鄭曉吉，史學(xué)偉，董 娟，姜遠(yuǎn)麗，關(guān) 波，倪永清

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003）

冰凍圈嗜冷酵母菌多樣性、嗜冷機(jī)制及其應(yīng)用

鄭曉吉，史學(xué)偉，董 娟，姜遠(yuǎn)麗，關(guān) 波，倪永清*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003）

冰川冰凍圈包括一些全球最大的未開發(fā)的和極端的生物圈，其中嗜冷的大量原核生物和真核生物具有普遍的多樣性。低溫環(huán)境下微生物產(chǎn)生了一系列適應(yīng)低溫、寡營養(yǎng)、強(qiáng)輻射、凍融等極端因子的分子機(jī)制，冰凍圈如南極等成為很多科學(xué)家研究嗜冷微生物（包括酵母菌）多樣性的主要區(qū)域。近年來，非南極冰凍圈嗜低溫酵母菌的研究也越來越多。主要綜述全球范圍內(nèi)嗜冷酵母菌的生物多樣性和嗜冷機(jī)制，旨在揭示嗜冷酵母菌生物技術(shù)方面的開發(fā)潛力，如作為對(duì)污染環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)的低溫酶開發(fā)的主要來源。

冰凍圈；嗜冷酵母菌；多樣性；嗜冷機(jī)制

地球上超過80%的環(huán)境溫度周期性或永久的低于5℃，如深海、海冰、南北兩極冰蓋、環(huán)北極地區(qū)的凍土及高山荒漠、冰川和凍土[1-3]。其中陸地山岳冰川是冰凍圈的典型代表，最大特點(diǎn)是常年溫度始終低于0℃，由于低溫、寡營養(yǎng)為生命和生物大分子物質(zhì)的保存提供了得天獨(dú)厚的環(huán)境，20世紀(jì)末以來科學(xué)家不斷發(fā)現(xiàn)冰川中蘊(yùn)藏著豐富的嗜冷真核和原核微生物資源，包括古菌、細(xì)菌、藍(lán)藻、酵母、絲狀真菌、藻類和原生生物等，對(duì)這些極端條件下的微生物多樣性、地理分布、嗜冷機(jī)制（包括不飽和脂肪酸、冷激蛋白、熱激蛋白和低溫酶等）做了深入的研究[4-5]。

酵母菌作為一類重要的微生物資源，在食品、醫(yī)藥、發(fā)酵工業(yè)、環(huán)保等行業(yè)被廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌的營養(yǎng)代謝極其多樣，在自然界不同的微環(huán)境中能夠利用不同的底物，展現(xiàn)出極強(qiáng)的生存能力，甚至進(jìn)化出比細(xì)菌更好的適應(yīng)低溫環(huán)境的能力[6]。無論在南極、北極還是一些低緯度高海拔山地冰川的冰芯、凍土、融水和沉積物等各種冰凍圈環(huán)境中均有可培養(yǎng)酵母菌存在，而且發(fā)現(xiàn)棲息于低溫生態(tài)系統(tǒng)的酵母菌為一些特定的種屬[7]。近年來發(fā)現(xiàn)，嗜冷酵母菌的代謝產(chǎn)物（如低溫酶、胞外多糖、多聚不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、γ-癸內(nèi)酯等）在食品、藥物開發(fā)以及現(xiàn)代生物降解工程中應(yīng)用潛力巨大，使得嗜冷酵母菌資源逐漸引起人們的關(guān)注，正在成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[6，8-10]。由于全球氣候逐漸變暖，冰川持續(xù)退縮，嗜冷微生物的生存環(huán)境不斷遭到破壞，開發(fā)和認(rèn)識(shí)這些低溫微生物迫在眉睫。

本文主要綜述全球范圍內(nèi)嗜冷酵母菌的生物多樣性和嗜冷機(jī)制方面的研究，旨在揭示嗜冷酵母菌生物技術(shù)方面的開發(fā)潛力，如作為對(duì)污染環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)的低溫酶開發(fā)的主要來源。

1 全球冰川棲息地嗜冷酵母菌多樣性研究

1.1 南極嗜冷酵母菌研究

南極洲的面積為1 400萬km2，其中99%被冰雪覆蓋。從1960年開始，因?yàn)槟蠘O特有的嚴(yán)酷的自然條件，對(duì)南極酵母菌的研究引起了大家的普遍關(guān)注。到目前為止，從南極分離到的酵母達(dá)70種（其中13種屬子囊菌綱，57種屬擔(dān)子菌門）。酵母類似物短梗霉也被發(fā)現(xiàn)，其中主要代表是隱球菌屬，約占總物種數(shù)量的25%?？偟膩碚f，僅僅幾個(gè)物種呈隨機(jī)分布。

