劉立新

新疆省吐魯番市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，新疆吐魯番838000

食品中有害微生物的常規(guī)檢驗(yàn)方法分析

劉立新

新疆省吐魯番市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，新疆吐魯番838000

食品安全直接關(guān)系著人民群眾的身體健康和生命安全。近年來，受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，食品安全事故屢見報(bào)端，食源性疾病的發(fā)生率不斷升高，食品微生物指標(biāo)不合格等現(xiàn)象也引起了人們的廣泛關(guān)注，成為亟待解決的重點(diǎn)問題之一。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)是基于分子生物學(xué)技術(shù)的用于檢驗(yàn)食品中有害微生物的常規(guī)方法之一，其特異性和敏感性高，同時(shí)兼具檢測速度快、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，在食品有害微生物檢測中發(fā)揮了重要作用。本文介紹了PCR技術(shù)檢測食品有害微生物的主要流程與現(xiàn)狀，就目前該技術(shù)應(yīng)用于食品有害微生物檢測中存在的問題及其解決措施進(jìn)行了探討，旨在為食品有害微生物檢驗(yàn)提供借鑒和參考。

食品；有害微生物；PCR技術(shù)；檢驗(yàn)方法

食品安全問題一直是社會各界關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一，而食品微生物檢驗(yàn)是提高食品安全水平和控制食品質(zhì)量的重要技術(shù)手段，有助于減少食品微生物污染，防止食品中的有害微生物危害食品品質(zhì)和人們的身體健康[1]。近年來，因有害微生物而引發(fā)的食物中毒事故也明顯增多，血清學(xué)鑒定、生長法、非選擇性和選擇性增菌等傳統(tǒng)檢測方法雖然準(zhǔn)確性較高，但較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)致病菌和有效控制污染[2]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)是調(diào)查食品源疾病暴發(fā)和鑒定病原菌的有效工具，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，目前在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛。

1 PCR技術(shù)檢測食品有害微生物的流程

PCR技術(shù)是一種在體外迅速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，即指借助體外酶促反應(yīng)作用，通過循環(huán)操作（變性-延伸-復(fù)性）不斷擴(kuò)充DNA模板，之后觀察擴(kuò)增結(jié)果以識別細(xì)菌。該技術(shù)可從食品中檢出痢疾桿菌、大腸桿菌及各種毒素等食品中常見的有害微生物，具有較高特異性和敏感性，可快速準(zhǔn)確的檢出有害微生物，在食品有害微生物檢驗(yàn)中具有其獨(dú)特優(yōu)勢[3]。

PCR技術(shù)檢測食品中有害微生物的主要流程包括引物設(shè)計(jì)、模板的制備、基因擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物分析。其中PCR引物直接影響著擴(kuò)增的特異性，對擴(kuò)增的成功與否也起著關(guān)鍵的作用，而對所檢測對象遺傳背景的了解則決定著設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性。此外，PCR結(jié)果也取決于靶序列的選擇，如引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，則會影響對關(guān)鍵靶序列的選擇，導(dǎo)致PCR檢測的特異性和靈敏度降低，甚至導(dǎo)致其失敗。因此，引物應(yīng)位于待分析基因組中的高度保守區(qū)域，長度宜確定為18～30個(gè)堿基[4]。而模板模板的純度與目標(biāo)分子數(shù)量會影響PCR檢測方法的可靠性，目前，離心、固定化凝集素、陰陽離子交換樹脂等分離純化方法在食品體系中細(xì)菌濃縮方面的應(yīng)用已日益廣泛。在基因擴(kuò)增時(shí)應(yīng)選擇合適的PCR參數(shù)，還可采用定量PCR、多重PCR與巢式PCR等多種衍生技術(shù)。在PCR產(chǎn)物分析方面，將其擴(kuò)增產(chǎn)物行凝膠電泳和染色后，經(jīng)紫外光照射可見其特異區(qū)段的DNA帶，可用于鑒定不同的DNA。此外，還可通過序列測定等手段分析其序列，以確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 PCR技術(shù)檢測有害微生物的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 大腸桿菌

