孫勝男, 葉潤蓉, 盧學峰, 周玉碧, 舍莉萍, 彭 敏,①

(1. 中國科學院西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物資源重點實驗室, 青海 西寧 810008； 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

青海不同產(chǎn)地唐古特大黃的脂肪酸成分及其主成分分析

孫勝男1,2, 葉潤蓉1, 盧學峰1, 周玉碧1, 舍莉萍1,2, 彭 敏1,①

(1. 中國科學院西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物資源重點實驗室, 青海 西寧 810008； 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

采用柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)對來源于青海省甘德、達日、班瑪、瑪沁、同德和祁連6個縣15個樣地的唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim. ex Balf.)地下部分的脂肪酸成分進行了檢測和分析，并在此基礎上對脂肪酸成分進行了主成分分析。結果顯示：從各產(chǎn)地唐古特大黃中均檢測出15種脂肪酸成分，包括12種飽和脂肪酸(即癸酸、十一酸、十二酸、十四酸、十五酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸和二十四酸)和3種不飽和脂肪酸(即亞麻酸、亞油酸和油酸)，其中，飽和脂肪酸中棕櫚酸含量最高、不飽和脂肪酸中亞油酸含量最高。不同產(chǎn)地唐古特大黃的總脂肪酸含量為2.38～54.22 μg·g-1，其中不飽和脂肪酸占17.31%～48.97%；各脂肪酸成分存在明顯的地域性差異，產(chǎn)自瑪沁縣MQ1樣地的樣品中總脂肪酸含量最高，產(chǎn)自祁連縣QL2樣地的樣品中不飽和脂肪酸所占比例最高。主成分分析結果顯示：前3個主成分的累計貢獻率較高，達到87.387%，其中特征向量較大的脂肪酸均為偶數(shù)長碳鏈脂肪酸(碳原子數(shù)大于12)，表明偶數(shù)長碳鏈脂肪酸為唐古特大黃的特征性脂肪酸成分。綜合分析結果表明：青海省不同地域復雜多變的地理和氣候條件可能是造成唐古特大黃脂肪酸組成及含量差異的主要因素。

唐古特大黃； 脂肪酸成分； HPLC-FLD； 柱前衍生； 主成分分析

唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim. ex Balf.)又名雞爪大黃，為蓼科(Polygonaceae)大黃屬(RheumLinn.)多年生高大草本植物，主要分布于海拔2 300～4 200 m的林緣、林下溝谷或灌叢地帶[1]。唐古特大黃為中藥材大黃的原植物之一，青海省是其著名的道地藥材產(chǎn)區(qū)。大黃的藥用歷史悠久，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等功效[2]。已有的研究結果表明：大黃屬植物含有多種化學成分，但主要集中在蒽醌類、鞣質類、二苯乙烯類及苯丁酮類等藥用活性成分[3-5]。

脂肪酸廣泛分布于動植物體內，在機體能量供應方面具有重要作用，其中，不飽和脂肪酸因具有調節(jié)血脂、降低血糖、增強免疫力等功能更受到人們的日益重視[6]。迄今為止，僅見在進行大黃揮發(fā)油組分測定時有部分脂肪酸成分的研究報道[7-8]，并未見針對其脂肪酸成分的詳細分析報道。因此，對大黃脂肪酸成分進行系統(tǒng)分析對于大黃資源的充分利用具有重要意義。

目前，一般采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)測定植物的脂肪酸成分，該方法效率高、應用范圍較廣，但存在靈敏度欠佳、重現(xiàn)性不理想等缺點[9]；相較而言，采用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)分析植物的脂肪酸成分則具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性[10]。鑒于此，作者以苯并[b]吖啶酮-5-乙基對甲苯磺酸酯(BAETS)[11]作為標記分子，采用柱前衍生HPLC-FLD法對來源于青海省甘德、達日、班瑪、瑪沁、同德和祁連6個縣15個樣地的唐古特大黃的脂肪酸成分進行了測定和分析，采用主成分分析法研究了其特征性脂肪酸成分，并對脂肪酸含量的地域性差異進行了初步探討，以期為唐古特大黃的化學成分研究及其資源的深度開發(fā)和合理利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