南極一些早期的采樣也一直很重視生態(tài)的影響，其中，對(duì)維多利亞地區(qū)土壤、水和其他生物樣本研究的最為廣泛。CONNELL L B等[11]研究了維多利亞地區(qū)土壤中酵母的多樣性，酵母菌的數(shù)量可達(dá)到5～105CFU/g。后續(xù)其他研究者所分離的酵母被識(shí)別為屬于子囊菌類的和擔(dān)子菌類的物種，其中念珠菌屬、隱球菌屬、Dioszegia屬和紅酵母屬最為普遍。季節(jié)性的溫度變化，化學(xué)和物理特性的變化（如pH、電導(dǎo)率）都會(huì)明顯影響酵母的分布。研究較多的其他南極地區(qū)如位于韋斯特福爾山脈的戴維斯站，是由澳大利亞南極部門一個(gè)永久站管理的南極研究站。THOMAS-HALL S R等[12]在土壤、雪和其他有機(jī)材料中發(fā)現(xiàn)新的物種，分別屬于隱球菌屬、Dioszegia屬、木拉克酵母屬和Mrakiella屬。此外SCORZETTI G等[13-14]研究表明，從位于部分南極海岸分離到Cryptococcus adeliensis和Rhodotorula aurantiaca兩種主要菌種。

南極半島是南極大陸常年被冰雪覆蓋的最北邊的區(qū)域。POLI A等[15]從南極半島土壤、苔蘚和地衣中分離出酵母菌屬隱球酵母屬、木拉克酵母屬、白冬孢酵母屬和擲孢酵母屬。

近期研究主要結(jié)合可培養(yǎng)和非可培養(yǎng)的方法。ARENZ B E等[16]采用可培養(yǎng)和DGGE結(jié)合的方法從南極羅斯島土壤和腐木中得到ascomycetous和basidiomycetous門酵母，分別為Debaryomyces，Dipodascus，Bulleromyces，Cryptococcus，Dioszegia，Rhodotorula，Sporidiobolus和Sporobolomyces屬。

1.2 北極地區(qū)嗜冷酵母菌研究

北極擁有巨大的冰封的海洋和凍土地區(qū)，主要包括北冰洋和加拿大、俄羅斯、格陵蘭島、美國、挪威、瑞典、芬蘭和冰島部分地區(qū)。目前，從北極冰凍圈分離得到的46種酵母中，子囊菌綱8種，38種屬擔(dān)子菌類，此外有出芽短梗霉的報(bào)道。和南極酵母菌研究類似，其中約1/3為隱球菌屬[6]。

由于受到地理?xiàng)l件的限制，對(duì)酵母菌的研究只涉及到部分北極地區(qū)，如斯瓦爾巴群島、格陵蘭島和冰島。斯瓦爾巴群島是位于挪威和北極之間的中間島，近年來一些擔(dān)子菌類的酵母（屬布勒擔(dān)孢酵母屬、隱球菌屬、Cystofilobasidium、Filobasidium、Leucosporidiella、木拉克酵母屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、毛孢子菌屬）在一些冰川冰凍圈被發(fā)現(xiàn)[2，10，17]。

西伯利亞地區(qū)幾乎是全亞洲北部氣候條件最嚴(yán)厲的地區(qū)（包括俄羅斯聯(lián)邦的中部和東部）。MARGESIN R等[3，7]最近的研究發(fā)現(xiàn)，在西伯利亞沉積物和沙土存在兩個(gè)新物種Mrakiella cryoconiti和Rhodotorula arctica。

格陵蘭島和冰島位于北極和大西洋之間。VISHNIAC H S等[7]在冰島土壤分離到Cryptococcus和Cystofilobasidium兩個(gè)屬酵母。應(yīng)用可培養(yǎng)和非可培養(yǎng)結(jié)合的方法研究古代格陵蘭冰芯（大約140 000多年）酵母多樣性，酵母分離物和DNA序列顯示一個(gè)明顯的酵母多樣性。

1.3 亞洲和喜馬拉雅地區(qū)嗜冷酵母的研究

和其他冰川不同，對(duì)亞洲地區(qū)冰凍圈（除西伯利亞外）冰川酵母多樣性的研究報(bào)道的很少。SHIVAJI S等[8]從印度喜馬拉雅山脈的路普康湖周圍的土壤中分離到嗜冷酵母菌。菌株被鑒定為屬于Cryptococcus gastricus和一個(gè)新物種Rhodotorula himalayensis。UETAKE J等[19]采用可培養(yǎng)和非可培養(yǎng)結(jié)合的方法在別盧哈山（沿俄羅斯和哈薩克斯坦邊境的阿爾泰山脈）高海拔的雪和冰芯中研究酵母菌的豐度。從冰芯（融化后）直接采用26S rRNA克隆擴(kuò)增分析鑒定該菌株屬紅酵母?；诮湍柑崛∥锏姆治?，偶爾的表面融化是影響酵母從表面到厚的積雪層繁殖因素之一。

天山凍土屬于我國高海拔高山多年凍土類型，分布于烏魯木齊河源天山冰川地區(qū)，海拔3 250 m以上，年平均地溫為-4.95℃，并且隨著海拔的升高，地溫降低。姜遠(yuǎn)麗等[20]選取天山河源1號(hào)冰川凍土為介質(zhì)，分離篩選嗜低溫酵母菌。用26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴(kuò)增并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。初步分離出菌株4株，菌落顏色大致分為兩種，橘黃色和乳白色菌落，鏡檢為橢球形初步鑒定為酵母菌。由26S rRNA基因序列同源性分析，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化鑒定，分別為隱球酵母、擲孢酵母、棒孢酵母和畢赤酵母。