目前，應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測腸出血大腸桿菌、腸毒素大腸桿菌已有較多報(bào)道，其中前者可引起溶血性尿毒綜合征、血栓形成血小板減小性紫癜等，二者并發(fā)時(shí)死亡率可達(dá)80%[5]；后者是引起腹瀉的主要原因，對公共衛(wèi)生有極大危害。多項(xiàng)研究表明應(yīng)用PCR技術(shù)檢測上述致病菌具有操作簡便、用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，也相對更特異、靈敏和簡便。

2.2 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是一種可引起食物中毒的重要細(xì)菌。據(jù)報(bào)道，由該細(xì)菌所引起的食物中毒居第二位，僅次于大腸埃希菌，在細(xì)菌性食物中毒中占33%，部分國家甚至高達(dá)45%[6]。腸毒素是導(dǎo)致金黃色葡萄球菌食物中毒的重要因子，近年來國外已有采用PCR技術(shù)檢測腸毒素基因的報(bào)道，但有關(guān)該技術(shù)檢測葡萄球菌致病因子的研究較少，多局限于對PCR技術(shù)的探討及其擴(kuò)增反應(yīng)最佳條件的選擇等少數(shù)領(lǐng)域。

2.3 沙門氏菌

沙門氏菌是一種革蘭陰性腸道致病菌，對人畜均有極大危害，主要通過家禽、蛋和肉類產(chǎn)品傳播。該致病菌在污染食品中的含量水平遠(yuǎn)低于有感染病人病灶中的含量，加之受食品加工及其本身性質(zhì)的干擾，導(dǎo)致沙門氏菌的檢測較為困難。血清學(xué)鑒定等傳統(tǒng)檢測方法雖然比較可靠，但通常需4～7 d才能完成，比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難以滿足快速檢測的需要，也就無法確保食品安全。PCR技術(shù)現(xiàn)已廣泛用于沙門氏菌的檢測，并不斷得以改進(jìn)和發(fā)展，應(yīng)用前景較為廣闊。近年來，隨著實(shí)時(shí)定量PCR的產(chǎn)生和發(fā)展，采用該技術(shù)檢測沙門氏菌的報(bào)道越來越多，成功報(bào)道也屢見不鮮。

2.4 其他致病菌

其他還有產(chǎn)單核李斯特菌、空腸彎曲菌和耶爾森氏菌等，其中產(chǎn)單核李斯特菌（Lm）多存在于蔬菜、肉類和奶酪等食品當(dāng)中，以小孩、老年人和免疫缺陷個(gè)體為主要感染群體。應(yīng)用PCR技術(shù)可直接從食物樣品中檢測，并且在肉類、牛奶及奶制品的檢測上有較多成功的例子。空腸彎曲菌是從腹瀉病人糞便中分離出來的一種致病菌，目前已被認(rèn)為是引發(fā)人類腹瀉的主要致病菌之一，其感染人體的主要媒介是接觸畜禽類或食用受污染的水源、牛奶和禽制品，近年來應(yīng)用PCR技術(shù)檢測該致病菌已引起了人們的重視并取得了較大的進(jìn)展。耶爾森氏菌也是危害人類健康的常見致病菌，為確保食品安全，對食品中假結(jié)核耶爾森氏菌與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測十分必要，而建立一種PCR反應(yīng)體系可迅速準(zhǔn)確地在水源、水制品、奶制品和肉制品中檢測出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌[7]。

3 PCR應(yīng)用于食品檢測存在的問題及解決措施

應(yīng)用PCR技術(shù)檢測食品中有害微生物目前主要存在以下問題：①食物自身的成分較為復(fù)雜，導(dǎo)致從其原料中抽提DNA的效率較低；②在區(qū)別活菌和死菌方面存在缺陷，因此有必要進(jìn)行有效的前處理；③食品基質(zhì)、培養(yǎng)基成分及殘留食物成分易對PCR酶反應(yīng)造成干擾和抑制。

