李鳳霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草重要基因篇：9.煙草雄性不育和育性恢復(fù)基因

李鳳霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

植物雄性不育（male sterility，MS）既是植物生殖生物學(xué)研究中的一個重要植物學(xué)性狀，也是研究作物雜種優(yōu)勢利用的一個重要農(nóng)藝性狀，在作物育種和分子生物學(xué)研究中具有重要地位［1］。植物雄性不育可分為細胞核雄性不育（genic male sterility， GMS）和細胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility， CMS）。GMS由核不育基因控制，無正反交遺傳效應(yīng)；CMS由線粒體不育基因和核恢復(fù)基因（restorer of fertility，Rf）共同調(diào)控，線粒體基因?qū)е虏挥?，Rf能改變線粒體中不育基因的表達，使不育系恢復(fù)育性。煙草是葉用作物，生產(chǎn)上可使用不育系，目前不育系種植面積占整個烤煙種植面積的一半左右。Sua-CMS是我國煙草育種和生產(chǎn)中使用的唯一不育類型，其不育胞質(zhì)來源于煙草野生種Nicotiana suaveolens。

1　煙草細胞核雄性不育基因

細胞核雄性不育是由核基因控制的雄性不育，在花粉發(fā)育過程中，任何代謝相關(guān)的基因變異以及光、溫度等環(huán)境因素改變都可能導(dǎo)致雄性不育。絨氈層位于花粉囊壁的最內(nèi)層，對花粉的生長發(fā)育至關(guān)重要，水稻msp1突變體絨氈層完全缺失，表現(xiàn)出不育［2］。擬南芥dyt1（dysfunctional tapetum1）突變體的絨氈層細胞高度液泡化并缺少正常細胞質(zhì)，DYT1控制胼胝質(zhì)分解并影響絨氈層分化，是導(dǎo)致不育的關(guān)鍵基因［3］。利用TA29啟動子和野生花生的半胱氨酸蛋白酶基因（AdCP）融合轉(zhuǎn)化煙草，也能使煙草不育［4］。COI1是JA受體的重要組成部分，將煙草NtCOI1通過RNAi敲除后，NtCOI1下調(diào)的煙草植株花粉淀粉代謝異常，花蜜喪失，花粉敗育，進一步分析表明NtMYB305在不育株中下調(diào)［5］。

2　煙草細胞質(zhì)雄性不育基因

線粒體是植物細胞質(zhì)雄性不育的育性因子載體，線粒體編碼基因的缺失或功能異常是導(dǎo)致植物育性發(fā)生變化的一個原因。水稻野敗不育類型（CMS-WA）的不育控制基因為線粒體編碼的WA352，WA352蛋白只在花粉母細胞期的絨氈層特異積累，并與核基因編碼的線粒體定位蛋白COXII進行互作，由此抑制了COXII在過氧化物代謝中發(fā)揮功能，觸發(fā)了絨氈層過早程序性細胞死亡及隨后的花粉敗育［6］。在林煙草（N. sylvestris）的兩個線粒體編碼基因nad7缺失品系CMSI、CMSII中，其花粉和絨氈層細胞中的呼吸作用有60%受到了抑制，而且其植株的生長和葉的表型均受到影響［7］，該不育突變體在充足光源的條件下會有少量的可育花粉產(chǎn)生。普通煙草線粒體DNA全長430597 bp，包含36個蛋白質(zhì)編碼基因，其中負責(zé)編碼電子傳遞鏈及氧化磷酸化過程復(fù)合體I-VI部分亞基的基因有20個［8］。已有研究表明，其中的nad7［9］、coxII［10］、atp1［11］、atp4［12-13］、atp6［14］和 atp9［15-16］等基因在煙草不育系與其同型保持系間存在差異，可能影響到線粒體電子傳遞鏈及氧化磷酸化過程相關(guān)酶的正常功能。張長靜等［17］通過對38個線粒體編碼基因的研究發(fā)現(xiàn)，在Sua-CMS中，線粒體編碼基因sdh3、sdh4在其編碼蛋白各結(jié)構(gòu)層次上存在差異，sdh4基因在不育系中第28位堿基發(fā)生了改變，sdh3基因發(fā)生10個堿基的缺失，以致其編碼蛋白改變，這極可能成為干擾線粒體琥珀酸脫氫酶亞基功能的關(guān)鍵因素，可能是導(dǎo)致煙草Sua-CMS的原因之一。

同時，由于植物線粒體基因組具有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA編輯普遍存在的特點，使得不育系中線粒體編碼基因的改變（SNPs和Indels）可能對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物沒有影響，如在玉米CMS-T、CMS-C、CMS-S不育系中，線粒體編碼基因改變的有20個，但其多數(shù)在轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有差異［18］，在水稻兩個CMS類型中也發(fā)現(xiàn)同樣的研究結(jié)果［19］。Suzuki 等［20］在棉花線粒體上的8個編碼基因上發(fā)現(xiàn)了大量的RNA編輯位點，如apt6的RNA編輯產(chǎn)生了終止突變。

