戴星++++++周靜++++++胡鳴++++++孫玉芳

[摘要] 目的 探討子宮內(nèi)膜異位癥患者缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)及相關(guān)性，兩者在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中的意義。 方法 采用免疫組織化學(xué)ElivisionTM二步法分別檢測(cè)30例子宮內(nèi)膜異位癥（實(shí)驗(yàn)組）異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜，以及30例正常子宮內(nèi)膜（對(duì)照組）中HIF-1α和VEGF的表達(dá)，并對(duì)兩者表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。 結(jié)果 HIF-1α在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位及在位內(nèi)膜中的表達(dá)水平均強(qiáng)于正常子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且在異位內(nèi)膜中的表達(dá)水平強(qiáng)于在位內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位及在位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)于正常子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且在異位內(nèi)膜中的表達(dá)強(qiáng)于在位內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各組中的增生期和分泌期表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 HIF-1α與VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜中的表達(dá)增高，且呈正相關(guān)。HIF-1α可能通過(guò)VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜異位癥；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；免疫組織化學(xué)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R711.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）12（b）-0017-04

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女的常見(jiàn)病、多發(fā)病，近年來(lái)其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]，已成為嚴(yán)重影響婦女身心健康與生育功能的難以治愈的疾病。盡管子宮內(nèi)膜異位癥是良性疾病，但它卻有著惡性腫瘤類(lèi)似的生物學(xué)特性，諸如侵襲、種植，甚至很可能遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，新生血管的生成是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵一環(huán)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能夠特異性地作用在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，是眾多促血管生成因子中最重要的一個(gè)[2]，不僅能促使新生血管的生成，而且在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用[3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是一種關(guān)鍵性的調(diào)控因子，它介導(dǎo)了細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境適應(yīng)的反應(yīng)，并在腫瘤侵襲過(guò)程中形成新生血管的環(huán)節(jié)上發(fā)揮著重要的作用。本研究旨在探討HIF-1α、VEGF與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并探討其如何發(fā)揮作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象來(lái)源于南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2011年1月～2014年1月的手術(shù)病例。實(shí)驗(yàn)組為子宮內(nèi)膜異位癥患者30例，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)，獲取異位病灶及子宮內(nèi)膜，其中增生期20例，分泌期10例，平均年齡（44.07±7.49）歲；對(duì)照組為因子宮肌瘤行子宮切除、盆腔結(jié)構(gòu)正常的患者30例，獲取子宮內(nèi)膜，其中增生期18例，分泌期12例，平均年齡（46.10±5.19）歲。所選病例術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用過(guò)激素類(lèi)藥物，未接受放療、化療及手術(shù)治療，均無(wú)其他免疫疾病、急性炎癥及其他腫瘤病史。所取的組織標(biāo)本全部經(jīng)病理學(xué)確診，月經(jīng)周期按第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》教材，經(jīng)HE染色后分為增生期及分泌期。

1.2 主要試劑

鼠抗人VEGF單克隆抗體（即用型）、免疫組織化學(xué)ElivisionTM試劑盒、DAB染色試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。兔抗人HIF-1α多克隆抗體為濃縮劑，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；試驗(yàn)時(shí)稀釋濃度為1∶50。

1.3 方法

所有標(biāo)本均由10%甲醛固定、石蠟包埋，連續(xù)3 μm切片，采用免疫組織化學(xué)ElivisionTM二步法非生物素檢測(cè)系統(tǒng)，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判斷

HIF-1α的蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要表達(dá)在腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，顯微鏡下可見(jiàn)呈棕黃色顆粒。VEGF蛋白陽(yáng)性主要表達(dá)在內(nèi)膜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的判定均參照Birner等[4]半定量測(cè)定的方法，據(jù)高倍鏡下綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行判定。著色弱但明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照者為1分，染色清晰者為2分，染色強(qiáng)者為3分；陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的判定：10%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。以上兩項(xiàng)評(píng)分相加，陽(yáng)性細(xì)胞<10%為（-），3分為弱陽(yáng)性（+），4～5分為陽(yáng)性（++），6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用精確概率法以及χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α的表達(dá)

HIF-1α蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.00%（24/30）、53.33%（16/30）、0（0/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=40.320，P<0.01）。在異位內(nèi)膜中的表達(dá)高于在位內(nèi)膜（χ2=4.8，P<0.05）；在異位和在位內(nèi)膜中的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜（χ2=21.818，P<0.01）。異位和在位內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜中增生期和分泌期的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 HIF-1α的表達(dá)（n）

2.2 VEGF的表達(dá)

VEGF蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.33%（25/30）、60.00%（18/30）、6.67%（2/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.067，P<0.01）。在異位內(nèi)膜中的表達(dá)高于在位內(nèi)膜（χ2=4.022，P<0.05）；在異位和在位內(nèi)膜中的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜（χ2=19.100，P<0.01）。異位和在位內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜中增生期和分泌期的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