于2011年10月在唐古特大黃的自然分布區(qū)青海省甘德縣、達日縣、班瑪縣、瑪沁縣、同德縣和祁連縣分別選取2、5、2、2、1和3個樣地，共15個樣地；各樣地均挖取5株大黃植株的根及根莖部分，洗凈、烘干、混合，粉碎并過80目篩，備用。原植物標本經(jīng)中國科學院西北高原生物研究所盧學峰副研究員鑒定。

主要儀器有Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、Hypersil BDS C8色譜柱 (200 mm × 4.6 mm，5 μm，Dalian Elite)、KQ118型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)和BF2000型氮氣吹干儀(北京八方世紀科技有限公司)。主要試劑有15種飽和脂肪酸標準品(購自上海試劑廠)，4種不飽和脂肪酸標準品(購自Sigma公司)，光譜純乙腈(購自Sigma公司)，超純水，乙醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和K2CO3等試劑均為分析純，衍生試劑BAETS由曲阜師范大學生命有機分析重點實驗室合成。

1.2 方法

1.2.1 HPLC分析條件 熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為272和505 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1；進樣量10 μL。流動相A為體積分數(shù)5%的乙腈溶液，流動相B為純乙腈。梯度洗脫程序為：0～25 min，50%～90%A； 25～28 min， 90%～92%A； 28～30 min，92%～100%A；30～40 min，100%A。脂肪酸標準品衍生物的質譜定性參照文獻[10]確定。

1.2.2 脂肪酸標準品混合液的制備和標準曲線的繪制 分別稱取一定質量的各脂肪酸標準品，加入相應體積的純乙腈并搖勻，制成濃度為0.01 mol·L-1的單一脂肪酸標準品溶液；將15個單一的脂肪酸標準品溶液混合并稀釋成濃度為0.1 mmol·L-1的脂肪酸標準品混合液，逐級稀釋2、4、8、16和32倍，備用。

稱取適量的BAETS，用純乙腈制成濃度為0.03 mmol·L-1的衍生試劑溶液；向裝有約20 mg無水K2CO3粉末的安瓿瓶中依次加入40 μL稀釋后的系列濃度脂肪酸標準品混合液、200 μL DMF和200 μL衍生試劑溶液，封口后置于90 ℃恒溫水浴中反應30 min；冷卻后加入體積分數(shù)30%乙腈溶液并稀釋至1 mL，搖勻后進行HPLC分析。以峰面積為自變量x、進樣濃度為因變量y進行線性回歸分析，得到各脂肪酸標準品的線性回歸方程，結果表明各脂肪酸均在0.125～4.000 μmol·L-1范圍內存在線性關系，相關系數(shù)均高于0.998 3。

1.2.3 樣品溶液的制備和分析 分別稱取50 mg各樣地的唐古特大黃樣品粉末，準確加入5 mL無水乙醇，在20 ℃條件下超聲(功率70 W)提取2 h并浸泡過夜；室溫下于4 000 r·min-1離心40 min；取1 mL上清液，用氮氣吹干后按照上述方法進行衍生化處理，并采用上述色譜條件進行HPLC分析。分別記錄各樣品的峰面積并根據(jù)各脂肪酸的線性回歸方程計算每個樣品中各個脂肪酸成分的含量。

1.3 方法學考察

1.3.1 精密度實驗 取經(jīng)過衍生化的脂肪酸標準品混合液(0.1 mmol·L-1)，采用上述色譜條件連續(xù)進樣6次。各脂肪酸峰面積的RSD值為0.29%～2.32%，說明該分析方法精密度良好。

1.3.2 重復性實驗 取來源于甘德縣GD1樣地的唐古特大黃樣品3份，分別按上述方法制備樣品溶液，并采用上述色譜條件進行HPLC分析。各脂肪酸峰面積的RSD值為0.95%～7.36%，說明該分析方法重復性較好。

1.3.3 穩(wěn)定性實驗 取經(jīng)過衍生化的甘德縣GD1樣地唐古特大黃樣品溶液，分別于室溫下放置0、16、24和48 h后采用上述色譜條件進行HPLC分析。經(jīng)計算，放置0、16和24 h后各脂肪酸成分的RSD值小于5.83%，而放置0、24和48 h后各脂肪酸成分的RSD值小于7.22%，說明該溶液日內和日間的穩(wěn)定性均較差，應該在經(jīng)過衍生化處理后立刻進行HPLC分析。

