丁 蘇，李 獻(xiàn)，李 瑋，畢方方，林 玲，韋俏娜，張 瑛

（1.廣西大學(xué)行健文理學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

長枝木霉原生質(zhì)體制備及再生條件研究

丁 蘇1，李 獻(xiàn)1，李 瑋2，畢方方1，林 玲2，韋俏娜1，張 瑛2*

（1.廣西大學(xué)行健文理學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

研究優(yōu)化了長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15菌株菌絲體制備原生質(zhì)體細(xì)胞及再生的條件。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對影響原生質(zhì)體形成和再生的菌齡、破壁酶組成、酶解反應(yīng)溫度及時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑等因素進(jìn)行了篩選優(yōu)化。結(jié)果表明，長枝木霉菌株JK-15的最適條件為菌絲體菌齡18 h，混合酶組成配比為1.5%蝸牛酶∶1.5%纖維素酶∶0.1%溶壁酶，酶解條件為30℃條件下酶解2.5 h，原生質(zhì)體制備過程中滲透壓穩(wěn)定劑為0.7 mol/L山梨醇，原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基中滲透壓穩(wěn)定劑為0.7 mol/L蔗糖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為長枝木霉JK-15的育種工作奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

長枝木霉；原生質(zhì)體；生物防治；育種

木霉（Trichodermaspp.）是一類具有較強(qiáng)生物防治功效的絲狀真菌，其具有生長迅速、能分泌多種抑菌物質(zhì)、能夠?qū)χ参锊≡M(jìn)行重寄生等生理特性，因而在國內(nèi)外被廣泛的用于多種植物病害的生物防治研究[1-3]。但在實(shí)際的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用過程中，大多數(shù)木霉菌均會(huì)表現(xiàn)出最適溫度區(qū)間較小、定殖能力不穩(wěn)定、抑菌廣譜性較差等不足。為了解決這些問題，研究人員一方面不斷努力從自然界中篩選更優(yōu)良的野生菌株，另一方面也在嘗試通過微生物育種的方法改良現(xiàn)有菌株[4-7]。通過制備木霉的原生質(zhì)體，進(jìn)而進(jìn)行誘變或融合，是對木霉菌株進(jìn)行改良選育的有效手段[8-9]。

目前國內(nèi)外關(guān)于長枝木霉原生質(zhì)體制備的方法報(bào)道較少，在前期研究中，本課題組從自然環(huán)境中篩選獲得了對葡萄灰霉病和潰瘍病具有較好生物防治效果的野生長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15，但因其表現(xiàn)出對高溫耐受較差的缺點(diǎn)，不利于在廣西等我國南部地區(qū)的實(shí)際應(yīng)用，因此，本研究通過原生質(zhì)體育種的方法，對該菌進(jìn)行改良，對長枝木霉JK-15的原生質(zhì)體制備及再生條件進(jìn)行研究，為今后的原生質(zhì)體育種工作奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）JK-15，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面及平板培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

菌絲體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，酵母粉10 g，MgSO45 g，KH2PO45 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

1.1.3試劑及溶液

蝸牛酶（10 U/mg）：福建漳州金田生物科技有限公司；纖維素酶（CAS9012-54-8，10U/mg）、β-巰基乙醇（分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；溶壁酶（CAS158928，10000U/mL）：德國Qiagen公司；NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（0.2mol/L，pH5.7）的配制：NaH2PO42.917g，Na2HPO40.466g，去離子水100 mL。

滲透壓穩(wěn)定液：用PBS緩沖液分別配制0.7mol/L NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、山梨醇的滲透壓穩(wěn)定液。

菌絲前處理液：含體積分?jǐn)?shù)0.1%β-巰基乙醇的20 mmol/L EDTA溶液。

酶溶液：用滲透壓穩(wěn)定液配制蝸牛酶、纖維素酶和溶壁酶的單一組分酶溶液或混合酶溶液，于常溫下令酶粉或酶液充分混勻后，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm無菌微孔過濾器過濾除菌。

1.2 儀器與設(shè)備

EBA21型高速離心機(jī)：德國Hettich Zentrifugen公司；J2-21高速冷凍離心機(jī)：美國Bechman公司；ILB-008-04低溫恒溫循環(huán)器：施都凱儀器（上海）有限公司；SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠；HVE-50自動(dòng)滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；SKY-211B振蕩培養(yǎng)箱：上海蘇坤儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；OLYMPUS CX41光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將保藏的長枝木霉JK-15斜面上的孢子用生理鹽水洗下制備成濃度為105個(gè)/mL的單孢子懸浮液，稀釋涂布于PDA平板上，30℃培養(yǎng)36 h，挑取生長迅速、表面長滿綠色孢子的單菌落接種于PDA斜面上，30℃培養(yǎng)3 d，至斜面培養(yǎng)基表面長滿。