1.4 歐洲冰川嗜冷酵母的研究

近期研究發(fā)現(xiàn)，歐洲冰川也是研究嗜冷酵母生命的主要場(chǎng)所，非北極歐洲冰凍圈由阿爾卑斯山脈、亞平寧山脈和比利牛斯山脈組成。歐洲冰凍圈所分離的到41種酵母中，1個(gè)子囊菌綱，其余40屬擔(dān)子菌類。隱球菌屬最為普遍，占到39%。此外，酵母類似物A.pullulans和皮炎外瓶霉被發(fā)現(xiàn)[6]。

阿爾卑斯山是歐洲最大的山脈的復(fù)合體之一，其中勃朗峰在意大利與法國邊境是歐洲最高的山脈（高度可達(dá)4 810 m）。奧地利、意大利和瑞士研究組已經(jīng)在高山冰凍圈開展了嗜冷酵母的多樣性研究，發(fā)現(xiàn)存在大量的擔(dān)子菌類如Glaciozyma、白冬孢酵母屬、隱球菌屬、Mastigobasidium、木拉克酵母屬、Mrakiella，紅冬孢酵母屬、紅酵母和擲孢酵母屬[21-22]。

TURCHETTI B等[23]研究發(fā)現(xiàn)，意大利阿爾卑斯山冰川上分離到的酵母中Cryptococcus gilvescens數(shù)量占總菌株50%，有少量的新種首次被發(fā)現(xiàn)。

1.5 南美冰川嗜冷酵母的研究

和其他冰川生態(tài)系統(tǒng)一樣，南美洲的冰凍圈同樣存在大量嗜冷酵母菌。主要研究集中在Nahuel Huapi國家公園、巴塔哥尼亞和阿根廷。融水為主要的分離源，所分離到的41種（4種屬子囊菌綱，37種屬擔(dān)子菌）中，大約1/3屬于隱球菌屬。阿根廷科學(xué)家BRAND?O LR等[24]研究了冰川附近的水生環(huán)境中酵母多樣性，Cryptococcus victoriae，Leucosporidiella fragaria和Rhodotorula mucilaginosa最為常見。一些新種Cryptococcus spencermartinsiae，Cystofilobasidium lacus-mascardii和W ickerhamomyces patagonicus首次被發(fā)現(xiàn)。

綜合以上研究分析發(fā)現(xiàn)，全球冰凍圈環(huán)境的酵母菌多樣性既有廣泛分布的種屬，如隸屬于basidiomycetes門Cryptococcus屬的大多數(shù)種[25]。相反，另一些酵母菌種群因地理分隔和擴(kuò)散限制而呈現(xiàn)有限的地理分布或地域性分化。如Candida psychrophila、Cryptococcus antarcticus、Cryptococcus friedmannii、Cryptococcus nyarrow ii、Dioszegia antarctica、Glaciozyma antarctica和Mrakiella niccombsii目前僅僅從南極分離得到；Leucosporidiella yakutica來源于北極；Rhodotorula psychrophenolica和Rhodotorula psychrophila從歐洲冰川分離得到，Cyst.lacusmascardii從南美冰凍圈環(huán)境分離得到，Rh.Himalayensis是唯一從喜馬拉雅山脈獲得的[6]。

不管是冰川表面還是底部沉積層對(duì)酵母菌具有明顯的選擇作用，棲息繁衍于冰川中的酵母菌種群具有極強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，也決定了冰川生態(tài)體系中酵母菌的多樣性及其空間分布應(yīng)該依據(jù)環(huán)境差異有明顯不同的格局[7]。其次，大部分的酵母菌是不可培養(yǎng)的，以上呈現(xiàn)地域性分布的部分低溫酵母很可能是由于分離方法本身的缺陷造成的，結(jié)合培養(yǎng)和非可培養(yǎng)的方法，更能全面揭示全球冰凍圈環(huán)境酵母菌的多樣性。此外，許多研究取樣不完全，缺乏樣品所在地理位置的物理、化學(xué)和生態(tài)方面信息，并不能夠代表具體環(huán)境中真正的微生物物種多樣性，造成對(duì)微生物多樣性的過低估計(jì)，從而使酵母菌群落分布格局的研究存在方法上的缺陷。

因此，全球范圍內(nèi)報(bào)道的冰凍圈環(huán)境酵母菌只能反映部分多樣性，對(duì)酵母菌種群空間分布的驅(qū)動(dòng)機(jī)制并不清楚?；诖耍诓煌臻g尺度下，針對(duì)不同地理位置的冰凍圈景觀樣品酵母菌群落的組成進(jìn)行橫向比較研究具有更重要的理論意義。而且隨著全球氣候變暖，冰川持續(xù)退縮，嗜冷微生物的生存環(huán)境不斷遭到破壞，開發(fā)和認(rèn)識(shí)這些低溫微生物迫在眉睫。充分挖掘極端低溫環(huán)境中嗜冷酵母菌資源，對(duì)認(rèn)識(shí)微生物的進(jìn)化機(jī)制、物種多樣性以及開發(fā)其生物技術(shù)利用潛力具有重要的意義。

