吳成勇+楊滿+林梅+蔡敏生+王錦華+溫雪珍

[摘要] 目的 研究鼠卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）改良技術(shù)在人類輔助生殖技術(shù)應(yīng)用中的價(jià)值。 方法 將小鼠分為兩組：采用固定人卵子的固定針組（C-ICSI組）和改良的喇叭型固定針組（N-ICSI組），觀察兩組ICSI操作后卵子存活數(shù)、卵裂情況。 結(jié)果 N-ICSI組卵子存活率為77.4%，明顯高于C-ICSI組的7.8%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=483.183，P < 0.01）;兩組正常受精率及異常受精率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。N-ICSI組卵裂數(shù)為97.3%，明顯高于C-ICSI組的80.0%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.399，P < 0.01），桑葚胚、囊胚和孵化的胚胎比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 改良的小鼠ICSI技術(shù)，可以明顯提高操作時(shí)卵子的存活率，這將為人類實(shí)驗(yàn)室ICSI技術(shù)的質(zhì)量控制和研究提供保障，同時(shí)，該項(xiàng)研究成果可以分析人精子激活卵母細(xì)胞的能力和人精子的核型，因此有重要的研究價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 昆明小鼠;卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射;存活率

[中圖分類號(hào)] R711.6 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2015）01（a）-0008-04

The value of improved ICSI technology in the mouse in the human assisted reproductive technology

WU Chengyong ? YANG Man ? LIN Mei ? CAI Minsheng ? WANG Jinhua ? WEN Xuezhen

Reproductive center， the People's Hospital of Meizhou City， Guangdong Province， Meizhou ? 514031， China

[Abstract] Objective To study the value of improved technology ICSI in the mouse in the human assisted reproductive technology. Methods The ICSI operation were divided into two groups： ICSI operation with holding pipette for holding human ova （C-ICSI group） and with improved holding pipette （N-ICSI group）， ova survival and cleavage in the two groups were observed after ICSI operation. Results The rate of ova survival in the N-ICSI group was 77.4%， significantly higher than that in the C-ICSI group （7.8%）， there was statistically significant （χ2=483.183， P < 0.01）. About the normal fertilization rate and abnormal fertilization rate， there was no significant difference （P > 0.05）. The number of cleavage in the N-ICSI group was 97.3%， significantly higher than that in the C-ICSI group （80.0%）， there was statistically significant difference （χ2=18.399， P < 0.01）. There was no significant difference about the morula， blastocyst and hatching embryo （P > 0.05）. Conclusion The modified ICSI technique in the mouse can significantly improve the survival rate of ova， which will provide the guarantee for quality control and research of human laboratory of ICSI technology， at the same time， the research can analyze the ability of human sperm for oocyte activation and karyotype analysis of human sperm， therefore there is an important research value.

[Key words] Kunming mice; Intracytoplasmic sperm injection; Survival rate

近年來，不孕不育的患者呈現(xiàn)出逐年增加趨勢，據(jù)報(bào)道，我國的不孕發(fā)生率約為12.5%[1]。部分患者通過治療雖能懷孕，但仍有患者由于輸卵管堵塞、嚴(yán)重少弱畸精癥甚至無精子癥等需要輔助生殖技術(shù)治療，如體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）、卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）等。實(shí)驗(yàn)室胚胎培養(yǎng)是直接關(guān)系著輔助生殖技術(shù)成功與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，做好實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制，為配子發(fā)育與胚胎培養(yǎng)提供良好的環(huán)境顯得至關(guān)重要[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，昆明小鼠IVF-ET技術(shù)對實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境監(jiān)測、耗材質(zhì)控方面提供了重要的價(jià)值，為人類IVF-ET技術(shù)的不斷完善和臨床妊娠率的不斷提高作出了巨大貢獻(xiàn)[3]。但是尚無關(guān)于小鼠ICSI在實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理和價(jià)值研究的報(bào)道?？紤]由于人類卵子和小鼠卵子的差異，小鼠卵子通過人類ICSI操作系統(tǒng)難以順利完成，單精子注射時(shí)卵子極易崩解[4-5]。因此，本研究在不改變實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，ICSI操作系統(tǒng)的前提下，對細(xì)節(jié)部分進(jìn)行改良，以期利用改良的小鼠ICSI技術(shù)能為人類ICSI技術(shù)的發(fā)展和實(shí)驗(yàn)室ICSI技術(shù)的質(zhì)量控制提供價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明小鼠均購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其中4～6周齡雌鼠50只，8～12周齡雄鼠20只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

