武 省，李國清

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州510642）

·綜述·

藍氏賈第蟲致病機制的研究進展

武 省，李國清

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州510642）

藍氏賈第蟲（Giardia lamblia）是一種重要的人畜共患寄生蟲，可引起人和多種哺乳動物的腹瀉。近年來人們對其致病機制進行了大量研究，包括賈第蟲結構蛋白（賈第素）和排泄分泌物，表面抗原變異以及賈第蟲對小腸的影響等，本文對此進行了綜述。

藍氏賈第蟲；致病機制；賈第素；抗原變異；細胞凋亡

藍氏賈第蟲（Giardia lamblia），簡稱賈第蟲，是一種寄生于人和多種哺乳動物腸道內的原蟲，可引起以腹瀉為主的賈第蟲?。╣iardiasis）。該病呈世界性分布，自20世紀70年代以來，在世界各地流行或爆發(fā)流行，現(xiàn)已列入全世界危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一[1,2]。據(jù)WHO估計，全世界約有1%～30%的人感染賈第蟲，發(fā)達國家人的賈第蟲感染率為0.4%～7.5%，發(fā)展中國家人的賈第蟲感染率為8%～30%[3]。歐洲7個國家8685只犬和4214只貓的糞樣調查結果顯示，分別有24.8%和20.3%的樣本呈賈第蟲陽性[4]，且該蟲可以在人和伴侶動物之間傳播[5]。因此，藍氏賈第蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲。一般認為，賈第蟲滋養(yǎng)體在鞭毛的協(xié)助下借助其腹吸盤吸附于小腸上皮細胞表面，可直接損傷腸粘膜致使腸上皮細胞微絨毛變短、變粗甚至萎縮，從而導致營養(yǎng)物質吸收障礙而引起腹瀉，但蟲體導致腹瀉的真正機制至今尚未明確。為了更好地了解賈第蟲的致病作用，本文對其細胞骨架蛋白和排泄分泌物、蟲體表面抗原變異以及蟲體對宿主小腸的影響等相關研究進行綜述。

1 賈第蟲細胞骨架蛋白和排泄分泌物

1.1 賈第素藍氏賈第蟲具有高度發(fā)達的細胞骨架系統(tǒng)，由微管、微絲和細胞骨架蛋白所構成。近年來的研究證實，賈第蟲的細胞骨架蛋白與其致病力有著密切關系[6]。在參與細胞骨架構成的眾多蛋白質中，特異性細胞骨架蛋白—賈第素（Giardin）是其重要組成之一。1983年，Crossley等[7]首次提出賈第素概念，目前已將其分成α-賈第素、β-賈第素、γ-賈第素、δ-賈第素4大類。

α-賈第素是一類鈣依賴性膜結合蛋白[8]，系統(tǒng)進化分析表明，其性質屬于膜聯(lián)蛋白的同源類似物[9]。它們常與質膜及內膜系統(tǒng)相聯(lián)，參與細胞骨架運動及酶調節(jié)的細胞內信號轉導，調節(jié)細胞生長與增殖，形成非典型Ca2+通道等許多重要的細胞生理活動。α-賈第素目前已發(fā)現(xiàn)21種，即α-1至α-19，其中，α-7細分為α-7.1、α-7.2和α-7.3三種。Morgan等[10]通過進化樹分析，發(fā)現(xiàn)賈第素α-1與XIX鈣結合蛋白類似，而賈第素α-2與XX鈣結合蛋白類似。所有α-賈第素都可能是進化過程中膜聯(lián)蛋白的代表，并且很可能具有保守的關鍵結構域而行使相似的功能[11]。