1.3.4 加樣回收率實驗 稱取來源于甘德縣GD1樣地的唐古特大黃樣品3份，分別按上述方法制備樣品溶液，并按照上述方法進行衍生化處理后，準確加入0.1 mmol·L-1脂肪酸標準品混合溶液100 μL，采用上述色譜條件進行HPLC分析。各脂肪酸成分的加樣回收率為85.28%～105.27%，RSD值為0.90%～2.79%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用EXCEL 2010軟件進行各脂肪酸成分的含量計算和相關數(shù)據(jù)的整理，并采用PC-ORD 5.0統(tǒng)計分析軟件對不同產(chǎn)地唐古特大黃的各脂肪酸成分含量進行主成分分析。

2 結果和分析

2.1 HPLC檢測結果分析

采用HPLC法對19個脂肪酸標準品混合液和唐古特大黃樣品中的脂肪酸成分進行了測定分析，結果表明：脂肪酸標準品混合液中的19個脂肪酸分離效果較好(圖1-A)，唐古特大黃樣品中的脂肪酸成分分離效果也較好，與脂肪酸標準品混合液的HPLC圖譜比較，共檢測出15個脂肪酸成分(圖1-B)。

2.2 不同產(chǎn)地唐古特大黃中脂肪酸成分的比較

不同產(chǎn)地唐古特大黃中脂肪酸成分含量的比較結果見表1。檢測結果表明：從來源于不同樣地的唐古特大黃樣品中均檢測出癸酸、十一酸、十二酸、十四酸、十五酸、棕櫚酸、硬脂酸、二十酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸和二十四酸12種飽和脂肪酸以及亞麻酸、亞油酸和油酸3種不飽和脂肪酸，僅十三酸、花生四烯酸、十七酸和十九酸未檢出。

由表1可見：來源于15個樣地的唐古特大黃樣品中總脂肪酸含量為2.38～54.22 μg·g-1，其中，總飽和脂肪酸含量為1.71～29.07 μg·g-1，總不飽和脂肪酸含量為0.67～25.15 μg·g-1，總不飽和脂肪酸含量占總脂肪酸含量的17.31%～48.97%。含量較高的脂肪酸依次是亞油酸、棕櫚酸、亞麻酸、硬脂酸，平均含量均高于1.00 μg·g-1，這4種脂肪酸的總含量占總脂肪酸含量的65.44%；癸酸的平均含量最低，僅為0.19 μg·g-1。

由表1還可見：唐古特大黃樣品中的各脂肪酸成分含量在不同樣地間差異較大。變幅最大的為亞油酸，變異系數(shù)達114.77%；變幅最小的為二十一酸，變異系數(shù)為44.70%。來源于瑪沁縣MQ1樣地的唐古特大黃樣品的總脂肪酸含量最高，為54.22 μg·g-1；來源于祁連縣QL2樣地的唐古特大黃樣品中總不飽和脂肪酸含量所占比例最高，達48.97%。

1： 癸酸Decanoic acid； 2： 十一酸Undecanoic acid； 3： 十二酸Dodecanoic acid； 4： 十三酸Tridecanoic acid； 5： 亞麻酸Linolenic acid； 6： 十四酸Myristic acid； 7： 花生四烯酸Arachidonic acid； 8： 亞油酸Linoleic acid； 9： 十五酸Pentadecanoic acid； 10： 棕櫚酸Palmitic acid； 11： 油酸Oleic acid； 12： 十七酸Heptadecanoic acid； 13： 硬脂酸Octadecanoic acid； 14： 十九酸Nonadecanoic acid； 15： 二十酸Arachidic acid； 16： 二十一酸Heneicosoylic acid； 17： 二十二酸Docosanoic acid； 18： 二十三酸Tricosanoic acid； 19： 二十四酸Tetracosanoic acid.

圖1 脂肪酸標準品混合液(A)及唐古特大黃樣品(B)中脂肪酸成分的HPLC圖譜

Fig. 1 HPLC chromatograms of fatty acid compositions in fatty acid standard mixture solution (A) and in sample ofRheumtanguticumMaxim. ex Balf. (B)

表1 青海省不同產(chǎn)地唐古特大黃樣品中脂肪酸成分含量的比較

Table 1 Comparison on content of fatty acid composition inRheumtanguticumMaxim. ex Balf. from different locations of Qinghai Province

續(xù)表1 Table 1 (Continued)

1)GD： 甘德縣Gande County； DR： 達日縣Dari County； BM： 班瑪縣Banma County； MQ： 瑪沁縣Maqin County； TD： 同德縣Tongde County； QL： 祁連縣Qilian County; M： 平均值 Mean；CV: 變異系數(shù) Coefficient of variation.

