-type cyclopeptides)[47],并用它(250 mg/mL)處理根腫菌休眠孢子,24 h后幾乎觀察不到完整的休眠孢子細(xì)胞[48]。拮抗物質(zhì)可能存在于真菌的菌絲體和發(fā)酵液中,如存在于菌絲體中,則需要先用有機(jī)溶劑進(jìn)行浸取,使樣品從菌絲體中轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中。王靖[43]發(fā)現(xiàn)在生防放線菌A316的菌絲體和發(fā)酵液中均含有拮抗物質(zhì),采用80%的丙酮浸泡24 h后,離心去除菌絲體,真空旋轉(zhuǎn)蒸干,而后用10%甲醇溶解得到菌絲體浸泡液。將菌絲體浸泡液過濾后與發(fā)酵上清液合并置于正丁醇中萃取并經(jīng)過薄層層析、硅膠柱層析等過程,最終分離純化獲得抗根腫病活性成分。經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)化合物Ⅰ與通用型酚類抗氧劑2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)的匹配度高達(dá)97.84%;化合物Ⅱ與鄰苯二甲酸單乙基己基酯的匹配度為74.28%。除此之外,已報(bào)道對(duì)十字花科作物根腫病有拮抗作用的物質(zhì)還有糖類細(xì)菌素[49]、幾丁質(zhì)酶[50]等,這些活性物質(zhì)對(duì)根腫病均有不同程度的抑制作用。

5 生防菌的生物防效

在溫室條件下進(jìn)行試驗(yàn)得到的生防效果屬于溫室生物防效。相較于大田生物防效,溫室生物防效通常會(huì)高于大田生物防效。多是直接將篩選得到的生防菌施用于植株的根際,也有的是利用生防菌分泌的拮抗物質(zhì)。因?yàn)橛袑W(xué)者研究發(fā)現(xiàn)同一種生防菌的細(xì)胞抑制休眠孢子的萌發(fā)率高于培養(yǎng)液高于培養(yǎng)濾液[31],表明直接用生防菌的生防潛力高于拮抗物質(zhì)。在白菜移植前用F.hercynimEPB-C313培養(yǎng)液浸漬處理幼苗根系,對(duì)根腫病的抑制率可達(dá)100%[31]。內(nèi)生生防菌可能需要在植株體內(nèi)定殖以擴(kuò)大生物量才能發(fā)揮拮抗作用,外國(guó)研究者通過光學(xué)和電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)H.chaetospira在接種3周后才能進(jìn)入根部表皮細(xì)胞[51],所以施用內(nèi)生生防菌時(shí)應(yīng)特別注意施用的時(shí)間。Wang等[52]的研究表明,A316菌株對(duì)白菜根腫病的溫室生物防效和大田生物防效都高于陽(yáng)性對(duì)照—75%百菌清可濕性粉劑,且能使白菜的單產(chǎn)增加96.1%[22]。大田生物防效的處理是在栽植幼苗前用A316菌株的發(fā)酵液與上層15 cm 的土壤混勻,并在栽植10 d 和25 d 后各澆發(fā)酵液于根系一次[52]。王靖等[32]采用灌根法分別將生防菌A316、A10和T1的培養(yǎng)液澆油菜植株根部4次(播種前7 d、播種期、播種后10 d、 播種后25 d),研究結(jié)果顯示溫室生物防效依次為73.60%、70.94%、67.10%,大田生物防效分別是65.84%、59.59%、61.24%。將生防菌與適宜的有機(jī)肥混合,除了可以利用有機(jī)肥對(duì)土壤的緩沖作用以改善生防菌生存的環(huán)境條件,從而達(dá)到增強(qiáng)防效的目的;還能利用有機(jī)肥中本身含有的各種有益微生物的輔助功效,協(xié)同作用防治根腫病[53]。Lahlali等[54]的研究結(jié)果顯示加入枯草芽胞桿菌(B.subtilis) QST713自身產(chǎn)生的代謝物質(zhì)有利于生防菌的定殖,同時(shí)還能使它與其他微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)最小化,也可間接提高防效。另外,一些研究者混合2種及2種以上的生防菌用于土傳病害的防治。如Peng等[55]混合枯草芽胞桿菌和海洋真菌鏈孢黏帚菌(Gliocladiumcatenulatum)2種生防菌使根腫病發(fā)生的嚴(yán)重程度降低80%以上。盡管混合的生防菌之間可能存在拮抗作用而降低生防效果,但是這種混合菌劑與單獨(dú)使用一種相比,可能更易于生防菌的定殖。綜合衡量拮抗作用和定殖情況,混合菌劑更有可能提高生防效果。