近年來，人們對α-賈第素的細胞定位和功能進行了大量研究。Peattie等[12]首先用SDS-PAGE方法分離出一種33 kDa蛋白，以此蛋白為抗原制備了多克隆抗血清，通過免疫細胞化學方法對賈第素α-1進行細胞定位，發(fā)現(xiàn)其主要分布于腹吸盤。隨后，Wenman等[13]用同樣方法證實其分布于蟲體胞漿膜。Feliziani等[14]通過免疫組化分析，顯示賈第素α-1主要分布于滋養(yǎng)體的胞漿膜。Weiland等[15]通過搜索賈第蟲基因組的方法，發(fā)現(xiàn)了另外14種α-賈第素基因（α-4、α-5、α-6、α-8至α-13、α-15 至α-19）；同時對α-賈第素家族中的17個成員進行細胞定位研究，結果顯示α-3、α-5、α-17分布于腹吸盤；α-15和α-16則沿細胞膜呈散在分布；α-1、α-7.1、α-8、α-11的重組載體轉染滋養(yǎng)體后，由于其過量表達致蟲體死亡而未能實現(xiàn)其定位；其余8種（α-1、α-2、α-6、α-7.2、α-7.3、α-9、α-10、α-14）多分布于細胞膜、吸盤、鞭毛或胞漿等處。近年來，王洋等[16]以賈第素α-4特異性多肽為抗原，制備了其多克隆抗體，進行細胞免疫組化實驗。結果表明，賈第素α-4主要分布于滋養(yǎng)體的鞭毛部位，推測其可能參與賈第蟲的運動和感染過程。Kim等[17]以相似方法對賈第素α-11進行定位研究，結果顯示其主要分布于細胞膜和前鞭毛的基體。

β-賈第素是唯一被證明與骨骼肌次晶蛋白有共同結構域的賈第素[18]。骨骼肌次晶蛋白已被證明與絲狀纖維的形成和功能密切相關。Crossley等[19]發(fā)現(xiàn)β-賈第素能夠組裝成2.5 nm的微絲，并進一步組成腹吸盤的輔助等超微結構。Feliziani等[14]制備了β-賈第素單克隆抗體，對其進行定位研究，結果發(fā)現(xiàn)其主要分布于吸盤部位。隨后，Macarisin等[20]利用激光共聚焦顯微鏡技術，證明其分布于吸盤的背面。Jimenez等[21]發(fā)現(xiàn)不同蟲株經(jīng)阿苯達唑處理后，β-賈第素的氨基酸序列不同，表明阿苯達唑的抗藥性與β-賈第素有關。

γ-賈第素是一種38 kDa的蛋白，主要定位于賈第蟲滋養(yǎng)體的吸盤部位[22]。δ-賈第素是Elmendorf 等[6]發(fā)現(xiàn)的一種31 kDa的蛋白。Jenkins等[23]制備了特異性抗血清對其進行定位研究，結果表明δ-賈第素主要定位于賈第蟲的吸盤部位，抗血清與蟲體反應后，蟲體的吸附能力減弱，表明δ-賈第素參與吸盤在小腸黏膜的吸附過程。

1.2 排泄分泌物賈第蟲多種排泄分泌物（excretory secretory product，ESP）可參與宿主的致病過程，包括賈第蟲釋放的代謝酶、大小不同的可溶性物質和未知半胱氨酸蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)，賈第蟲可釋放精氨酸脫亞氨酶（ADI）和鳥氨酸氨甲酰轉移酶（OTC）[24,25]，這些酶均可參與L-精氨酸代謝。L-精氨酸是賈第蟲生長和增殖階段作為能量來源的偏愛營養(yǎng)物質[24]。賈第蟲水解L-精氨酸包括3個酶促反應步驟，主要涉及ADI、OTC和氨基甲酸鹽激酶（CK），同時生成ATP。盡管1分子L-精氨酸僅能生成1分子ATP，但是賈第蟲利用這條途徑較糖酵解途徑能更快地獲得ATP。L-精氨酸是一氧化氮（NO）的前體，在一氧化氮合酶（NOS）的作用下，生成NO和L-瓜氨酸。小腸上皮細胞生成的NO可抑制賈第蟲的生長、成囊以及脫囊[26]。賈第蟲通過消耗腸道中L-精氨酸，一方面抑制腸上皮細胞的增殖[27]，另一方面間接抑制上皮細胞生成NO，而小腸細胞中NO的水平對于調控水的吸收/排泄具有重要意義，可能與賈第蟲病腹瀉有關[28]。另外，ADI也可通過修飾VSP蛋白引起賈第蟲表面的抗原變異[24]。

賈第蟲滋養(yǎng)體可產(chǎn)生大小為32～200 kDa的可溶性物質，造成沙鼠的雙糖酶缺陷[29]；同時賈第蟲滋養(yǎng)體可分泌一種大小為58 kDa的“腸毒素”，通過多種信號傳導通路引起宿主腸上皮細胞的離子分泌異常和腸液積聚[30]。微陣列分析證明，賈第蟲滋養(yǎng)體與人的腸上皮細胞共孵育后可產(chǎn)生一群樹突狀細胞和淋巴細胞的趨化因子[31]，但其機制尚未確定；賈第蟲未知產(chǎn)物及脂多糖對樹突狀細胞的抑制作用是通過相同機制進行的[32]。研究發(fā)現(xiàn)無特定病原體的BALB/c小鼠口服賈第蟲ESP后，可引起以Th2型主導的免疫反應和腸嗜酸性粒細胞侵潤[33]。與此相反，研究發(fā)現(xiàn)人賈第蟲感染者似乎是以Th1型免疫反應為主[34]。