2)DEA: 癸酸Decanoic acid; UNA: 十一酸Undecanoic acid; DOA: 十二酸Dodecanoic acid; LIA: 亞麻酸Linolenic acid; MYA: 十四酸Myristic acid; LA: 亞油酸Linoleic acid; PEA: 十五酸Pentadecanoic acid; PAA: 棕櫚酸Palmitic acid; OLA: 油酸Oleic acid; OCA: 硬脂酸Octadecanoic acid; ARA: 二十酸Arachidic acid; HEA: 二十一酸Heneicosylic acid; DA: 二十二酸Docosanoic acid; TRA: 二十三酸Tricosanoic acid; TEA: 二十四酸Tetracosanoic acid; Ts: 總飽和脂肪酸Total saturated fatty acids; Tu: 總不飽和脂肪酸Total unsaturated fatty acids; T: 總脂肪酸Total fatty acids.

2.3 唐古特大黃中脂肪酸成分的主成分分析

以15個樣地的唐古特大黃樣品為樣本單元、15個脂肪酸成分含量為變量進行主成分分析，結果見表2。結果顯示：前3個主成分的累計貢獻率達到87.387%，說明這3個主成分可以基本反映唐古特大黃樣品中所有脂肪酸成分的信息。其中，第1主成分的貢獻率達67.673%，說明該主成分可解釋總信息量的三分之二，特征向量較大的是十二酸、亞麻酸、十四酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸，均為偶數(shù)碳鏈脂肪酸，且均為長碳鏈脂肪酸(碳原子數(shù)大于12)；第2和第3主成分的貢獻率分別為12.450%和7.264%，二者特征向量最大的分別為二十三酸和二十酸。

表2 青海產(chǎn)唐古特大黃脂肪酸成分含量的主成分分析1)

Table 2 Principal component analysis on content of fatty acid composition inRheumtanguticumMaxim. ex Balf. from Qinghai Province1)

1)DEA: 癸酸Decanoic acid; UNA: 十一酸Undecanoic acid; DOA: 十二酸Dodecanoic acid; LIA: 亞麻酸Linolenic acid; MYA: 十四酸Myristic acid; LA: 亞油酸Linoleic acid; PEA: 十五酸Pentadecanoic acid; PAA: 棕櫚酸Palmitic acid; OLA: 油酸Oleic acid; OCA: 硬脂酸Octadecanoic acid; ARA: 二十酸Arachidic acid; HEA: 二十一酸Heneicosylic acid; DA: 二十二酸Docosanoic acid; TRA: 二十三酸Tricosanoic acid; TEA: 二十四酸Tetracosanoic acid; E: 特征值 Eigen value; R: 貢獻率Contribution rate; AR: 累計貢獻率 Accumulative contribution rate.

3 討論和結論

脂肪酸是生物膜的主要組成成分，也是許多生化反應的前體物質，在維持生物體功能和新陳代謝方面有重要作用，特別是不飽和脂肪酸具有顯著的生理活性，在降低血糖、調節(jié)血脂、降低血清膽固醇等方面具有一定的功效[12]。本研究采用柱前衍生HPLC-FLD法從唐古特大黃中共檢出15種脂肪酸成分，其中，飽和脂肪酸以棕櫚酸含量最高、硬脂酸含量次之；3種不飽和脂肪酸的含量由高到低依次是亞油酸、亞麻酸和油酸。主成分分析結果顯示：偶數(shù)長碳鏈脂肪酸為唐古特大黃的特征性脂肪酸成分，這與青海高原其他根莖類藥材脂肪酸成分的測定結果[13-14]一致。推測唐古特大黃的脂肪酸組成可能與其具有降糖、降脂和抗血栓作用有關，其脂肪酸組成的藥理學原理有待深入研究。

