文∕徐亞麥 趙澤民 褚曉波

（黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司）

膽堿是人類生長過程中不可缺少的一種水溶性維生素，研究表明膽堿具有促進(jìn)腦發(fā)育和提高記憶能力的作用。膽堿對胎兒的發(fā)育極其重要，尤其是在大腦發(fā)育階段，它能影響神經(jīng)管的閉合、終生記憶力和學(xué)習(xí)能力。試驗(yàn)證明，在嬰幼兒時(shí)期攝入適量的膽堿能夠幫助提升寶寶的記憶能力。聯(lián)合國標(biāo)準(zhǔn)中已將膽堿列為嬰兒配方食品中的必需成分，我國1994年就已發(fā)布的GB 14880《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中也規(guī)定了膽堿可以用于嬰幼兒配方奶粉，并于1997年頒布了膽堿含量測定的國標(biāo)方法GB/T 5413.20《嬰幼兒配方食品和乳粉膽堿的測定》。

隨著膽堿在嬰幼兒奶粉和食品中使用的越來越廣泛，膽堿含量的測定愈來愈受到人們的重視，檢測方法也得到了發(fā)展。目前對膽堿含量的檢測方法有高效液相色譜法、液質(zhì)法、離子色譜法、酶比色法、雷氏鹽法，甚至還有酶聯(lián)免疫試劑盒法。這些方法中，傳統(tǒng)方法操作繁瑣，干擾因素多；儀器分析和試劑盒法對儀器要求比較高，不易推廣應(yīng)用；現(xiàn)行國標(biāo)酶比色法所需酶種類多，不易購買，實(shí)驗(yàn)操作也較難控制。而本實(shí)驗(yàn)所采用的雷氏鹽比色法以所需試驗(yàn)器材簡單、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)而受到多數(shù)乳品企業(yè)的歡迎。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

試樣中的膽堿用氫氧化鋇—甲醇—三氯甲烷混合溶液水解抽提，經(jīng)弗羅里硅土層析凈化，與雷納克銨鹽溶液形成粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，用丙酮溶解洗脫，于526 nm測定吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，膽堿雷納克銨鹽顏色的深淺與其含量成正比。

1.2 試劑

本實(shí)驗(yàn)中所用試劑除特殊指明外均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的三級水。

弗羅里硅土：100～200 目，650 ℃活化。

飽和氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷溶液：稱取6 g氫氧化鋇溶于100 mL甲醇中，超聲溶解后加入10 mL三氯甲烷，混勻。

冰乙酸-甲醇溶液：體積比1∶10。

雷納克銨鹽溶液：稱取0.25 g雷納克銨鹽，加入10 mL水中，超聲10～20 min，用濾紙過濾，濾液備用。該溶液要根據(jù)實(shí)際用量現(xiàn)用現(xiàn)配，避免損失。

膽堿酒石酸氫鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度為1 g/L，準(zhǔn)確稱取在（102±2）℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽0.1000 g，用水定容至100 mL容量瓶中。

注意：為了保證實(shí)驗(yàn)效果，所有溶液均需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 儀器

250 mL磨口三角瓶；回流管；恒溫水浴鍋；層析柱（長約10 cm、內(nèi)徑1 cm的帶50 mL杯口的玻璃柱，使用前用乳膠管連接層析柱與滴頭，用少量脫脂棉堵住底部，倒入5～10 cm高的弗羅里硅土，用少量甲醇浸濕）；紫外分光光度計(jì)（日本島津，UV1700）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試樣制備

稱取奶粉樣品10.00 g于磨口三角瓶中，加入50 mL 氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷抽提液，于（79±2）℃水浴鍋內(nèi)水解抽提4 h。水解過程要經(jīng)常搖動，避免結(jié)塊。水解后冷至室溫，過濾，濾渣用冰乙酸-甲醇混合液洗滌3～4 次，洗液一并收集于100 mL容量瓶中。用甲醇定容。

1.4.2 凈化與顯色

依次向?qū)游鲋屑尤?0 mL水解液、15 mL甲醇、20 mL乙酸甲酯、5 mL雷納克銨鹽溶液。凈化時(shí)，層析柱中每一種試劑排凈后方可加入下一種試劑。之后用冰乙酸洗去過量的雷氏鹽，最后用丙酮溶解、洗脫膽堿雷氏鹽粉紅色譜帶，收集洗脫的紅色丙酮溶液于10 mL容量瓶中，用丙酮定容。

標(biāo)準(zhǔn)溶液分別吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL注入層析柱中，按試樣凈化步驟操作。

用丙酮調(diào)零，在波長526 nm處測定試樣及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣膽堿含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)過程中尤其要注意水解溫度，溫度過低樣品水解不充分，溫度太高又會導(dǎo)致膽堿損失，因此要嚴(yán)格控制水解溫度。

2.2 為保證水解充分，水解時(shí)，水浴溶液要沒過磨口三角瓶內(nèi)的樣品溶液。水解過程要時(shí)時(shí)搖動，避免結(jié)塊。若發(fā)生結(jié)塊，可以用玻璃棒打碎結(jié)塊，掛壁的結(jié)塊用玻璃棒刮下來，之后再用少量抽提液將玻璃棒沖洗干凈。

2.3 制備層析柱時(shí)，脫脂棉的作用是防止弗羅里硅土脫落，脫脂棉使用太多將影響凈化速度。因此脫脂棉的使用量要盡量少，能擋住弗羅里硅土即可。

2.4 弗羅里硅土不能重復(fù)使用。

2.5 用冰乙酸洗脫時(shí)，不要一次性加入，要分2～3 次洗滌，直至流出的液體為無色。冰乙酸總消耗量約為20 mL，濃度為99%。

2.6 用丙酮洗脫時(shí)也要分2～3 次洗滌，這樣可以避免洗脫不徹底，結(jié)果偏低的問題。洗脫液若混濁，可以用0.45 μm濾膜過濾。

3 結(jié)論

采用雷氏鹽比色法測定嬰幼兒奶粉中的膽堿含量，方法檢出限為5 mg/100 g，精密度為8%。該方法準(zhǔn)確、快速、簡便、重現(xiàn)性好，適合乳品企業(yè)對嬰幼兒奶粉中膽堿含量的日常監(jiān)控。

[1]GB 5413.20—2013 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定.

[2]趙紅霞，郝萬清.雷氏鹽比色法檢測嬰幼兒配方乳粉中膽堿含量.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2012（2）：41-43.

[3]顧秀英，歐菊芳，楊琳，等.離子色譜法測定奶粉中膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù).中國乳品工業(yè)，2011（7）：47-49.

[4]張麗娟，李偉英.嬰兒奶粉及食品中膽堿的測定.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，1993（2）：207-211.

[5]黃麗，劉京平，容曉文.在線滲析-離子色譜法直接測定奶粉中膽堿.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008（3）：444-445.