2 嗜冷酵母菌嗜冷機(jī)制

低溫以多種方式影響微生物的生長，如降低增長率、增加介質(zhì)黏度、減少膜流動(dòng)性、改變蛋白質(zhì)構(gòu)象和減少營養(yǎng)的可用性[2-3]。低溫環(huán)境中微生物產(chǎn)生了一系列適應(yīng)低溫、寡營養(yǎng)、強(qiáng)輻射、凍融等極端因子的分子機(jī)制。（1）低溫條件下通過改變脂肪酸的組成增加膜流動(dòng)性；（2）保護(hù)蛋白質(zhì)的合成以適應(yīng)溫度變化；（3）為減少細(xì)胞質(zhì)冰晶體的存在，合成大分子的冷凍保護(hù)劑；（4）亞細(xì)胞、分子和代謝變化；（5）降低增長率；（6）低溫酶的合成[6]。

2.1 膜脂類組成的改變

許多研究表明，通過調(diào)節(jié)合成脂肪酸以調(diào)整膜流動(dòng)性能力對(duì)冷適應(yīng)是至關(guān)重要的。嗜冷酵母膜脂質(zhì)成分改變主要有不飽和脂肪酸的增加，脂肪酸鏈長度的縮短和固醇/磷脂比的減少。在這三種方法中，增加脂肪酸不飽和現(xiàn)象研究的最多[26]。一般來說，在0℃以下的，增加脂肪酸不飽和度膜的流動(dòng)性不會(huì)改變。極低的溫度條件下，嗜冷酵母的膜上不飽和脂肪酸的比例增加（50%～90%）。ROSSI M等[27]研究表明，特別是在冰點(diǎn)以下的溫度，Mrakia、Leucosporidium和紅酵母細(xì)胞膜中亞油麻酸（35%～50%）和亞麻酸（25%～30%）占主導(dǎo)地位。相比之下，溫度在接近最適生長溫度時(shí)，油酸（20%～40%）和亞油酸（30%～50%）是膜主要的組成。

2.2 響應(yīng)蛋白質(zhì)的合成（冷激蛋白Csp和熱激蛋白Hsp）

溫度迅速降低時(shí)，原核生物和真核生物都表現(xiàn)出冷激反應(yīng)。酵母菌合成冷激蛋白（cold shock protein，Csp）來克服冷激對(duì)細(xì)胞存活能力的有害影響。JULSETH C R等[28]認(rèn)為嗜冷酵母菌有合成冷激蛋白的能力；另一方面，溫度升高時(shí)嗜冷酵母也可合成熱激蛋白（heat shock protein，Hsp）作為一種防御機(jī)制來克服溫度的變化。這兩方面的研究表明嗜冷酵母菌具有耐冷和適度的耐熱性（＞20℃），因此，這是嗜冷酵母菌能夠在永久和暫時(shí)的冷環(huán)境下存活的主要生態(tài)功能。耐冷酵母菌Guehomyces pullulans受到一系列的冷激來測(cè)試其合成冷激蛋白（Csp）能力，雙向電泳顯示不同的冷激蛋白（Csp）模式取決于溫度范圍。高于微生物最佳生長溫度，細(xì)胞生長抑制其誘導(dǎo)合成冷激蛋白（Csp）的能力。研究表明，冷休克的范圍可能影響由嗜冷酵母合成冷激蛋白（Csp）的類型。另一方面，熱休克增加了嗜冷酵母菌的耐熱性。

2.3 高分子冷凍保護(hù)劑的合成

眾所周知，低冷凍速率較低的情況下容易損害酵母菌細(xì)胞質(zhì)膜。因此，在凍結(jié)速率很低的條件下，冷凍保護(hù)劑（防凍劑）的合成在減少細(xì)胞損傷方面是至關(guān)重要的。其中，海藻糖生物合成途徑作為細(xì)胞抵御滲透壓力的有效方式廣泛存在在于自然界中[29]。在Mrakia frigida和Leucosporidium fellii中海藻糖高濃度細(xì)胞質(zhì)是降低胞內(nèi)流體的冰點(diǎn)主要機(jī)制。此外，PAN J等[30]報(bào)道，海藻糖通過阻止其自我分解穩(wěn)定了蛋白酶的低溫活性。

嗜冷酵母冷凍保護(hù)劑合成的其他機(jī)制也有所報(bào)道，LEE J K[9]等報(bào)道了一個(gè)北極Leucosporidium sp.菌株分泌糖基化冰結(jié)合蛋白（ice binding protein，IBP）。糖基化冰結(jié)合蛋白（IBP）表現(xiàn)出熱滯現(xiàn)象和重結(jié)晶抑制能力。該菌種全互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）序列已經(jīng)確定，其編碼一個(gè)26-氨基酸蛋白，分子質(zhì)量26.8 ku（包括一個(gè)N端信號(hào)肽和一個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)）。該蛋白質(zhì)與其他從真菌、細(xì)菌和硅藻和其他的冰活躍蛋白IBPs顯示出了較高的序列一致性。