1.3.2 菌絲體的培養(yǎng)

將活化培養(yǎng)獲得的長枝木霉JK-15斜面上的孢子用生理鹽水洗下制備成濃度為105CFU/mL的單孢子懸浮液，按10%（V/V）的接種量接種于盛有100 mL菌絲體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，160 r/min振蕩培養(yǎng)適宜的時(shí)間后，用4層擦鏡紙過濾收集菌絲體用于制備原生質(zhì)體。

1.3.3 原生質(zhì)體的制備與再生

將收集的菌絲體用PBS緩沖液和無菌水依次洗滌3次，重懸浮于菌絲前處理液中，處理一定時(shí)間后，用滲透壓穩(wěn)定液洗滌3次，收集菌絲體重懸浮于酶液中，于100 r/min振蕩酶解制備原生質(zhì)體。酶解結(jié)束后用4層擦鏡紙過濾，收集濾液，4 000 r/min離心10 min，收集原生質(zhì)體沉淀，重懸浮于滲透壓穩(wěn)定液中，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨后用滲透壓穩(wěn)定液進(jìn)行梯度稀釋涂布于高滲平板（在普通平板中添加滲透壓穩(wěn)定劑）和普通平板上，于30℃培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計(jì)平板上單菌落數(shù)量，用以下公式計(jì)算原生質(zhì)體再生率：

式中：A為高滲平板上生長的單菌落數(shù)，CFU/mL；B為普通平板上生長的單菌落數(shù)，CFU/mL；C為顯微鏡下觀察到的原生質(zhì)體數(shù)，CFU/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 破壁酶液組分優(yōu)化

由于不同微生物的細(xì)胞壁組成結(jié)構(gòu)差異較大，因而在制備原生質(zhì)體時(shí)所選擇的破壁酶的種類、用量及配比也隨之存在較大差別[10-13]，需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)中選擇制備絲狀真菌原生質(zhì)體常用的蝸牛酶、纖維素酶和溶壁酶配制混合酶液，以原生質(zhì)體生成量作為考察指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定最適的組合條件。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表1，方差分析見表2。

由表1可知，混合酶3個(gè)組分對長枝木霉原生質(zhì)體制備影響大小順序?yàn)槔w維素酶＞溶壁酶＞蝸牛酶，最優(yōu)化混合酶配比為A3B3C1，即1.5%蝸牛酶，1.5%纖維素酶，0.1%溶壁酶。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該配比條件下酶解生成原生質(zhì)體的數(shù)量為（9.8±0.2）×106CFU/mL。

由表2可知，蝸牛酶、纖維素酶和溶壁酶對原生質(zhì)體生成量影響均顯著（P＜0.05）。

在此基礎(chǔ)上，同時(shí)選擇了4組生成原生質(zhì)體效果最優(yōu)的酶組合，考察其制備所得原生質(zhì)體的再生率，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，A3B3C1混合酶配比條件下，既能獲得較高的原生質(zhì)體制備效率，又能保持較好的再生率，因而將A3B3C1混合酶配比確定為后續(xù)工作的混合酶配比方案。

2.2 菌絲體培養(yǎng)時(shí)間的確定

菌絲體的菌齡對于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、原生質(zhì)體的生成效率及活力影響顯著。菌齡過長易造成細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變厚不得于原生質(zhì)體的釋放；菌齡過短菌絲易斷裂，不利于原生質(zhì)體與菌絲體的分離。絲狀真菌往往選擇處于生長旺盛期的細(xì)嫩菌絲用于制備原生質(zhì)體。由圖2A可知，原生質(zhì)體的生成數(shù)量隨菌絲體菌齡而增加，至菌齡達(dá)到18 h后原生質(zhì)體的生成量開始下降；由圖2B可知，菌齡18 h的菌絲體制備得到的原生質(zhì)體再生率也最高。因此，選擇18 h為長枝木霉JK-15制備原生質(zhì)體的最適菌齡。