3　煙草育性恢復(fù)與PPR基因

PPR蛋白（pentatricopeptide repeat，三角狀五肽重復(fù)）是指以35個氨基酸殘基組成的PPR結(jié)構(gòu)域為單位，進行2～27個PPR串聯(lián)重復(fù)的蛋白。PPR是高等植物中最大的基因家族之一，在介導(dǎo)植物細胞器基因的表達上起著重要作用，能調(diào)節(jié)葉綠體和葉綠體基因的表達或RNA的剪接、編輯、加工和翻譯等［21］。

Ding等［22］在絨毛狀煙草基因組中鑒定了487個PPR編碼基因，該基因家族較均勻地分布在絨毛狀煙草12條染色體上，其中61%的基因無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，74%的PPR基因具有RNA結(jié)合活性。

研究發(fā)現(xiàn)，除水稻Rf2、Rf17外，目前已鑒定的Rf基因均編碼PPR蛋白，如矮牽牛Rf-PPR592［23］，油菜Rfo［24］，水稻Rf1、Rf5和Rf6［25］、Rf1a、Rf1b［26］，蘿卜Rfk1［27］，高粱Rf1和Rf2［28］，而且Rf基因均含有線粒體定位序列。Ding等［22］將克隆的6個煙草PPR基因進行組織特異性表達，發(fā)現(xiàn)它們在煙草組織中均有表達，而且在不育材料中表達量高于同型保持系；通過NtomRf4和NtomRf5基因特異序列的RNA干擾表明，雖然NtomRf4和NtomRf5基因在轉(zhuǎn)基因陽性植株中的表達量下降了57.1%～85.3%，但仍有可檢測的表達量，也具有花粉活性，推測可能煙草Sua-CMS不育性發(fā)生的機制非常復(fù)雜，不能為單一Rf基因恢復(fù)育性。

4　問題與展望

雄性不育煙草在我國使用已有40多年的歷史，從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所最初引進MS白肋21×Ky10的F1代，并以此為不育來源，多家育種單位展開了煙草品種的回交轉(zhuǎn)育工作，獲得了目前生產(chǎn)上使用的所有不育材料。由于煙草是葉用作物，雜交種可以是不育的，因而無需像谷類作物那樣“三系配套”，只要有雄性不育系和保持系就可以了，這也使煙草育性恢復(fù)研究進度較慢，目前不育系和多個品種雜交試驗都證明煙草不育系的保持系易獲得，而育性恢復(fù)材料篩選困難，這也是煙草恢復(fù)基因難以鑒定的一個重要原因。野生種包含豐富的變異，從煙草野生種中嘗試恢復(fù)煙草不育系的育性可能是一個可選的方法，目前我們也正在進行這方面的嘗試。

參考文獻

［1］Chen L， Liu Y G. Male sterility and fertility restoration in crops［J］. Annu Rev Plant Biol， 2014， 65： 579-606.

［2］Nonomura K， Miyoshi K， Eiguchi M， et al. The MSP1 gene is necessary to restrict the number of cells entering into male and female sporogenesis and to initiate anther wall formation in rice［J］. Plant Cell， 2013， 15：1728-1739.

［3］Zhang W， Sun Y， Timofejeva L， et al. Regulation of Arabidopsis tapetum development and function by DYSFUNCTIONAL TAPETUM1 （ DYT1 ） encoding a putative bHLH transcription factor［J］. Development， 2006， 133： 3085-3095.

［4］Shukla P， Singh N K， Kumar D， et al. Expression of a pathogen-induced cysteine protease （AdCP） in tapetum results in male sterility in transgenic tobacco［J］. Funct Integr Genomics. 2014， 14： 307-317.

［5］Wang W， Liu G， Niu H， et al. The F-box protein COI1 functions upstream of MYB305 to regulate primary carbohydrate metabolism in tobacco （Nicotiana tabacum L. cv. TN90） ［J］. J Exp Bot， 2014， 65： 2147-2160.

［6］Luo D， Xu H， Liu Z， et al. A detrimental mitochondrial-nuclear interaction causes cytoplasmic male sterility in rice［J］. Nat Genet，2013， 45： 573-577.

［7］Sabar M， De Paepe R， de Kouchkovsky Y. Complex I impairment， respiratory compensations， and photosynthetic decrease in nuclear and mitochondrial male sterile mutants of Nicotiana sylvestris［J］. Plant Physiol， 2000， 124： 1239-1250.