6 存在的問題和前景展望

6.1 存在的問題

生防菌由于對(duì)環(huán)境安全無污染而受到廣泛重視。我國(guó)十字花科作物根腫病生防菌研究起步較晚,與發(fā)達(dá)國(guó)家相比還存在一定的差距,目前仍存在諸多問題制約著生防菌的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。研究的一般程序是先分離、純化、培養(yǎng),然后是初篩和復(fù)篩并鑒定菌株,最后是定殖狀況和發(fā)酵條件的研究。篩選、鑒定分別存在以下問題:其一,分離、純化和培養(yǎng)過程均是在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行,盡管嘗試采用多種人工培養(yǎng)基離體培養(yǎng),仍然難以對(duì)生防效果較好卻無法人工培養(yǎng)的微生物進(jìn)行篩選[56-57];其二,由于內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在植物組織內(nèi)部并與宿主植物協(xié)同進(jìn)化,當(dāng)在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)其形態(tài)特征必然發(fā)生一定的變化以適應(yīng)其內(nèi)生環(huán)境[58-59]。那么基于形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)鑒定方法就有可能無法正確反映內(nèi)生生防菌的分類地位。另外初篩完成后復(fù)篩過程和防效試驗(yàn)需要不斷地培養(yǎng)、繁殖和接種根腫菌,雖然此過程更加接近田間生長(zhǎng)模式,但同時(shí)也存在病害傳播及大面積蔓延的風(fēng)險(xiǎn)[60]。

多數(shù)生防菌在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有較好的防效,在田間應(yīng)用時(shí)卻不甚理想。究其原因一方面是生防菌(尤其是非內(nèi)生生防菌)在農(nóng)作物上難以定殖。生防菌不能很好地在土壤或植株中定殖便難以形成足夠數(shù)量的微生物群體,也就不能穩(wěn)定發(fā)揮其防效。過高的農(nóng)藥殘留可能也是導(dǎo)致微生物群體數(shù)量下降的原因之一。另一方面,目前的生物菌劑多是活菌,田間應(yīng)用時(shí)極易受溫濕度、pH等環(huán)境條件的制約,從而影響生防菌發(fā)揮對(duì)根腫病的拮抗作用。

土壤中存在各種微生物群落,不同的微生物之間存在復(fù)雜的相互作用。根腫病生防菌的引入,可能對(duì)土壤中其他微生物的群落結(jié)構(gòu)造成不同程度的改變,繼而打破固有的土壤微生態(tài)平衡。Roesti等[61]報(bào)道,接種PGPR假單胞菌和叢枝菌根真菌(AMF)對(duì)小麥根際土壤細(xì)菌群落有顯著影響。類似的結(jié)果還有,朱偉杰等[62]也發(fā)現(xiàn)生防菌對(duì)土壤微生物中細(xì)菌的生物量具有促進(jìn)作用。生防菌的使用在短時(shí)間內(nèi)可能對(duì)根腫菌有較好防效,但生防菌的加入同時(shí)也可能會(huì)影響土壤微生態(tài)平衡和降低生物多樣性[63],甚至導(dǎo)致新病害的出現(xiàn)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)的角度考慮,應(yīng)兼顧經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益,在有效防治根腫病的同時(shí)嚴(yán)格控制生防菌的引入量,以避免產(chǎn)生新的隱患。

