林 鵬，王建科，趙 航，程世鵬

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130112)

食肉動(dòng)物細(xì)小病毒主要包括犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)、水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)及貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV)，屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬。這些病毒具有很高的親緣關(guān)系，基因組核苷酸及蛋白質(zhì)序列相似性高達(dá)98 %以上，并且呈全球性流行。細(xì)小病毒引起的疾病對(duì)我國犬科、貓科及鼬科等動(dòng)物危害非常嚴(yán)重，并造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，對(duì)細(xì)小病毒研究越來越深入，其中VP2 作為細(xì)小病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的了解更加全面：細(xì)小病毒的抗原位點(diǎn)主要分布于該蛋白中、該蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體、決定宿主范圍以及病毒與宿主之間相互作用，而且該蛋白與病毒的血凝特性有關(guān)[1]。本文主要從食肉動(dòng)物細(xì)小病毒的生物學(xué)特性、VP2 蛋白功能、疫苗的研發(fā)情況及病原的檢測(cè)方法等角度進(jìn)行歸納總結(jié)，為防制疾病的傳播和研制新型疫苗等方面提供參考。

1 食肉細(xì)小病毒的生物學(xué)特性

1.1 細(xì)小病毒的形態(tài)特點(diǎn) 食肉動(dòng)物細(xì)小病毒隸屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)，細(xì)小病毒屬(Parvovirus)，病毒粒子為等軸對(duì)稱二十面體，無囊膜，大小在18 nm～26 nm之間。

1.2 細(xì)小病毒基因組結(jié)構(gòu) 食肉動(dòng)物細(xì)小病毒基因組為單鏈DNA，其長度約為5 000 nt，基因組的3' 端和5' 端分別含有約為200 nt 和60 nt 反向重復(fù)序列，發(fā)夾結(jié)構(gòu)與病毒DNA 的復(fù)制及其轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)；其3' 末端的羥基為細(xì)小病毒基因組復(fù)制的引物，若磷酸化后，可以保護(hù)病毒的DNA 不被降解。由于細(xì)小病毒為無囊膜病毒，因此對(duì)外界具有較強(qiáng)的抵抗力，酒精、氯仿等有機(jī)溶劑具有抵抗性。病毒的基因組中含有兩個(gè)主要的開放閱讀框(ORF)，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2 及VP3)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2)，它們是通過可變剪接形成不同的翻譯模板，并且有些細(xì)小病毒還存在其他小的ORF。VP1 參與病毒感染細(xì)胞和病毒衣殼蛋白組裝，其N 端為結(jié)合病毒基因組的3'端，有助于穩(wěn)定病毒基因和引導(dǎo)病毒的基因進(jìn)入細(xì)胞核中；VP3 是由VP2 在蛋白酶作用下裂解產(chǎn)生的，并且只存在完整的病毒粒子中。

VP2 約占病毒粒子衣殼蛋白的90 %，作為病毒的主要蛋白與病毒的致病性、宿主的范圍密切相關(guān)，并且具有良好的免疫原性，是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原表位。其中幾個(gè)重要的氨基酸發(fā)生改變，能夠?qū)е虏《镜闹虏⌒?、抗原特性甚至宿主的范圍均?huì)發(fā)生改變。

1.3 血凝特性 細(xì)小病毒具有血凝的特性，能夠引起恒河猴、豬、馬、貓和倉鼠等紅細(xì)胞凝集，這一特性可以作為鑒定該病毒的一個(gè)重要指標(biāo)。血凝特性受pH 值的影響，VP2 第375 位氨基酸殘基能夠影響凝集紅細(xì)胞時(shí)pH值大小，F(xiàn)PV 在該位點(diǎn)為Asp，而CPV 則為Asn，由于該位點(diǎn)的差異導(dǎo)致FPV 的紅細(xì)胞凝集最低的pH 值為6.5，而CPV 與FPV 最高pH 值可以達(dá)到8.0；同時(shí)該位點(diǎn)也能調(diào)控與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor，TfR)結(jié)合能力和影響宿主的范圍。研究顯示CPV 和FPV 能夠識(shí)別非人類紅細(xì)胞上的唾液酸羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)[2]，細(xì)小病毒科中許多病毒均依賴于宿主的唾液酸進(jìn)行直接吸附或者感染[3]，如鼠細(xì)小病毒(Murine minute virus，MVM)能夠直接結(jié)合Neu5Gc，而不同MVM病毒株的感染力和毒力是由與唾液酸結(jié)合能力的差異所導(dǎo)致的。犬和貓不同組織中均存在Neu5Gc，但缺少系統(tǒng)的研究。細(xì)小病毒凝集紅細(xì)胞主要反映在紅細(xì)胞上的Neu5Gc 的含量，而血凝效價(jià)與紅細(xì)胞表面Neu5Gc 含量無關(guān)。