表2 VEGF的表達(dá)（n）

2.3 HIF-1α與VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析

子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜中HIF-1α與VEGF表達(dá)的相關(guān)系數(shù)為0.635（P<0.01）（表3），說(shuō)明HIF-1α與VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜中的表達(dá)均呈正相關(guān)。

表3 HIF-1α與VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是一種核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，存在于哺乳動(dòng)物或人體內(nèi)，能夠在低氧條件下促使細(xì)胞對(duì)缺氧狀態(tài)進(jìn)行適應(yīng)性應(yīng)答。α和β分別是它的兩個(gè)亞單位，其中能決定HIF-1的活性的、唯一的氧分子調(diào)節(jié)亞單位即是HIF-1α[5]。人HIF-1α基因定位于14號(hào)染色體q21～24區(qū)，其cDNA長(zhǎng)3720 bp，可編碼含有826個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。Simon等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在低氧狀態(tài)進(jìn)行應(yīng)答時(shí)起全局調(diào)控的作用，可以激活100多種低氧適應(yīng)性基因的表達(dá)，在血管發(fā)生及重建、細(xì)胞凋亡、紅細(xì)胞生成、糖酵解等的各個(gè)方面。HIF-1α能夠調(diào)節(jié)血管形成的各個(gè)階段，也是缺氧狀態(tài)下血管生成的關(guān)鍵性的調(diào)控因子[8-10]。Sharkey等[11]研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制之一就是在缺氧的條件下新生血管大量地形成。本研究結(jié)果中，HIF-1α在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜中呈高表達(dá)，在正常子宮內(nèi)膜中呈低表達(dá)，組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與任旭等[12]的報(bào)道一致，由此提示異位灶組織中HIF-1α有異常的生物學(xué)活性，與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生密切相關(guān)，在子宮內(nèi)膜異位癥的早期，異位和在位的內(nèi)膜相對(duì)處于缺氧狀態(tài)，引起細(xì)胞過(guò)度表達(dá)HIF-1α，促使新生血管形成，因而缺氧可能是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的一個(gè)誘因。HIF-1α在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜的表達(dá)明顯強(qiáng)于正常子宮內(nèi)膜，提示發(fā)生子宮內(nèi)膜異位癥的原因其中之一可能是月經(jīng)期脫落的子宮內(nèi)膜處在缺氧的狀態(tài)。

HIF-1α調(diào)節(jié)血管生成的作用主要是通過(guò)其靶基因VEGF實(shí)現(xiàn)的[13]。目前得到公認(rèn)的、最強(qiáng)的促血管生成因子就是VEGF，它是血小板衍生生長(zhǎng)因子超家族的成員，分子量為34～36 kDa，是一種多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子。人類(lèi)的VEGF基因位于6p21.3染色體，含有7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子，全長(zhǎng)28 kb。它通過(guò)自分泌和旁分泌共同作用，與血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，有強(qiáng)大的促內(nèi)皮增生、促血管生成作用[14]，因此可促進(jìn)異位病灶的形成。VEGF表達(dá)高低直接反映了該組織的血管生成的活性。Maclaren等[15]研究顯示，實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜異位癥患者異位病灶和腹腔液中的VEGF呈高表達(dá)，明顯強(qiáng)于對(duì)照組，且新鮮紅色病灶中VEGF的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于顏色較暗的陳舊病灶，說(shuō)明紅色病灶屬于異位內(nèi)膜種植的初始階段，血管生成十分活躍，也證實(shí)了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生依賴(lài)于新血管的形成。本研究結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位及在位內(nèi)膜中，VEGF高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.33%和63.33%，明顯高于正常子宮內(nèi)膜中的6.67%，與王春紅等[16]的報(bào)道一致，提示在子宮內(nèi)膜異位癥的血管形成中，VEGF起到了非常重要的作用，其具有更強(qiáng)的血管生長(zhǎng)能力及增殖活性。VEGF含量的增高提示子宮內(nèi)膜血管生成增多，因此這可能是子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜能夠成功種植，進(jìn)一步生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的核心步驟和必備條件。