2.3 最適酶解溫度與時(shí)間的確定

不同酶解溫度及酶解時(shí)間條件下原生質(zhì)體生成曲線如圖3所示。過高或過低的酶解溫度會(huì)影響原生質(zhì)體的生成速度和最終的制備效率；而原生質(zhì)體的生成量與酶解的反應(yīng)時(shí)間呈正比，但過長的反應(yīng)時(shí)間會(huì)使已生成的原生質(zhì)體細(xì)胞被破壞死亡，從而降低制備效率。由圖3可知，，長枝木霉JK-15原生質(zhì)體酶解的最適溫度為30℃，最適酶解反應(yīng)時(shí)間為2.5～3.0 h。在此基礎(chǔ)上，分別測定了30℃酶解2.5 h、3.0 h、3.5 h制備所得原生質(zhì)體的再生率，分別為19.6%、16.7%和12.3%，綜合考慮原生質(zhì)體的生成量和再生率，確定在30℃下酶解2.5 h為酶解反應(yīng)的最適條件。

2.4 滲透壓穩(wěn)定劑對于原生質(zhì)體制備與再生的影響

滲透壓穩(wěn)定劑的作用是維持原生質(zhì)體正常形態(tài)[14-15]，其不僅影響原生質(zhì)體的制備效率，同時(shí)影響原生質(zhì)體的再生率。不同微生物在制備原生質(zhì)體過程中，適宜的滲透壓穩(wěn)定劑差異較大，需要通過試驗(yàn)進(jìn)行篩選。本研究添加0.7 mol/L NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、山梨醇等滲透壓穩(wěn)定液，分別考察其對原生質(zhì)體生成量及再生率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，對于原生質(zhì)體制備和再生效果最好的穩(wěn)定劑分別為山梨醇和蔗糖，因此在制備原生質(zhì)體時(shí)應(yīng)使用0.7 mol/L山梨醇為穩(wěn)定劑，而在再生培養(yǎng)基中應(yīng)使用0.7 mol/L蔗糖作為穩(wěn)定劑。

3 結(jié)論

原生質(zhì)體的制備與再生是微生物原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體誘變以及基因組重組等育種過程中的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。能夠在高效制備原生質(zhì)體的前提下實(shí)現(xiàn)較高的原生質(zhì)體再生率對于育種工作的效率與結(jié)果至關(guān)重要。本研究通過一系列的條件優(yōu)化，最終確定了長枝木霉JK-15最適的原生質(zhì)體制備及再生條件為：菌絲體菌齡18 h；混合酶組成配比為1.5%蝸牛酶：1.5%纖維素酶：0.1%溶壁酶；酶解溫度30℃，酶解時(shí)間2.5 h；原生質(zhì)體制備過程中滲透壓穩(wěn)定劑為0.7 mol/L山梨醇，原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基中滲透壓穩(wěn)定劑為0.7 mol/L蔗糖。本研究的結(jié)果為長枝木霉JK-15的育種工作奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)為其他長枝木霉菌株原生質(zhì)體的制備工作提供了參考。

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Optimization ofTrichoderma longibrachiatumprotoplasts preparation and regeneration conditions

DING Su1,LI Xian1,LI Wei2,BI Fangfang1,LIN ling2,WEI Qiaona1,ZHANG Ying2*
(1.Xingjian College of Science and Liberal Arts,Guangxi University,Nanning 530004,China; 2.Viticulture and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China)

The protoplasts preparation and regeneration conditions ofTrichoderma longibrachiatumJK-15 were studied.The effect of mycelia growth time,enzyme composition,enzymatic reaction temperature and time,osmotic pressure stabilizer on protoplasts formation and regeneration were optimized by single factor experiments and orthogonal experiments.The results showed the optimal conditions were mycelia growth time 18 h,enzyme composition snailase 1.5%,cellulose 1.5%and lytic enzyme 0.1%;enzymatic reaction was carried out at 30℃for 2.5 h,the optimal osmotic pressure stabilizers in protoplast preparation process and protoplast regeneration process were sorbitol 0.7 mol/L and sucrose 0.7 mol/L,respectively.The research has laid a good working basis for further breeding ofT.longibrachiatumJK-15.

Trichoderma longibrachiatum;protoplast;biological control;breeding

Q939.96

A

0254-5071（2015）06-0058-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.013

2015-05-20

廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFAA118107）；廣西大學(xué)行建文理學(xué)院科研基金（2013ZKLX03）

丁蘇（1985-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ獭?/p>

*通訊作者：張瑛（1974-），女，研究員，碩士，研究方向?yàn)槠咸延N及病蟲害防治。