2.4 分子代謝變化和生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)降低

分子和代謝的變化是在研究嗜冷酵母在不同的溫度變化時(shí)發(fā)現(xiàn)的。在極低溫度條件下，研究酵母生長代謝變化。辛明秀等[31]研究嗜冷和嗜中溫酵母糖酵解（embden-meyerhof-parhas pathway，EMP）途徑和三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）循環(huán)中關(guān)鍵酶的活性和穩(wěn)定性中發(fā)現(xiàn)。嗜冷酵母產(chǎn)生的酶在較低的溫度表現(xiàn)出較高的活性和弱熱穩(wěn)定性。AMATO P等[32]研究發(fā)現(xiàn)，嗜冷酵母在0℃以下仍能保持活躍代謝能力。在這些條件下，在經(jīng)過長時(shí)間的滯留凍結(jié)條件下細(xì)胞具有夠抵消和修復(fù)大分子損害的能力。嗜冷和嗜中溫酵母菌熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究較多，二分法觀察表明，微生物溫生長的最適溫度一般不同于最高酵母生物量生產(chǎn)的溫度。在一些情況下，菌株的來源影響允許最大增長速率的溫度。

2.5 低溫酶的合成

研究嗜冷酵母菌低溫條件下最多的嗜冷機(jī)制是低溫酶的合成。在低溫條件下，酶活性的增加是由于活性部位的修飾等結(jié)構(gòu)改變的靈活性所致[33]。

低溫酶可塑性的增強(qiáng)被認(rèn)為是其弱的熱穩(wěn)定性。這取決于對(duì)低溫條件的適應(yīng)能力，各種變性條件導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)其敏感度增加。這表明在低溫酶的活性和穩(wěn)定性之間的一個(gè)直接的聯(lián)系，低溫條件下保持活性需要能導(dǎo)致穩(wěn)定性降低的弱分子間力。

3 嗜冷酵母菌生物技術(shù)方面的應(yīng)用

3.1 低溫酶的生產(chǎn)

嗜冷酵母低溫酶的研究主要致力于發(fā)掘能夠冷水洗滌而且環(huán)保的添加劑（如脂酶）、紡織和生物燃料加工中多種纖維素酶和食品行業(yè)中的多種酶。低溫酶的優(yōu)勢(shì)在于：（1）在生物能源催化中潛在的經(jīng)濟(jì)效益（2）熱敏產(chǎn)品轉(zhuǎn)型和在中等溫度催化容易失活的產(chǎn)品。MAR A P D D等[33]研究發(fā)現(xiàn)的由前南極假絲酵母所產(chǎn)脂肪酶A和B可能是嗜冷酵母菌產(chǎn)低溫酶獲得專利的唯一例子。其中脂肪酶A產(chǎn)品為諾維信公司出售的Novozym 435，脂肪酶A在90℃以內(nèi)與其他的脂肪酶相比具有很好的穩(wěn)定性。

SHIVAJI S等[8]發(fā)現(xiàn)南極酵母Cryptococcus humicola能分泌一種胞外天冬氨酸蛋白酶（分子質(zhì)量=36 ku），這種細(xì)胞外蛋白酶的溫度范圍0～45℃均具有活性，37℃為最適溫度。低溫木聚糖酶可以用于在低溫降解農(nóng)業(yè)、工業(yè)和污水廢物。由淺白色隱球酵母Cryptococcus albidus產(chǎn)生的糖基化的木聚糖酶（338個(gè)氨基酸）的結(jié)構(gòu)被闡明。質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）分析顯示，N-糖基化僅發(fā)生在Asn254，改變了高甘露糖結(jié)構(gòu)[34]。此外PETRESCU I等[35]研究由南極酵母產(chǎn)糖基化的木聚糖酶，與其他的Cr.adeliensis所產(chǎn)木聚糖酶相比，該酶具有較低的熱穩(wěn)定性。在0～20℃低溫木聚糖酶表現(xiàn)出很高的催化效率，分子模型的分析表明，冷適應(yīng)性是由于三維結(jié)構(gòu)的離散變化。PAZGIERM等[36]研究由南極白冬孢酵母Leucosporidium antarcticum合成胞外的絲氨酸蛋白酶，35個(gè)N-端氨基酸殘基的序列顯示該蛋白酶與蛋白酶K有31%的同源性。該酶表現(xiàn)出低的最適溫度（25℃），弱熱穩(wěn)定性和在0～25℃高催化效率。