2 VP2結(jié)構(gòu)蛋白的功能

2.1 VP2蛋白的結(jié)構(gòu) 細(xì)小病毒mRNA 在啟動(dòng)子P38 控制下轉(zhuǎn)錄，翻譯形成VP1，通過剪接后翻譯形成VP2。CPV 衣殼蛋白主要由8 個(gè)反向平行的β-折疊桶和4 個(gè)鑲嵌于p 折疊的大環(huán)組成；VP2 由無規(guī)則卷曲形式構(gòu)成，分別為Loop1、Loop2、Loop3、Loop4 和Loop5。環(huán)的結(jié)構(gòu)決定病毒的性質(zhì)，如中和抗體的主要抗原表位是由環(huán)的結(jié)構(gòu)決定，VP2N 端及其蛋白轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)區(qū)是重要的B 細(xì)胞抗原表位區(qū)，這些區(qū)域氨基酸殘基的變化會(huì)導(dǎo)致抗原漂移。

2.2 VP2蛋白基因的遺傳進(jìn)化 對(duì)CPV 和FPV 進(jìn)化方式研究發(fā)現(xiàn)，普遍認(rèn)為CPV 來自于FPV，F(xiàn)PV 是MEV 和CPV 的祖先[4]。在芬蘭，從狐貍體內(nèi)分離到藍(lán)狐細(xì)小病毒，通過分析其vp2 基因序列發(fā)現(xiàn)介于FPV 和CPV-2 之間，F(xiàn)PV 感染水貂和狐貍等毛皮動(dòng)物可能對(duì)FPV 向CPV-2 型轉(zhuǎn)變起過渡作用。FPV 和MEV 的VP2 序列之間只存在4 個(gè)氨基酸殘基的差異(第79、106、116 和335位)；FPV 與CPV 型之間也僅僅存在6 個(gè)氨基酸殘基的差異(第80、89、103、323、564 和568 位)。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明FPV 基因是通過隨機(jī)遺傳而改變，而CPV 是在有選擇壓力的情況下發(fā)生的。

CPV-2 型首次分離于1978 年，隨后在1980 年后分離到新的病毒株，分析該病毒株為CPV-2 的亞型，命名為CPV-2a 型；隨后又發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的亞型CPV-2b 型；最近報(bào)道新的亞型為CPV-2c 型。從CPV-2 型經(jīng)歷CPV-2a 型、CPV-2b 型直到CPV-2c 型只在5 個(gè)位點(diǎn)氨基酸殘基發(fā)生變化(第87、300、305、426 和559 位)。VP2 上少數(shù)氨基酸殘基的改變，能夠?qū)е略摰鞍卓臻g構(gòu)象改變，從而可能使病毒宿主的范圍和致病性等發(fā)生顯著地變化。CPV VP2中第87 位、第101 位和第305 位氨基酸殘基位于抗原位點(diǎn)A 和B 上，若其改變能夠?qū)е碌鞍讟?gòu)象發(fā)生改變，這與氨基酸側(cè)鏈發(fā)生變化或者氫鍵的得失有關(guān)[5]；目前在中國大陸、中國臺(tái)灣、日本、烏拉圭和韓國等地區(qū)分離的CPV-2a 型中大部分存在T324I 現(xiàn)象[6]。目前研究顯示CPV-2 型感染宿主的范圍在不斷地變化，CPV 各個(gè)亞型能夠引起臨床癥狀與FPV 引起的癥狀非常相似，推測(cè)CPV 可能重新適應(yīng)貓科動(dòng)物，所以細(xì)小病毒的宿主范圍擴(kuò)大可能導(dǎo)致出現(xiàn)新的亞型；Ikeda 通過分析所分離FPV的VP2 氨基酸序列，顯示第323 位氨基酸殘基由FPV 特有的Asp 突變?yōu)镃PV 的Asn，表明VP2 序列中的一個(gè)或者幾個(gè)位點(diǎn)可以控制宿主的范圍[7]。從發(fā)病猴子體內(nèi)分離到一株FPV，序列分析顯示第323 位和第564 位氨基酸均發(fā)生突變，很有可能由于這兩個(gè)位點(diǎn)改變使FPV 具有感染猴子的能力[8]。