6.2 前景展望

根腫病生防菌的開發(fā)利用,給根腫病的綜合防治提供了新的思路。如何使十字花科作物根腫病生防菌在生產(chǎn)上得到有效的推廣和應(yīng)用是目前生防菌研究的主攻方向。為了達(dá)到提高生防效果的目的,除了改變生防菌的施用方式和掌握施用時(shí)間外,還可以把篩選出的生防菌加以誘變處理。常見誘變的方式有紫外線誘變[64]、氯化鋰誘變[65]、N+注入誘變[66]、微波誘變[67]、硫酸二乙酯誘變[68]等,上述誘變方式不僅可單獨(dú)處理還可復(fù)合使用。還可以利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段,將生防菌中的抗病基因整合到十字花科作物體內(nèi)。Feng等[69]將潮霉素抗性基因(hph)整合到根腫菌的基因中得到含抗潮霉素活性的根腫菌,并將其接種到油菜上發(fā)現(xiàn)腫根可以形成。通過PCR和qPCR分析表明轉(zhuǎn)化的DNA仍然存在于根腫菌。這是首次報(bào)道遺傳轉(zhuǎn)化的根腫菌,將有利于根腫病植物病害系統(tǒng)多項(xiàng)領(lǐng)域的研究。這為生防菌和植物中的抗病基因整合到根腫菌體內(nèi)提供技術(shù)支持。在分子水平提高抗病性,從根本上解決根腫病的危害問題。這也是未來生防菌研究的熱點(diǎn)。

由于根腫菌是寄生于十字花科作物的專性活體寄生菌,很難直接得到純培養(yǎng)的單孢菌系。Kageyama和Asano[70]試驗(yàn)的結(jié)果表明采用單孢接種技術(shù)以及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)可以對(duì)根腫菌進(jìn)行離體培養(yǎng),但不能獲得大量的腫根,該方法的適用性尚待驗(yàn)證。探究根腫菌離體培養(yǎng)方法,建立科學(xué)實(shí)用的根腫菌離體培養(yǎng)體系,開發(fā)生防菌篩選新方法提高篩選效率仍然是當(dāng)前迫切需要解決的問題。

理想的目標(biāo)生防菌需具有高效、穩(wěn)定等特性,實(shí)現(xiàn)其功能的最大化,最好兼具增產(chǎn)等功效。結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù),加強(qiáng)對(duì)根腫病生防菌定殖、消長(zhǎng)規(guī)律等基礎(chǔ)理論問題的研究,注重生防菌的田間防效,發(fā)掘和利用生防菌的防治潛力,提高生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值,逐漸取代部分化學(xué)農(nóng)藥的使用,實(shí)現(xiàn)低成本、安全、無污染、增產(chǎn)增質(zhì)的目標(biāo),根腫病生物防治才有可能取得突破性進(jìn)展。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Research progresses in biocontrol bacteria of the clubroot disease of the Cruciferae

Peng Lisha, Yuan Tiancheng, Li Chengqiong, Ren Xuesong, Song Hongyuan, Si Jun

(College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University, Chongqing Key Laboratory of Horticulture, Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing 400715, China)

Clubroot is becoming a serious threat to cruciferous crops, includingBrassicanapus,B.pekinensis,B.oleracea,B.juncea. It is very important to develop an effective control method to reduce the occurrence of this disease.Plasmodiophorabrassicae, which causes clubroot disease in cruciferous crops, can form resting spores surviving for long periods in the soil. If the environmental conditions are suitable for the germination ofP.brassicaeresting spores, this disease spreads quickly. Biocontrol microorganisms suppress clubroot of cruciferous crops via antibiosis and induced host resistance. The present review focuses on research progresses in the methods of acquiring biocontrol microorganisms. We emphatically summarize the sources and screening methods of biocontrol microorganisms. In order to make better use of biocontrol microorganisms, advances in classification, fermentation and antagonistic substances of biocontrol microorganisms and an analysis of the methods and time for applying biocontrol microorganisms are reviewed. The problems to be solved and prospects for development and application were also discussed.

Cruciferae; clubroot disease; biocontrol microorganisms; biocontrol efficiency

2014-05-20

2014-07-04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD02B01)；重慶市農(nóng)作物良種創(chuàng)新工程(CSTC2012GG(80005))；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(XDJK2014C179，XDJK2014C181，XDJK2014A015)

S 476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.003

* 通信作者 E-mail：sijunxx@163.com