篩選產(chǎn)低溫酶的嗜冷酵母的研究越來越多，不同的酶如淀粉酶、蛋白酶、酯酶、果膠酶、丁質(zhì)酶和纖維素酶的生產(chǎn)主要取決于所選物種和菌株的來源[2-3]。MARGESIN R等[2-3]研究由嗜冷酵母產(chǎn)低溫酶（α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖糖苷酶、果膠裂解酶、木聚糖酶）培養(yǎng)條件（如pH值、溫度）對(duì)低溫酶活性和穩(wěn)定性的影響。

3.2 低溫降解污染物

嗜冷酵母在較低的溫度下能有效地降解酚類化合物和石油碳?xì)浠衔锏哪芰?，是生物技術(shù)應(yīng)用的另一個(gè)重要方面[2-3]。自然界中許多污染發(fā)生在河流、湖泊、及地下水等相對(duì)低溫的環(huán)境中，低溫會(huì)抑制微生物對(duì)有機(jī)污染物（如油和脂）的降解效果，而低溫微生物的代謝機(jī)制使他們能夠在低溫下很好的生長和代謝，因此在寒冷及低溫環(huán)境條件下應(yīng)用低溫微生物對(duì)污染物進(jìn)行降解處理越來越受到重視。

MARGESIN R等[2-3]從污染冰川棲息地分離篩選得到的嗜冷酵母菌在10℃降解石油烴類化合物，同時(shí)大約30%的菌株具有同化苯酚、菲和蒽的能力。所有的苯酚降解菌株具有鄰苯二酚-1,2-二加氧酶的活力。BERGAUER P等[21]從阿爾卑斯山冰凍圈篩選一組嗜冷酵母，該菌株在10℃具有降低酚和酚類環(huán)烴類化合物的能力，同時(shí)吸收一些低揮發(fā)性芳香化合物也是菌株特有的性能。研究表明，擔(dān)子菌類的嗜冷酵母在10℃條件下流加培養(yǎng)過程中完全降解12.5～15.0 mmol/L的苯酚，此外固定化可以提高酵母細(xì)胞降解苯酚的能力[2，37]。

3.3 其他化合物的生產(chǎn)

最近的研究表明，嗜冷酵母菌可以生產(chǎn)工業(yè)上常用的其他多種化合物。ALCHIHAB M等[14]研究低溫條件下由嗜冷酵母Rh.aurantiaca合成γ-癸內(nèi)酯。在14℃，發(fā)酵罐內(nèi)20 g/L蓖麻油的培養(yǎng)基可獲得6.6 g/L高產(chǎn)量的γ-癸內(nèi)酯。

另一方面，南極Cryptococcus flavus低溫條件下有產(chǎn)胞外多糖（expolysaccharides，EPS）的能力，24℃條件下可高產(chǎn)5.75 g/L胞外多糖（EPS）。

ROSSI M等[27，37-40]從阿爾卑斯山冰凍圈分離得到嗜冷酵母能在-3～20℃積累大量的胞內(nèi)脂質(zhì)（20%～70%）。因?yàn)樗鼈兡軌虮怀晒Φ赜糜谏a(chǎn)生物柴油（通過催化酯化反與短鏈醇），微生物油脂已經(jīng)獲得了越來越濃的興趣。

4 結(jié)語

耐冷酵母菌在低溫下如何保證細(xì)胞膜的流動(dòng)性和膜的通透性，如何維持胞質(zhì)中參與新陳代謝過程各類酶的活性都是低溫微生物適冷機(jī)制研究的重要內(nèi)容。耐冷酵母能夠合成具有高催化效率的低溫酶類在食品生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域具有獨(dú)特的研究和應(yīng)用價(jià)值，使得耐冷酵母菌資源逐漸引起人們的關(guān)注，正在成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。針對(duì)全球冰凍圈生態(tài)系統(tǒng)中嗜冷酵母菌生物多樣性的研究，對(duì)于豐富酵母菌物種、認(rèn)識(shí)酵母菌冷適應(yīng)機(jī)制、解密冷適應(yīng)的分子基礎(chǔ)、挖掘新的產(chǎn)低溫酶酵母菌資源顯得尤為重要。盡管如此，如何確保嗜冷酵母菌穩(wěn)定有效的利用仍然會(huì)面臨很多問題。（1）在世界各地冰凍圈進(jìn)行樣品采集中，菌種的富集條件需進(jìn)一步研究。（2）進(jìn)行大規(guī)模的篩選新的高產(chǎn)菌株（如低溫酶類、胞外多糖、多聚不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、γ-癸內(nèi)酯等），廣泛的應(yīng)用在食品、環(huán)保中。（3）在低溫條件下生產(chǎn)具有商業(yè)價(jià)值的生物制品[3]。

因此，考慮到長期的氣溫變化引起的全球冰凍圈的退化，會(huì)導(dǎo)致嗜冷微生物有瀕臨滅絕危險(xiǎn)，如何更好地保護(hù)和利用嗜冷微生物發(fā)揮其優(yōu)越的生物技術(shù)價(jià)值顯得尤為重要。

[1]CAVICCHIOLI R,TORTSEN T.Encyclopaedia of microbiology[M]. London:Academic Press,2000:317-337.

[2]MARGESIN R,FELLER G.Biotechnological applications of psychrophiles[J].Environ Technol,2010,31(8-9):835-844.