［8］Sugiyama Y， Watase Y， Nagase M， et al. The complete nucleotide sequence and multipartite organization of the tobaccomitochondrial genome： comparative analysis of mitochondrial genomes in higher plants［J］. Mol Gen Genomics， 2005， 272：603-615.

［9］Pla M， Mathieu C， De Paepe R， et al. Deletion of the last two exons of the mitochondrial nad7 gene results in lack of the NAD7 polypeptide in a Nicotiana sylvestris CMS mutant［J］．Mol Gen Genet， 1995， 248： 79-88.

［10］ 朱騰義，范東東，趙婷．煙草線粒體基因coxII的SNP檢測及其與CMS的相關(guān)性分析［J］．核農(nóng)學(xué)報，2010（4）：720-727.

［11］ Bergman P， Edqvist J， Farbos I， et al. Male-sterile tobacco displays abnormal mitochondrial atp1 transcript accumulation and reduced floral ATP/ADP ratio［J］. Plant Mol Biol， 2000， 42： 531-544.

［12］ 周瑋，黃河，周伯楠，等．煙草CMS相關(guān)基因orf25的生物信息學(xué)分析［J］．中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（5）：312-316．

［13］ 劉齊元，朱滕義，趙婷，等．異常線粒體基因ORF25可能導(dǎo)致煙草雄性不育［J］．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，31（1）：54-62．

［14］ 趙婷，朱滕義，劉齊元，等．煙草線粒體基因atp6的SNP及其與CMS的相關(guān)性［J］．作物學(xué)報，2009，35（9）：1655-1661．

［15］ Hernould M， Suharsono S， Zabaleta E， et al. Impairment of tapetum and mitochondria in engineered male-sterile tobacco plants［J］. Plant Mol Biol， 1998， 36： 499-508.

［16］ 周瑋，劉齊元，陳雪峰，等．與煙草細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的線粒體基因atp9的mRNA研究［J］．廣西植物，27（1）：114-12．

［17］ 張長靜，李鳳霞，賈興華，等．細胞質(zhì)雄性不育煙草線粒體基因片段sdh3和sdh4的生物信息學(xué)分析［J］. 中國煙草科學(xué)，2013，34（3）：42-47.

［18］ Allen J O， Fauron C M， Minx P， et al. Comparisons among two fertile and three male-sterile mitochondrial genomes of maize［J］. Genetics， 2007， 177： 1173-1192.

［19］ Fujii S， Kazama T， Yamada M， et al. Discovery of global genomic re-organization based on comparison of two newly sequenced rice mitochondrial genomes with cytoplasmic male sterility-related genes［J］. BMS Genomics， 2010， 11： 209.

［20］ Suzuki H， Yu J， Ness S A， et al. RNA editing events in mitochondrial genes by ultra-deep sequencing methods： a comparison of cytoplasmic male sterile， fertile and restored genotypes in cotton［J］. Mol Genet Genomics， 2013， 288： 445-457.

［21］ Lurin C， Andres C， Aubourg S， et al. Genome-wide analysis of Arabidopsis pentatricopeptide repeat proteins reveals their essential role in organelle biogenesis［J］. Plant Cell， 2004， 16： 2089-2103.

［22］ Ding A M， Li F X， Chen Y Q， et al. Homology-based cloning and expression analysis of Rf genes encoding PPR-containing proteins in tobacco［J］. Genet Mol Res， 2014， 13： 2310-2322.

［23］ Bentolila S， Alfonso A A， Hanson M R. A pentatricopeptide repeat-containing gene restores fertility to cytoplasmic male-sterile plants［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99： 10887-10892.

［24 ］ Brown G G， Formanova N， Jin H， et al. The radish Rfo restorer gene of Ogura cytoplasmic male sterility encodes a protein with multiple pentatricopeptide repeats［J］. Plant J， 2003， 35： 262-272.

［25］ Wang K， Gao F， Ji Y， et al. ORFH79 impairsmitochondrial function via interaction with a subunit of electron transport chain complex III in Honglian cytoplasmic male sterile rice［J］. New Phytol， 2013， 198： 408-418.

［26］ Wang Z H， Zou Y J， Li X Y， et al. Cytoplasmic male sterility of rice with boro II cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two related PPR motif genes via distinct modes of mRNA silencing［J］. Plant Cell， 2006， 18： 676-687.

［27］ Imai R， Koizuka N， Fujimoto H， et al. Delimitation of the fertility restorer locus Rfk1 to a 43-kb contig in Kosena radish （Raphanus sativus L.） ［J］. Mol Genet Genomics， 2003， 269： 388-394.

［28］ Klein R R， Klein P E， Mullet J E， et al. Fertility restorer locus Rf1of sorghum （Sorghum bicolor L.） encodes a pentatricopeptide repeat protein not present in the colinear region of rice chromosome12［J］. Theor Appl Genet， 2005， 111： 994-1012.