孕馬血清促性腺激素（PMSG）、注射用人絨毛膜促性腺激素（HCG）均購自寧波市三生藥業(yè)有限公司。取卵-胚胎處理液（G-MOPS）、洗精受精液（IVF）、卵裂胚培養(yǎng)液（G-1）、囊胚培養(yǎng)液（G-2）均購自瑞典vitrolife公司。培養(yǎng)皿、吸管購自美國Falcon公司。設(shè)備：丹麥IVF tech工作站、奧林巴斯（型號(hào)：LSZX10）及尼康（型號(hào)：SMZ1000）解剖顯微鏡、奧林巴斯導(dǎo)致顯微鏡（型號(hào)IX71）、Apendorf顯微操作系統(tǒng)、ASTEC三氣培養(yǎng)箱、CO2氣體檢測儀、溫度測定儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 促排卵及卵子準(zhǔn)備 ?選擇4～6周齡雌性昆明小鼠，于17：00時(shí)腹腔注射PMSG 10 U，48 h后腹腔注射HCG 10 U，14～16 h后采集卵子。卵子準(zhǔn)備具體步驟：①頸部脫臼處死昆明小鼠，腹部用75%酒精清潔消毒，逐層打開腹腔，取出卵巢與子宮之間的輸卵管組織，放入預(yù)恒溫的G-MOPS液中;②在解剖顯微鏡下找到輸卵管膨大的壺腹部（透亮），用1 mL注射器針頭劃破膨大部，流出卵丘復(fù)合物組織;③吸出卵丘復(fù)合物組織依次放入4孔板的IVF液體中，后保存于第4孔，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h;④準(zhǔn)備4孔板，1孔中加入透明質(zhì)酸酶0.5 mL（80 U/mL），2、3、4孔中加入0.6 mL IVF液體，均用石蠟油覆蓋，預(yù)溫2 h后，卵丘復(fù)合物放入1孔透明質(zhì)酸酶中消化1 min，取出卵子周圍的顆粒細(xì)胞，后依次在2、3、4孔中洗滌，去除透明質(zhì)酸酶，完成卵子準(zhǔn)備工作。

1.3.2 精子準(zhǔn)備 ?①選擇8～12周齡雄性昆明小鼠，頸部脫臼處死，腹部酒精清潔消毒，打開腹腔，取出附睪尾部組織，放入預(yù)恒溫的G-MOPS液中。②將附睪尾洗滌后，放入另一有G-MOPS的培養(yǎng)皿中，用1 mL注射器針頭刺破附睪尾部組織，放入CO2培養(yǎng)箱孵育15 min。③準(zhǔn)備好15 mL離心管，加入2 mL濃度為80%的精子梯度離心液，吸出游離出精子的G-MOPS液，緩慢加入到精子梯度離心液上面，可見清晰的分層，300～600 g離心15 min。④吸出精子沉淀，用IVF液洗滌2次，完成精子制備。