2 賈第蟲表面抗原變異

已發(fā)現(xiàn)賈第蟲表面抗原變異可幫助其實現(xiàn)免疫逃避和建立慢性感染。賈第蟲表面抗原變異現(xiàn)象首先發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)過程中，如體外培養(yǎng)的不同賈第蟲種群會分泌抗原性不同的蛋白到培養(yǎng)基中，并且識別某種表面抗原分子的特異性單克隆抗體只能和同一種群中個別賈第蟲細胞結合[35]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，賈第蟲的抗原變異在人類及實驗動物的感染過程中也會發(fā)生[36]。賈第蟲表面抗原依分離株的不同，大約6.5～13.5代發(fā)生一次變異，產(chǎn)生另一種抗原分子。研究表明，賈第蟲表面抗原變異與其致病性密切相關。Nash等[37]報道，不同蟲株以及同一蟲株內表達不同表面抗原的克隆株之間致病力不同，如GS株具有較強的致病性，接受該蟲株包囊感染的10名志愿者均可獲得感染，且5名出現(xiàn)了臨床癥狀；相反，ISR株的致病力較弱，接受該蟲株感染的5名志愿者均未出現(xiàn)臨床癥狀。此外，用GS株兩個不同克隆株感染志愿者，其中4名接受表面抗原為72 kDa的克隆株的志愿者均可獲得感染，而13名接受表面抗原200 kDa的克隆株的志愿者中，僅1名受染。

賈第蟲的抗原變異主要通過變異株特異性表面蛋白（variant specific surface proteins, VSPs）來實現(xiàn)，該蛋白覆蓋于吸盤和鞭毛等表面。VSPs分子大小為35～200 kDa，為富含半胱氨酸的蛋白質，含有高度重復的CXXC氨基酸序列（C代表半胱氨酸，X代表任意氨基酸）。此外，VSP的N末端可變性強，不同VSP的區(qū)別主要在于N末端CXXC基序的差異。VSP的C末端相當保守，約90%的氨基酸殘基在各種VSP之間是完全相同的，包含一段長約23～25個氨基酸殘基的跨膜區(qū)。C末端的5個氨基酸殘基（CRGKA）位于胞漿中。VSP還包含一段保守的GGCY基序以及一段或幾段鋅指結構域。Luján 等[38]研究發(fā)現(xiàn)VSP基本上不能糖基化，其等電點為5.3，所能結合的金屬為鋅和鐵，提示金屬離子有利于VSP的穩(wěn)定，并有助于蟲體抵抗小腸蛋白酶的分解。因而臨床上重感染者的營養(yǎng)缺乏和吸收障礙與VSP結合金屬離子的能力有直接關系。

近年來關于賈第蟲VSPs變異機制的研究主要集中在基因組及轉錄和轉錄后調控等方面。早期研究認為，VSPs的變異與編碼基因的復制和重組有關。Adam等[39]以VSPs的3' 端保守序列作為參考序列，構建系統(tǒng)進化樹；在構樹過程中逐漸向5' 端延長VSPs序列，然后觀察拓撲結構的變化。結果表明，VSP基因的復制和重組可使賈第蟲的VSPs不斷豐富。關于轉錄與轉錄后調控，早期研究發(fā)現(xiàn)，在表達某一特定VSP的蟲株中，只能檢測到編碼該VSP轉錄子[40]，表明盡管存在幾百種VSPs基因，但同時只有一個VSP基因被轉錄，而其他VSP基因處于沉默狀態(tài)。Saraiya等[41]通過對賈第蟲cDNA文庫的研究，鑒定出小分子非信使RNA（small nonmessenger RNA，snoRNA）的存在，而其中有些snoRNA與小RNA的前體十分相似，并可被酶降解為26個核苷酸的小RNA，表明賈第蟲體內可能存在RNA干擾途徑。除了表達的VSP基因外，其他所有VSPs基因均未被轉錄，其原因可能是其他mRNA被一種類似RNA干擾的機制降解掉。目前，已發(fā)現(xiàn)在賈第蟲滋養(yǎng)體內有多種小RNA，且對VSPs表達抑制并無協(xié)同作用[41]，表明賈第蟲體內可能存在大量參與VSPs表達調控的小RNA。特異性表達的VSP可以避開沉默機制而被表達于賈第蟲表面。