[3]MARGESIN R,MITEVA V.Diversity and ecology of psychrophilic microorganisms[J].Res Microbiol,2011,162(3):346-361.

[4]FONSECA A,SCORZETTI G,FELL J W.Diversity in the yeast Cryptococcus albidus and related species as revealed by ribosomal DNA sequence analysis[J].Can J Microbiol,2000,46(1):7-27.

[5]POINDEXTER J S.Encyclopedia of microbiology[M].Amsterdam:Elsevier,2009.

[6]BUZZINI P,BRANDA E,GORETTI M,et al.Psychrophilic yeasts from worldwide glacial habitats:diversity,adaptation strategies and biotechnological potential[J].FEMS Microbiol Ecol,2012,82(2):217-241.

[7]VISHNIAC H S.Biodiversity and ecophysiology of yeasts[M].Berlin: Springer,2006.

[8]SHIVAJI S,BHADRA B,RAO R S,et al.Rhodotorula himalayensis sp. nov.,a novel psychrophilic yeast isolated from Roopkund Lake of the Himalayan mountain ranges[J].Extremophiles,2008,12(3):375-381.

[9]LEE J K,PARK K S,PARK S,et al.An extracellular ice-binding glycoprotein from an Arctic psychrophilic yeast[J].Cryobiology,2010,60(2): 222-228.

[10]PATHAN A A,BHADRA B,BEGUM Z,et al.Diversityof yeasts from puddles in the vicinity of Midre lovénbreen Glacier,Arctic and bioprospecting for enzymes and fatty acids[J].Curr Microbiol,2010,60 (4):307-314.

[11]CONNELL L B,REDMAN R,RODRIGUEZ R,et al.Dioszegia antarctica sp.nov.and Dioszegia cryoxerica sp.nov.,psychrophilic basidiomycetous yeasts from polar desert soils in Antarctica[J].Int J Syst Evol Microbiol,2010,60:1466-1472.

[12]THOMAS-HALL S R,TURCHETTI B,BUZZINI P,et al.Cold adapted yeasts from Antarctica and the Italian Alps.Description of three novelspecies:Mrakia robertii sp.nov.,Mrakia blollopis sp.nov.and Mrakiella niccombsii sp.nov.[J].Extremophiles,2010,14(1):47-59.

[13]SCORZETTI G,PETRESCU I,YARROW D,et al.Cryptococcus adeliensis sp.nov.,a xylanase producing basidiomycetous yeast from Antarctica[J].Anton Leeuw,2000,77(2):153-157.

[14]ALCHIHAB M,DESTAIN J,AGUEDO M,et al.Production ofγ-decalactone by a psychrophilic and a mesophilic strain of the yeast Rhodotorula aurantiaca[J].Appl Biochem Biotechnol,2009,158(1): 41-50.

[15]POLI A,ANZELMO G,TOMMONARO G,et al.Production and chemical characterization of an exopolysaccharide synthesized by psychrophilic yeast strain Sporobolomyces salmonicolor AL1isolated from Livingston Island,Antarctica[J].Folia Microbiol,2010,55(6):576-581.

[16]ARENZ B E,HELD B W,JURGENS J A,et al.Fungal diversity in soils and historic wood from the Ross Sea Region of Antarctica[J].Soil Biol Biochem,2006,38:3057-3064.

[17]DMITRIEV V V,GILICHINSKY D A,FAIZUTDINOVA R N,et al. Occurrence of viable yeasts in 3-million-year-old permafrost in Siberia [J].Microbiology,1997,66:655-660.

[18]BIRGISSON H,DELGADO O,ARROYO L G,et al.Cold-adapted yeasts as producers of cold-active polygalacturonases[J].Extremophiles,2003,7(3):185-193.

[19]UETAKE J,KOHSHIMA S,NAKAZAWA F,et al.Evidence for propagation of cold-adapted yeast in an ice core from a Siberian Altai Glacier[J].J Geophys Res,2011,116(G1):1-8.

[20]姜遠(yuǎn)麗，鄭曉吉，倪永清，等.天山凍土中嗜冷酵母菌生物多樣性[J].食品生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012（31）：1289-1294.

[21]BERGAUER P,FONTEYNE P A,NOLARD N,et al.Biodegradation of phenol and phenol-related compounds by psychrophilic and cold-tolerant alpine yeasts[J].Chemosphere,2005,59(7):909-918.

[22]BUTINAR L,STRMOLE T,GUNDE-CIMERMAN N.Relativeincidence of ascomycetous yeasts in arctic coastal environments[J].MicrobEcol,2011,61(4):832-843.

[23]TURCHETTI B,BUZZINI P,GORETTI M,et al.Psychrophilic yeasts in glacial environments of Alpine glaciers[J].FEMS Microbiol Ecol, 2008,63(1):73-83.

[24]BRAND?O L R,LIBKIND D,VAZ A B,et al.Yeasts from an oligotrophic lake in Patagonia(Argentina):diversity,distribution and synthesis of photoprotective compounds and extracellular enzymes[J].FEMS Microbiol Ecol,2006,76(1):1-13.