1.3.3 卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射操作步驟 ?①根據(jù)固定針的使用不同將ICSI操作分為兩組：傳統(tǒng)固定人類卵子的固定針組（C-ICSI組）和改良的固定針組（N-ICSI組）。C-ICSI組固定人卵的固定針通過商業(yè)化購買。N-ICSI組固定針通過自制完成：選擇外徑1.0 mm、內(nèi)徑0.75 mm的玻璃管，通過拉針儀和鍛針儀拉制端口內(nèi)徑為45～50 μm，開口呈喇叭形的固定針。注射針均選擇商業(yè)化的ICSI注射針。在顯微操作系統(tǒng)上裝好固定針和注射針。②ICSI操作皿的準(zhǔn)備：取顯微操作皿，中心偏上部位做30 μL左右的沖洗滴，以皿的中心為中點(diǎn)做一豎條形的PVP操作滴，再接著以PVP操作滴為對稱軸分別在其兩側(cè)用G-MOPS做若干10 μL左右的卵子操作滴，覆蓋4 mL礦物油后移至桌面培養(yǎng)箱或溫箱中預(yù)熱2 h。③PVP操作滴加入1滴精子懸液，卵子操作滴中加入卵子（3～5個(gè)/滴）。④注射針對精子進(jìn)行斷尾，吸取精子頭，固定針固定卵子，使紡錘體位于6點(diǎn)鐘位置，注射針3點(diǎn)鐘處注射精子進(jìn)入卵子內(nèi)。⑤操作結(jié)束后，用IVF液洗滌卵子后，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)

注射后7 h左右觀察雙原核情況，記錄存活卵子數(shù)、正常受精卵子、異常受精卵子，24 h后觀察卵裂情況，72 h觀察桑葚胚，96 h觀察囊胚發(fā)育、囊胚孵化情況。正常受精比例=正常受精卵子數(shù)/存活卵子數(shù)×100%;異常受精比例=異常受精卵子數(shù)/存活卵子數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射操作方法

C-ICSI組采用固定人卵子的固定針進(jìn)行ICSI操作。N-ICSI組采用自制完成的固定針進(jìn)行操作：開口呈喇叭形。見圖1。

A：C-ICSI組;B：N-ICSI組

圖1 ? 卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射操作

2.2 卵子存活率與受精率比較

N-ICSI組卵子存活率明顯高于C-ICSI組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=483.183，P < 0.01），而兩組正常受精率及異常受精率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

表1 ? 卵子存活率與受精率比較[n（%）]

2.3 胚胎發(fā)育情況的比較

N-ICSI組卵裂數(shù)明顯高于C-ICSI組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.399，P < 0.01）;兩組桑葚胚、囊胚和孵化的胚胎比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.544、3.075、1.938，均P > 0.05）。見表2。

表2 ? 胚胎發(fā)育情況的比較[n（%）]

3 討論

人類胚胎實(shí)驗(yàn)室是精子、卵子受精和胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)場所。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)與精子、卵子和胚胎接觸的環(huán)境直接影響著它們的發(fā)育和培養(yǎng)質(zhì)量，直接關(guān)系著輔助生殖技術(shù)的成功，如實(shí)驗(yàn)室的空氣質(zhì)量、濕度和溫度;培養(yǎng)液的pH值、營養(yǎng)物質(zhì)和滲透壓;培養(yǎng)皿的毒性和雜質(zhì);培養(yǎng)箱的CO2和O2濃度等的異常都可導(dǎo)致精卵體外受精失敗和胚胎發(fā)育障礙[6-7]。因此，加強(qiáng)胚胎實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測和管理，創(chuàng)造一個(gè)適宜穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境對提高輔助生殖技術(shù)，提高生殖中心整體水平具有重要的作用。有學(xué)者報(bào)道了小鼠IVF-ET技術(shù)可以用于檢測實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量，這為生殖醫(yī)學(xué)中心IVF-ET技術(shù)的環(huán)境穩(wěn)定提供了保障[8-9]。但是，尚無文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于ICSI技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制。