3 賈第蟲對宿主寄生部位（小腸）的影響

3.1 腸上皮細胞凋亡細胞凋亡（apoptosis）也稱程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），是維持正常機體內環(huán)境穩(wěn)定的一個重要調節(jié)機制，對于維持腸上皮細胞的穩(wěn)定非常重要。Caspase （cysteine aspartate-specific protease）家族是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細胞凋亡級聯(lián)反應中居中心地位，其中，caspase-3和caspase-9前體的激活、促凋亡Bax因子表達的上調、抗凋亡Bcl-2因子的表達下調、多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase, PARP] 水解等一系列反應在賈第蟲誘導凋亡過程中起重要作用[42,43]。

正常情況下腸上皮細胞凋亡不會破壞腸粘膜的完整性，但腸道病原微生物可以通過誘導腸上皮細胞凋亡來破壞腸道屏障功能[44]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)賈第蟲處理后的Caco-2細胞，其相關凋亡基因表達上調[31]；與賈第蟲共培養(yǎng)的腸上皮細胞及慢性賈第蟲病病人的腸上皮細胞均表現(xiàn)出細胞凋亡率明顯增加[42,45]。賈第蟲可通過死亡受體介導的外源性凋亡通路誘發(fā)上皮細胞凋亡[43]，Caspase可被細胞死亡信號蛋白如FasL（Fas Ligand）或Fas抗體激活，其相關死亡結構域與募集而來的pro-caspase-8死亡效應結構域（death effector domain，DED）結合形成信號復合物，使pro-caspase-8活化，變成活性Caspase-8；活性Caspase-8激活下游的Caspase-3，從而引起細胞凋亡。在線粒體介導的內源性凋亡通路中，線粒體質膜通透性增加，使位于線粒體內細胞色素C ( Cytc ) 釋放出來，Cytc能與凋亡酶激活因子-1（apoptosis protease-activating factor 1，Apaf- l）及Caspase-9形成凋亡體（apoptosome），使Caspase-9激活，接著激活其它的Caspase，如Caspase-3等，從而誘導細胞凋亡。此外，線粒體完整性缺失也能釋放凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF)，并以非caspase依賴性方式促使DNA崩解[46]。

3.2 腸上皮結構破壞和功能障礙腸上皮細胞間的連接復合體可以形成一種隔離腸腔外環(huán)境的選擇性屏障。腸上皮細胞間的連接，從頂端到基膜依次為緊密連接（tight junction, TJ）、黏附連接、橋粒和縫隙連接。其中TJ 是上皮屏障功能最重要的結構，由封閉蛋白（claudin）、閉合蛋白（occludin）、閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）等結構蛋白及各類連接蛋白共同組成[47]。這些緊密連接分子彼此相互作用并與鄰近細胞膜上緊密連接蛋白相結合，進而形成穩(wěn)定的細胞間緊密連接。在眾多緊密連接分子中，claudins是其主要成分，可以參與維持緊密連接的選擇性通透性和細胞極化。與其他TJ蛋白不同的是，ZO-1位于細胞質內膜表面并不直接參與細胞間連接的形成，而是作為一個支架連接跨膜結構蛋白和細胞骨架[48]，如ZO-1蛋白的N-末端可以和跨膜結構蛋白claudin和occludin直接結合，C-末端則與F-肌動蛋白直接結合，從而將跨膜結構蛋白與細胞骨架緊密聯(lián)系在一起。

已報道多種胃腸道功能紊亂和腸道疾病中，緊密結構的破壞可導致腸道通透性增加[44]，如ZO-1蛋白、claudin蛋白及骨架F-肌動蛋白的破壞可導致腸上皮通透性增加，進而引起腸上皮屏障功能障礙。賈第蟲介導的腸上皮通透性增加是由腸上皮細胞間連接復合體改變所引起的。慢性賈第蟲病患者腸上皮通透性的增加與claudin-1蛋白水平降低有關[45]。Buret等[49]研究證明賈第蟲可破壞緊密連接中ZO-1蛋白，增加腸上皮細胞通透性。Teoh等[50]研究結果表明賈第蟲誘導的腸上皮細胞損傷與F-肌動蛋白和α-肌動蛋白重排有關，其蛋白重排可引起腸上皮跨膜電阻降低。Scott等[51]進一步研究表明，賈第蟲誘導的ZO-1和F-肌動蛋白重排是通過肌球蛋白輕鏈激酶依賴性方式進行的。最近研究發(fā)現(xiàn)，抑制caspase-3可以阻止其破壞緊密連接中ZO-1蛋白，表明賈第蟲誘導腸上皮細胞凋亡與腸道屏障功能障礙有直接的因果關系[42]。