病毒進(jìn)化一般通過3 種方式實(shí)現(xiàn)：疫苗選擇壓力、病毒在機(jī)體內(nèi)發(fā)生重組和病毒在自然條件下發(fā)生變異。其中基因重組是細(xì)小病毒進(jìn)化的一種重要的機(jī)制。研究顯示基因重組常常存在于機(jī)體同時(shí)感染不同種類的細(xì)小病毒[9]。在犬體內(nèi)能夠同時(shí)感染CPV-2b 型與CPV-2c 型[10]、CPV-2a 型與CPV-2c 型，在貓?bào)w內(nèi)也能同時(shí)感染CPV 和FPV[9]，目前已經(jīng)證實(shí)在vp 基因上出現(xiàn)FPV 與CPV，F(xiàn)PV與CPV 基因重組[11-12]，并且CPV、MEV 和FPV 之間存在免疫學(xué)交叉反應(yīng)。研究表明FPV 弱毒疫苗在免疫貓后能夠抵抗CPV-2b 型感染[13]；合成CPV VP2 肽段免疫水貂后能免受MEV 的感染；經(jīng)福爾馬林滅活的FPV 免疫水貂后，能夠保護(hù)水貂免受感染。CPV 亞型之間也可以進(jìn)行保護(hù)，如CPV-2b 亞型疫苗免疫犬后能刺激機(jī)體產(chǎn)生CPV-2a 亞型和CPV-2c 亞型的抗體[14]，但也存在特有的抗原表位。

通過單核苷酸多態(tài)性分析顯示，CPV vp2 基因序列中第1 276～1 278 位決定第426 位氨基酸殘基，CPV-2a 型為Asn、CPV-2b 型為Asp、CPV-2c 型為Glu。通過復(fù)雜的動(dòng)力選擇表明，CPV VP2 第426 位氨基酸殘基也不斷發(fā)生改變，使得CPV 抗原性在不斷地變化，因此VP2 氨基酸序列個(gè)別位點(diǎn)的突變可能改變致病性[15]。CPV-2c 型比CPV 其他型感染犬的臨床癥狀和致死率都要高；如果反復(fù)接種疫苗，在病毒復(fù)制的過程中第426 位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu 的幾率就大的多[16]。目前CPV VP2 第300 位和第426 位氨基酸殘基仍存在突變，可能CPV 仍處在變異及進(jìn)化的過程。CPV VP2 中存在T440A，但該突變的功能還不清楚，有待于進(jìn)一步的研究[17]。CPV VP2 中第267 位到498 位之間氨基酸殘基能形成GH 環(huán)，位于βG 和βH之間，該段對(duì)細(xì)小病毒變異影響最大[17]。FPV 和CPV 在抗原性方面存在明顯的差異，可能主要由于VP2 中第93位和第323 位氨基酸殘基差異所導(dǎo)致的。

研究發(fā)現(xiàn)一只3 月齡的貓?bào)w內(nèi)同時(shí)感染CPV-2a 和FPV，認(rèn)為是FPV 和CPV 中間體的細(xì)小病毒變異體，該病毒同時(shí)含有CPV-2a 型和FPV 特異的表位。FPV 和CPV重組后，VP2 第80 位、564 位和568 位氨基酸殘基對(duì)該重組病毒感染宿主的范圍起到一定的重要作用。目前已經(jīng)研究顯示貓能夠感染CPV 2a 型、2b 型和2c 型[18]。

2.3 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 細(xì)小病毒在感染的過程中，病毒表面的VP2 與宿主細(xì)胞膜表面上的TfR 相結(jié)合，通過依賴Dynamin 和Clathrin 介導(dǎo)的內(nèi)吞現(xiàn)象運(yùn)至內(nèi)涵體，從而使病毒感染宿主細(xì)胞內(nèi)。病毒被內(nèi)吞后在細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸是一個(gè)緩慢的過程。CPV 結(jié)合細(xì)胞表面的TfR 后，在細(xì)胞膜下聚集，質(zhì)膜內(nèi)陷形成小泡，包被CPV 粒子，進(jìn)入早期胞內(nèi)體；小泡與膜進(jìn)行分離時(shí)需要?jiǎng)恿Φ鞍椎膮⑴c；該動(dòng)力蛋白在CPV 和受體共同定向轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中起重要作用。細(xì)胞質(zhì)中的pH 值能夠影響病毒的感染[17]，此外病毒在感染過程中也會(huì)受到環(huán)境溫度和離子濃度等因素影響，可能導(dǎo)致病毒受體和病毒編碼蛋白的空間構(gòu)象以及化學(xué)鍵之間的相互作用發(fā)生改變，從而導(dǎo)致病毒感染力下降。CPV VP2 第299 位和300 位氨基酸殘基影響與TfR 相結(jié)合，研究顯示TfR 中L221S 或者L221D 的點(diǎn)突變能夠抑制病毒的感染能力[19]；還有些報(bào)道TfR 部分缺失Tyr-Thr-Arg-Phe 會(huì)降低病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力。重組TfR 與CPV VP2 結(jié)合后，能夠抑制CPV 感染機(jī)體細(xì)胞，從而降低了犬的死亡率。在CPV-2 型中VP2 發(fā)生G299E 突變時(shí)，完全失去了與犬細(xì)胞上TfR 的結(jié)合，從而失去感染犬細(xì)胞的能力[20]。