藥用資源化學成分的種類及含量的地域性差異是中藥材道地性的一種具體體現(xiàn)[15-16]。測定結果顯示：青海產(chǎn)唐古特大黃的各脂肪酸成分含量在不同樣地間變化較大。本研究使用的唐古特大黃樣品來自青海高原東部的南起班瑪縣、北至祁連縣的6個縣，緯度跨度達5.4°，受復雜多變的氣候因素和地理環(huán)境的影響，植物體內的化學成分含量差異很大。采自瑪沁縣MQ1樣地的唐古特大黃樣品的總脂肪酸含量最高，這可能與瑪沁縣的地理和氣候條件有關。該縣地處青海高原南端，平均海拔在4 000 m以上，地勢較高、氣候寒冷，屬高原大陸性半濕潤氣候，這種特殊的氣候條件有利于唐古特大黃體內脂肪酸的積累。不飽和脂肪酸含量所占比例以來源于祁連縣QL2樣地的唐古特大黃樣品最高。祁連縣地處青海高原北部祁連山脈的山間谷地，海拔在3 000 m左右，氣候溫暖濕潤、光照充足，這些地理和氣候條件符合唐古特大黃耐寒喜濕的特性，可能有利于其體內不飽和脂肪酸的積累。由于植物體內化學成分的積累受遺傳和外界環(huán)境等多方面因素的影響，因而，關于唐古特大黃脂肪酸成分與其生態(tài)環(huán)境因子的相關性還需進行深入研究。

結果表明：青海省各產(chǎn)地唐古特大黃的脂肪酸含量具有較明顯的地域性差異。因此，在對青海產(chǎn)唐古特大黃的脂肪酸資源進行開發(fā)應用時，可根據(jù)實際需要選擇產(chǎn)地。例如，若注重總脂肪酸的利用，可采集瑪沁縣的樣品；若主要應用不飽和脂肪酸，則可選擇祁連縣的樣品。

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(責任編輯： 佟金鳳)

Analyses on fatty acid composition inRheumtanguticumfrom different locations in Qinghai and its principal component analysis

SUN Shengnan1,2, YE Runrong1, LU Xuefeng1, ZHOU Yubi1, SHE Liping1,2, PENG Min1,①

(1. Qinghai Key Laboratory of Qinghai-Tibet Plateau Biological Resources, NorthwestInstituteofPlateauBiology,ChineseAcademyofSciences,Xining810008, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China),

J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(1): 48-53

Fatty acid composition in under-ground part ofRheumtanguticumMaxim. ex Balf. from fifteen plots of six counties of Gande, Dari, Banma, Maqin, Tongde and Qilian in Qinghai Province were determined and analyzed by the method of high performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLD) with pre-column derivatization, and on this basis, principal component analysis on fatty acid composition was carried out. The results show that all of fifteen fatty acids are detected inR.tanguticumfrom different locations, which includes twelve saturated fatty acids (viz. decanoic acid, undecanoic acid, dodecanoic acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, octadecanoic acid, arachidic acid, heneicosylic acid, docosanoic acid, tricosanoic acid and tetracosanoic acid) and three unsaturated fatty acids (viz. linolenic acid, linoleic acid and oleic acid). In which, palmitic acid content is the highest in saturated fatty acids, and linoleic acid content is the highest in unsaturated fatty acids. The content of total fatty acids inR.tanguticumfrom different locations is 2.38-54.22 μg·g-1, in which, unsaturated fatty acids account for 17.31%-48.97%. There is an obvious regional difference in fatty acid compositions. The content of total fatty acids in sample from MQ1 plot of Maqin County is the highest, and the proportion of unsaturated fatty acids in sample from QL2 plot of Qilian County is the highest. The result of principal component analysis shows that accumulative contribution rate of the first three principal components is high with a value of 87.387%, in which, fatty acids with high eigenvector are all even number and long carbon chain fatty acids (with carbon atom number being higher than 12), meaning that even number and long carbon chain fatty acids are characteristic fatty acid composition ofR.tanguticum. Comprehensive analysis result indicates that complex and changeable climate and geographical conditions of different regions in Qinghai Province are probably the main factors to cause differences in composition and content of fatty acids inR.tanguticum.

RheumtanguticumMaxim. ex Balf.; fatty acid composition; HPLC-FLD; pre-column derivatization; principal component analysis

2014-04-17

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAC08B06)

孫勝男(1988—)，女，山東威海人，博士研究生，主要從事植物資源品質評價的相關研究。

①通信作者 E-mail： pengmin@nwipb.cas.cn

Q946.1； R284.1

A

1674-7895(2015)01-0048-06

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.01.07