[25]KURTZMAN C P,FELL J W,BOEKHOUT T.The yeasts,a taxonom ic study[M].Amsterdam:Elsevier,2003.

[27]ROSSI M,BUZZINI M,CORDISCO L,et al.Grow th,lipid accumulation,and fatty acids composition in obligate psychrophilic,facultative psychrophilic and mesophilic yeasts[J].FEMS Microbiol Ecol,2009, 69(3):363-372.

[28]JULSETH C R,INNISS W E.Heat shock protein induction and the acquisition of thermotolerance in the psychrotrophic yeast Trichosporon pullulans[J].Curr Microbiol,1990,20(6):391-396.

[29]KANDROR O,DELEON A,GOLDBERG A L.Trehalosesynthesis is induced upon exposure of Escherichia coli to cold and is essential for viability at low temperatures[J].P Natl Acad Sci USA,2002,99(15):9727-9732.

[30]PAN J,CHEN X L,SHUN C Y,et al.Stabilization of cold-adapted protease MCP-01 promoted by trehalose:prevention of the autolysis[J].Protein Pept Lett,2005,12(4):375-378.

[31]辛明秀，周培瑾.溫度對(duì)嗜冷酵母糖代謝途徑某些關(guān)鍵酶的活性效應(yīng)[J].微生物學(xué)報(bào)，2000，40（5）：518-522.

[32]AMATO P,DOYLE S,CHRISTNER B C.Macromolecular synthesis by yeasts under frozen conditions[J].Environ M icrobiol,2009,11(3):589-596.

[33]MAR A P D D,CARBONI-OERLEMANS C,TUIN B,et al.Biotechnological applications of Candida antarctica lipase A:state-of-the-art[J].J Mol Catal B Enzym,2005,37(1-6):36-46.

[34]AMORESANO A,ANDOLFO A,CORSARO MM,et al.Structural characterization of a xylanase from psychrophilic yeast by mass spectrometry[J].Glycobiology,2000,10(5):451-458.

[35]PETRESCU I,LAMOTTE-BRASSEUR J,CHESSA J P,et al.Xylanase from the psychrophilic yeast Cryptococcus adeliae[J].Extremophiles, 2000,4(3):137-144.

[36]PAZGIER M,TURKIEWICZ M,KALINOWSKA H,et al.Theunique cold-adapted extracellular subtilase from psychrophilic yeast Leucosporidium antarcticum[J].J M ol Catal B Enzym,2003,21:39-42.

[37]BUZZINI P,BRANDA E,GORETTI M,et al.Psychrophilic yeasts from worldw ide glacial habitats:diversity,adaptation strategies and biotechnological potential[J].FEMS M icrobiol Ecol,2012,82(2):217-241.

[38]KRALLISH I,GONTA S,SAVENKOVA L,et al.Phenol degradation by immobilized cold-adapted yeast strains of Cryptococcus terreus and Rhodotorula creatinivora[J].Extremophiles,2006,10(5):441-449.

[39]PAVLOVA K,PANCHEV I,KRACHANOVA M,et al.Production of an exopolysaccharide by Antarctic yeast[J].Folia Microbiol,2009,54 (4):343-348.

[40]AMARETTI A,RAIMONDI S,SALA M,et al.Single cell oils of the cold-adapted oleaginous yeast Rhodotorula glacialis DBVPG 4785[J].Microb Cell Fact,2010(9):73-78.

Psychrophilic yeasts from worldwide glacial habitats:diversity,adaptation strategies and application

ZHENG Xiao ji,SHI Xuewei,DONG Juan,JIANG Yuanli,GUAN Bo,NI Yongqing*

(School of Food Sciences,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Cryosphere psychrophilic yeasts include some of the largest unexplored and extreme biospheres on earth,and these habitats harbor a w ide diversity of psychrophilic prokaryotic and eukaryotic microorganisms.These microorganisms have developed adaptation strategies to overcome the effect of low temperature,oligotrophic,intense radiation,freeze thawing and extreme factors.For many years,Antarctica has been the geographic area preferred by microbiologists for studying the diversity of psychrophilic microorganisms(including yeasts).However,there have been an increasing number of studies on psychrophilic yeasts sharing the non-Antarctic cryosphere.The present paper provided an overview of the diversity and adaptation strategies of psychrophilic yeasts worldwide,aiming to reveal the potential development of psychrophilic yeast,especially on their exploitation as a source of cold-active enzymes and for bioremediation purposes.

glacial cryosphere;psychrophilic yeasts;diversity;adaptation strategies

Q939.97

A

0254-5071（2015）03-0005-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.002

2015-03-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41140009、41271268）；石河子大學(xué)優(yōu)秀青年項(xiàng)目（2012ZRKXYQ14）

鄭曉吉（1982-），男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槭壤浣湍妇鄻有浴?/p>

*通訊作者：倪永清（1969-），男，教授，博士，研究方向?yàn)闃O端微生物資源開發(fā)及應(yīng)用。