目前細(xì)小病毒的宿主存在特異的TfR，例如FPV 只能結(jié)合貓?jiān)吹腡fR，但CPV 不僅能結(jié)合貓?jiān)吹腡fR 還能結(jié)合犬源的TfR。TfR 的N 端第135～430 位之間氨基酸殘基決定病毒對(duì)宿主細(xì)胞的嗜性，CPV-2 型與貓或水貂的細(xì)胞結(jié)合程度比CPV-2b 型強(qiáng)，主要是由于第87 位和101位的氨基酸殘基，但第305 位氨基酸作用較小[5]。

某些細(xì)小病毒感染細(xì)胞是通過受體結(jié)合蛋白識(shí)別宿主的唾液酸受體，導(dǎo)致病毒直接吸附宿主細(xì)胞或者提高與細(xì)胞的結(jié)合能力。當(dāng)FPV 和CPV 與TfR 結(jié)合時(shí)，唾液酸起重要作用，能增加細(xì)胞表面上Neu5Gc 的含量，而在體外則不能增加[2]，該機(jī)制也是細(xì)小病毒感染細(xì)胞的一種方式[21]。TfR 在惡性腫瘤細(xì)胞中含量較高，可能該受體與細(xì)胞增殖相關(guān)。

2.4 VP2在疫苗研究上的應(yīng)用 由于VP2 具有較強(qiáng)的免疫原性，是產(chǎn)生中和抗體的主要病毒抗原，所以不僅傳統(tǒng)疫苗(滅活疫苗、弱毒疫苗)利用此特性，而且新型疫苗(基因工程亞單位疫苗、DNA 疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、基因工程重組活載體疫苗、表位疫苗等)的研究也集中到VP2 上。目前疫苗接種是防制食肉動(dòng)物細(xì)小病毒病的一項(xiàng)重要手段，但由于該病毒的持續(xù)不斷地變異，可能導(dǎo)致出現(xiàn)免疫失敗現(xiàn)象。

2.4.1 傳統(tǒng)疫苗 吳威采用單克隆抗體(MAb)對(duì)我國MEV 進(jìn)行系統(tǒng)分型，篩選出毒力穩(wěn)定、免疫原性良好的病毒株，并且研制出MEV 滅活疫苗；通過CPV 在犬體內(nèi)連續(xù)傳代的方式研發(fā)出弱毒疫苗，此疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗CPV 的中和抗體；Wilson 等發(fā)現(xiàn)針對(duì)CPV-2b 型的疫苗免疫犬后，能夠產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受不同亞型CPV 病毒株的攻擊，提供交叉保護(hù)[14]。

2.4.2 新型疫苗 食肉動(dòng)物細(xì)小病毒VP2 是抗原決定蛋白，VP2 單獨(dú)表達(dá)能夠產(chǎn)生良好的免疫源性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，對(duì)動(dòng)物機(jī)體無毒副作用。VP2 可以形成一個(gè)不含病毒核酸的病毒樣顆粒(Virus like particle,VLPs)，在病毒形態(tài)上與原病毒相似。當(dāng)VLPs 免疫小鼠后，刺激CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。VLPs 可以作為疫苗，防制疾病的發(fā)生，具有安全性高、免疫性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