在賈第蟲病中無論腸上皮微絨毛是否出現(xiàn)萎縮均可引起宿主腸道吸收的總表面積減少。Troeger 等[45]運用生物電阻抗頻譜分析和腸粘膜形態(tài)測量技術，證明慢性賈第蟲病人的十二指腸表面積減小。該發(fā)現(xiàn)與賈第蟲感染者的腸上皮細胞微絨毛刷狀緣變短相符合[52]。研究資料表明，賈第蟲可誘導宿主腸上皮微絨毛刷狀緣縮短，造成機體消化和吸收不良，進而引起腹瀉。進一步的研究表明，賈第蟲感染者的消化不良是由刷狀緣多種酶的缺乏所引起的，如賈第蟲感染清除后宿主的乳糖酶含量需要幾周才能恢復，期間常常伴有腹瀉[53]。營養(yǎng)物質和電解質是通過微絨毛刷狀緣來吸收，因此微絨毛刷狀緣縮短可以減少水、葡萄糖、電解質的吸收。由于營養(yǎng)物質和電解質吸收障礙可導致滲透活性分子在腸腔堆積，使腸腔內滲透壓升高，大量水分進入腸腔，導致小腸膨脹和快速蠕動，進而引起腹瀉。此外，賈第蟲感染者大量未消化的碳水化合物可被腸腔細菌分解為短鏈脂肪酸，也可導致腹瀉[54]。另外，賈第蟲感染者由于肥大細胞脫顆粒作用和獲得性免疫應答引起的腸轉運率增加也可導致宿主腹瀉[55]。賈第蟲病患者氯化物的分泌增加可進一步加重機體腹瀉[56]。

總之，賈第蟲可通過縮短微絨毛刷狀緣，引起消化不良和吸收障礙，腸轉運率增加和陰離子分泌過多等機制導致宿主腹瀉。而這些機制與賈第蟲介導的caspase依賴性細胞凋亡和腸上皮緊密連接破壞有密切聯(lián)系。

4 結語

賈第蟲的致病機制可能涉及多種復雜的因素，主要包括賈第素、賈第蟲排泄分泌物和表面抗原變異以及賈第蟲誘導的腸上皮細胞凋亡與腸上皮結構破壞和功能障礙等。其中許多方面的詳細機制仍不明確，如在賈第蟲VSPs表達調控的RNA干擾途徑中，如何識別同源的VSP RNA，在這一過程中是否存在其他機制？蟲體主要采用哪種途徑誘導腸上皮細胞的凋亡？賈第蟲誘導腸上皮細胞凋亡是否與AIF有關[57]？腸上皮結構破壞與功能障礙究竟與哪些因素有關？這些問題仍有待于探索。未來研究應著重于關鍵致病因素以及各致病因素之間的聯(lián)系，查清賈第蟲的主要致病因子，以便為抗賈第蟲藥物和疫苗的研發(fā)提供重要的科學依據(jù)。

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RESEARCH PROGRESS ON THE PATHOGENIC MECHANISM OF GIARDIA LAMBLIA

WU Sheng, LI Guo-qing
(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Giardia lamblia is an important zoonotic parasite, and a leading cause of diarrhoeal disease in human beings and many kinds of mammals.In recent years, there have been an enormous amount of researches on the pathogenic mechanism of G.lamblia, including the cytoskeletal protein (giardin) and excretory secretory product, surface antigenic variation, and the effects of G.lamblia on small intestine of host including the enterocyte apoptosis, structural damage and dysfunction.This review summarizes the above aspects.

Giardia lamblia; pathogenic mechanism; giardin; antigenic variation; apoptosis

S852.722

：A

：1674-6422（2015）01-0064-07

2014-10-31

國家自然科學基金資助項目（31272551）

武省，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

李國清，E-mail∶ gqli@scau.edu.cn