ICSI技術(shù)從一開始就應(yīng)用于人的臨床治療，未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，因此，對于ICSI應(yīng)用于臨床治療的風(fēng)險(xiǎn)性尚無法得到有效評(píng)估[10]。ICSI操作時(shí)，是將人工制作的注射針穿刺卵細(xì)胞，可能對卵細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)、微絲微管結(jié)構(gòu)造成損傷，并將這些損傷的缺陷傳給下一代[11-12]。再則，注射針注入的精子不像自然狀態(tài)下的受精過程，自然情況下精子通過陰道、宮頸、子宮、輸卵管等多個(gè)管道才能到達(dá)受精部位，這中間存在多個(gè)篩選屏障，只有質(zhì)量足夠優(yōu)良的精子才能越過這些屏障，因此，起到了優(yōu)勝劣汰的作用。ICSI技術(shù)是通過注射針人為地挑選出表觀尚正常的精子注入進(jìn)卵子內(nèi)，這可能將有遺傳缺陷的精子注入卵細(xì)胞內(nèi)[13]。因此，尋找研究ICSI技術(shù)及其質(zhì)量控制的動(dòng)物模型顯得十分必要。

小鼠動(dòng)物模型價(jià)格便宜，且小鼠攜帶著豐富的遺傳信息，小鼠卵子容易獲得，因此是比較理想的ICSI模型，但是小鼠的卵子比人的卵子小，對外界損傷的刺激特別是穿刺刺激較敏感，容易崩解，因此臨床中對小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行ICSI研究進(jìn)展艱難[14-15]。鄧?yán)鸞16]采用傳統(tǒng)ICSI方法進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)注射后卵子存活率僅為22%，成囊率僅為20%。本研究中C-ICSI組的卵子存活率更低，僅為7.8%，其余大部分均由于注射后胞漿內(nèi)物質(zhì)流出細(xì)胞外死亡，成囊率為38.3%。表明用人的ICSI操作系統(tǒng)進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)，卵子損傷嚴(yán)重，注射部位的卵胞膜受損后，無法自然恢復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡。苗聰秀等[17]采用改良ICSI方法進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)，即使用自制的喇叭型固定針進(jìn)行ICSI操作，結(jié)果卵子存活率達(dá)到83.7%，卵裂率達(dá)到91.1%。采用改良固定針，不改變實(shí)驗(yàn)室的其他環(huán)境，與人類的ICSI技術(shù)非常相似，小鼠ICSI動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功率明顯提高。與傳統(tǒng)的ICSI技術(shù)相比，改良的ICSI技術(shù)能使受損的卵細(xì)胞膜有充足的時(shí)間修復(fù)，因此成活率大大提高。這種可靠的ICSI改良技術(shù)，可以廣泛用于生殖中心實(shí)驗(yàn)室關(guān)于ICSI技術(shù)的質(zhì)量控制和科學(xué)研究，不斷發(fā)展和提高人類ICSI技術(shù)。不僅如此，改良的ICSI技術(shù)還可以檢測精子的受精能力。例如，臨床中經(jīng)常遇到一些不孕夫婦，取出的卵子數(shù)較多，且質(zhì)量較好，但進(jìn)行體外受精時(shí)無一卵子受精。這類患者可以采用改良的ICSI技術(shù)，將這類患者的精子注入進(jìn)老鼠的卵細(xì)胞內(nèi)，研究患者的精子激活鼠卵的能力，并對分裂的受精卵進(jìn)行研究，分析人精子的核型異常情況[18]。

改良的小鼠ICSI技術(shù)，可以明顯提高操作時(shí)卵子的存活率，這將為輔助生殖技術(shù)的發(fā)展和研究和人類實(shí)驗(yàn)室ICSI技術(shù)的質(zhì)量控制提供保障，同時(shí)，可以利用該項(xiàng)研究成果，對人精子激活卵母細(xì)胞的能力進(jìn)行研究，分析人精子的核型。因此，改良的小鼠ICSI技術(shù)對人類輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展有著重要的價(jià)值，值得進(jìn)一步研究和應(yīng)用。

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（收稿日期：2014-09-30 ?本文編輯：任 ?念）