利用含有vp2 基因表達(dá)重組質(zhì)粒和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP2 免疫犬后均能夠得到良好的免疫保護(hù)；CPV vp2基因與狂犬病病毒的糖蛋白基因共同連接到pIRES 載體上，可以表達(dá)2 種抗原蛋白的雙順反子DNA 疫苗[22]；將MEV vp2 基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物疫苗，能夠?qū)EV 的強(qiáng)毒感染具有良好的免疫保護(hù)作用[23]；CPV VP2 抗原表位2L21 連接到霍亂毒素基因上并且在煙草的葉綠體中融合表達(dá)的重組蛋白，免疫小鼠能夠產(chǎn)生高效價(jià)的抗2L21 的抗體，可以在體外中和CPV[24]；利用犬2 型腺病毒構(gòu)建FPV VP2 重組腺病毒活載體疫苗，免疫后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體[25]。未來隨著DNA 疫苗的發(fā)展，有可能也會(huì)應(yīng)用到水貂病毒性腸炎的預(yù)防上；Zhang 等利用噬菌體展示技術(shù)篩選出與MEV 結(jié)合強(qiáng)的多肽，為研制高效、特異性強(qiáng)的疫苗奠定了基礎(chǔ)[26]。

2.5 VP2在診斷方面的應(yīng)用 目前細(xì)小病毒病的診斷方法有形態(tài)學(xué)鑒定診斷、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷以及動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)等。其中血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗(yàn)、ELISA、中和試驗(yàn)和PCR 等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)都是利用VP2及其編碼基因的特性進(jìn)行細(xì)小病毒病的診斷。

以細(xì)小病毒vp2 基因?yàn)槟０澹⒌腟YBR Green 染料法的實(shí)時(shí)定量PCR，能夠同時(shí)檢測(cè)CPV、FPV 和豬細(xì)小病毒，該方法具有良好的敏感性和特異性，最低檢測(cè)量為10 拷貝/μL[27]；根據(jù)CPV vp2 基因采用隔熱式恒溫PCR 技術(shù)檢測(cè)CPV，也具有很高的敏感性和特異性，分別為98.41 %和100 %，與實(shí)時(shí)定量熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)[28]；針對(duì)CPV vp2 基因采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loopmediated isothermal amplification，LAMP)分別與ELISA 和橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)(Lateral flow dipstick，LFD)相結(jié)合檢測(cè)CPV，具有更高的敏感性和特異性，與傳統(tǒng)的PCR 和PCR-ELISA 相比最低檢測(cè)量提高了100 倍[29]。Horiuchi 等在制備的MAb 具有交叉反應(yīng)，并能夠識(shí)別VP2 中第93位的Lys，該位點(diǎn)是FPV 和MEV 所特有的，可以用來鑒別FPV 和MEV 與其他病毒[4]；利用高分辨率熔解曲線(High-resolution melting，HRM)技術(shù)根據(jù)CPV-2 型vp2 基因進(jìn)行快速診斷，PCR-HRM 能夠通過不同的溶解溫度的差異區(qū)分CPV-2a 型、CPV-2b 型和CPV-2c 型；該技術(shù)具有極高的敏感性、成本低廉，速度快等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)真正意義上的閉管操作[30]。近年來膠體金免疫層析技術(shù)在獸醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用，其技術(shù)操作簡(jiǎn)便快捷、成本低廉和直接顯示結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，使其在診斷領(lǐng)域等方面迅速的推廣，但在食肉動(dòng)物細(xì)小病毒診斷方面研究較少。

3 結(jié)語

食肉動(dòng)物細(xì)小病毒在遺傳進(jìn)化過程中發(fā)生基因組的突變和重組等，病毒變異株不斷產(chǎn)生，從而導(dǎo)致病毒的宿主范圍可能不斷地?cái)U(kuò)大，改變致病性等特性。分析顯示細(xì)小病毒變異株具有各自的抗原特性，這就對(duì)疫苗的保護(hù)效力提出更高的要求。目前細(xì)小病毒在野生動(dòng)物之間、野生動(dòng)物與飼養(yǎng)食肉動(dòng)物之間的傳播尚未清楚，這為我們提供下一步的研究方向。

預(yù)防食肉動(dòng)物細(xì)小病毒病的手段主要是接種疫苗，目前也出現(xiàn)一些問題，例如長期接種弱毒疫苗引起病毒血癥、免疫失敗引起疾病的發(fā)生等問題[18]。隨著科技水平不斷的提高，對(duì)食肉動(dòng)物細(xì)小病毒進(jìn)行了深入的研究，尤其對(duì)VP2 結(jié)構(gòu)蛋白的認(rèn)識(shí)不斷的加深，將更好的了解細(xì)小病毒如何感染宿主細(xì)胞的工作機(jī)制，為細(xì)小病毒病的綜合防制提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，從而保證相關(guān)的養(yǎng)殖業(yè)更好地發(fā)展。

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