鑒于存在以上問題，近年來多種新型PCR技術(shù)得到了快速發(fā)展，在一定程度上克服了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的缺點(diǎn)，其中PCR與ELISA技術(shù)、熒光檢測或基因探針相結(jié)合的方法較為成功，具有操作簡單、結(jié)果直觀可靠、特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[8]。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法為例，該檢測方法可實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，且無需對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，有效克服了傳染方法易污染的缺點(diǎn)。此外，有的科學(xué)工作者針對PCR檢測食品中出現(xiàn)的假陰性結(jié)果、檢測靈敏度降低等問題提出了很多切實(shí)可行的解決辦法，進(jìn)一步提高了該技術(shù)的實(shí)用性和應(yīng)用范圍[9]。

綜上所述，PCR技術(shù)具有特異、敏感、快速等優(yōu)點(diǎn)，是一種具有重要應(yīng)用價(jià)值的檢測手段，可及時(shí)準(zhǔn)確的檢測出食品中的有害病原微生物，隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，該技術(shù)也會進(jìn)一步趨于完善，必將在食品檢測領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。

[1]余欣達(dá).淺談食品監(jiān)測中微生物技術(shù)應(yīng)用分析[J].中國化工貿(mào)易，2013（6）：308-309.

[2]許子剛.淺談食品微生物檢驗(yàn)內(nèi)容與檢測技術(shù)分析[J].科技與企業(yè)，2012(7)：277.

[3]許佳妮.食品有害微生物快速檢驗(yàn)方法[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（14）：284-285.

[4]康曉偉.淺談食品中微生物檢測技術(shù)[J].農(nóng)民致富之友，2013（5）：56.

[5]張寧.食品微生物檢測技術(shù)和方法[J].品牌與標(biāo)準(zhǔn)化，2014（10）：17.

[6]楊曉楠，韓玲.食品微生物檢驗(yàn)過程中的質(zhì)量控制分析[J].甘肅農(nóng)業(yè)，2013（8）：16-17.

[7]王小東，歐雁方.食品中常見有害微生物的常規(guī)檢驗(yàn)方法分析[J].中國保健營養(yǎng)，2014，1（下）：574.

[8]張新武，杜小波，徐素玲，等.食品中微生物危害的分析和控制[J].食品安全治療檢測學(xué)報(bào)，2014（10）：3295-3299.

[9]王永,趙新,蘭青闊,等.食品中微生物危害控制及風(fēng)險(xiǎn)評估研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,20(10):47，50.

Analysis of Conventional Test Methods of Harmful Microorganisms in Food

LIU Li-xin
Turpan Center for Disease Control and prevention in Xinjiang City Clinical Laboratory 838000 China

The food safety is directly related to people's health and life safety.In recent years,driven by economic interests,the food safety accident frequently appear in newspapers,increased incidences of food borne diseases,food microbiology indicators unqualified phenomenon has caused people's extensive concern,become one of the key problems to be solved.Polymerase chain reaction(PCR)technology is a molecular biology technique for one of the conventional method of harmful microorganisms in food based on the test,the high specificity and sensitivity,fast detection speed,simultaneously has the advantages of high accuracy,the food is harmful to play an important role in microbial detection.This paper introduces PCR technology to detect food harmful microorganism mainly process and current situation,at present the technology applied in food is harmful to the presence of microbial detection problems and solving measures were discussed,aimed to harmful microorganism inspection and provide the reference for food.

Food;harmful microorganisms;PCR technology;Test method

R15

A

1672-5654（2015）03（c）-0038-02

2015-01-11）

劉立新（1965-），女，新疆哈密人，大專，主管檢驗(yàn)師，主要從事疾控衛(wèi)生檢驗(yàn)工作。