在VEGF的表達(dá)的調(diào)控中，多種因素共同作用，其中缺氧是誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的核心因素。HIF-1α能夠在多個(gè)層面上[8，17]，在基因水平上廣泛調(diào)控VEGF的表達(dá)：它不僅能夠啟動(dòng)VEGF的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)VEGF mRNA的蛋白質(zhì)翻譯，還可以上調(diào)VEGF受體的轉(zhuǎn)錄。因此，在組織缺氧時(shí)，HIF-1α被激活，HIF-1α高表達(dá)導(dǎo)致VEGF的表達(dá)增加，VEGF與存在于血管內(nèi)皮表面的特異性受體（VEGFR1和VEGFR2）結(jié)合，從而發(fā)揮強(qiáng)大的促血管生成的作用，促使新生血管形成。然而，新生血管的結(jié)構(gòu)不如正常血管結(jié)構(gòu)完善，并不能改善組織缺氧，反而誘發(fā)更多的生長(zhǎng)因子和新生血管形成。隨著異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)，血液供應(yīng)的相對(duì)不足，又引起缺氧，缺氧又反饋引起VEGF的表達(dá)，周而復(fù)始，促使子宮內(nèi)膜異位癥不斷發(fā)展。本研究顯示在子宮內(nèi)膜異位癥中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，表明VEGF正是通過(guò)HIF-1α的調(diào)節(jié)，促進(jìn)異位灶的血管形成，致使異位內(nèi)膜更易于種植在腹膜的表面，存活并增殖，病灶不斷擴(kuò)大，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)一步發(fā)展。

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是多因素綜合的動(dòng)態(tài)發(fā)展過(guò)程，至今為止，發(fā)病機(jī)制仍在深入探索中。子宮內(nèi)膜的異位種植和生長(zhǎng)離不開(kāi)充足的血液供應(yīng)，新血管的形成是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。因此，抑制血管生成可能成為子宮內(nèi)膜異位癥預(yù)防和治療的新領(lǐng)域。HIF-1α和VEGF的研究有可能成為預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜異位癥的新方法。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Cho S，Choi Y S，Jeon Y E，et al.Expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） and its soluble receptor-1 in endometriosis[J].Microvasc Res，2012，83（2）：237-242.

[2] Barcz E，Ploski R，Malejczyk J，et al.An inverse association with vascular endothelial growth factor concentration[J].Fertil Steril，2012，97（6）：1380-1386.

[3] 史淑紅，李佃貴，馬秀菊.子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其可溶性受體的測(cè)定[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（10）：976-978.

[4] Birner P，Schindl M，Obermair A，et al.Overexpression of hypoxiain-ducible Factor-1α is a marker for an unfavorable prognosis in early-stage invasive cervical cancer[J].Cancer Res，2000，60（17）：4693.

[5] Zhou J，Schmid T，Schnitzer S，et al.Tumor hypoxia and cancer p rogression[J].Cancer Lett，2006，237（1）：10-21.

[6] Simon MC.Siah proteins，HIF prolyl hydroxylases，and the physiological response to hypoxia[J].Cell，2004，117（7）：851-853.

[7] Shi YH，Wang YX，Bingle L，et al.In vitro study of HIF-lactivation and VEGF release by bFGF in the T47D breast cancer cell line under normoxic conditions：involvement of PI-3K/Akt and MEK1/ERK pathways[J].J Pathol，2005，205（4）：530-536.

[8] Pugh CW，Ratcliffe PJ.Regulation of angiogenesis by hypoxia：role of the HIF system[J].Nat Med，2003，9（6）：677-684.

[9] Mazure NM，Brahimi-Horn MC，Pouyssegur J.Protein kinases and the hypoxia-inducible factor-1，two swiches in angiogenesis[J].Curr Pharm Des，2003，9（7）：531-541.

[10] Hellstrsm M，Phng LK，Hofmann JJ，et al.D114 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis[J].Nature，2007，445（7129）：776-780.

[11] Sharkey AM，Day K，Mcpherson A，et al.Vascular endothelial growth factor expression in human endometrium is regulated by hypoxia[J].J Clin Endocrinol Metab，2000， 85（1）：402-409.

[12] 任旭，何援利，彭冬先.缺氧誘導(dǎo)因子21α在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)與微血管密度的關(guān)系[J].廣東醫(yī)學(xué)，2007， 28（2）：229-231.

[13] Bos R，Zhong H，Hanrahan CF，et al.Levels of hypoxia-inducible factor-1 alpha during breast carcinogenesis[J].J Natl Cancer Inst，2001，93（4）：309-314.

[14] 齊璇，辛?xí)匝?，常吉慶，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2003， 16（3）：180.

[15] Maclaren J，Prentice A，Chamck-Jones DS，et al.Vascularendothelial growth factor （VEGF） concentrations are elevated in peritoneal fluid of women with endometriosis[J].Hum Rep Rod，1996，11（1）：220-223.

[16] 王春紅，魏靜波，曲銀娥，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2013， 29（6）：605-608.

[17] Hirota K.Hypoxia-inducible factor 1，a master transcription factor of cellular hypoxic gene expression[J].J Anesth，2002，16（2）：150-159.

（收稿日期：2014-10-22 本文編輯：郭靜娟）