陳 軍呂 智*

（1 山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001）

阻斷Hedgehog通路可抑制骨肉瘤mg63細(xì)胞的生長(zhǎng)

陳 軍1呂 智2*

（1 山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001）

目的 研究Hedgehog通路特異性阻斷藥物環(huán)靶明（cyclopamine）對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株mg63增殖與凋亡的影響。方法 MTT法檢測(cè)環(huán)靶明對(duì)骨肉瘤mg63細(xì)胞增殖的抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，PT-PCR檢測(cè)環(huán)靶明處理前后Gli1、PTCH1 mRNA的表達(dá)量的變化。結(jié)果 環(huán)靶明抑制mg63細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間和劑量依賴性。經(jīng)5、10、20 μmol/L的環(huán)靶明處理48 h后，骨肉瘤mg63細(xì)胞的凋亡率逐漸增高，明顯高于對(duì)照組的凋亡率（P＜0.01）。Gli1、PTCH1mRNA在mg63中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組。結(jié)論 Hedgehog通路特異性阻斷藥物環(huán)靶明能夠抑制骨肉瘤mg63細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

骨肉瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；環(huán)靶明

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的骨惡性原發(fā)腫瘤，是骨骼系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤。隨著保肢手術(shù)的開(kāi)展及新輔助化療的應(yīng)用，患者5年生存率提高到66%～75%［1-2］。但是近年來(lái)骨肉瘤的治療處于平臺(tái)期。Hedgehog（Hh）通路在人類(lèi)胚胎的發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，與眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在重要聯(lián)系。Hh通路特異性阻斷藥物能夠抑制由Hh通路引起的細(xì)胞反應(yīng)。環(huán)靶明能與Hh通路下游分子SMO特異性結(jié)合，從而阻斷Hh通路。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)環(huán)靶明體外特異性阻斷骨肉瘤mg63細(xì)胞中Hh通路的傳導(dǎo)，觀察對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響，旨在為骨肉瘤的臨床治療提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑和儀器：骨肉瘤mg63細(xì)胞購(gòu)于中科院上海生物細(xì)胞研究所。環(huán)靶明購(gòu)于美國(guó)LC Laboratories公司。DMEM和胎牛血清購(gòu)于武漢博士德公司。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自于美國(guó)Sigama公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于北京四正柏公司。Trizol mRNA提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理：人骨肉瘤細(xì)胞系mg63置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)?？瞻捉M，對(duì)照組，5 μmol/L環(huán)靶明組，10 μmol/L環(huán)靶明。培養(yǎng)48 h后檢測(cè)。

1.3RT-PCR檢測(cè)：收集處理48 h后各組細(xì)胞，Trizol法提取總mRNA。轉(zhuǎn)錄成cDNA。Gli1上游引物5-GAGATCCCACATCCTCACT-3，下游引物5-ACTTGCCAACCAGCATGCC-3，PTCH上游引物5-ATTCAACCAAACCTCTTGA-3，下游引物5-GAGTCATTAACTGGAACA-3。取cDNA及內(nèi)參18S引物各2 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)，計(jì)算各組ΔCt值。以公式N=2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4MTT法檢測(cè)mg63細(xì)胞增殖：實(shí)驗(yàn)組分別加入2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L環(huán)靶明（無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)?，?duì)照組加入等體積無(wú)水乙醇，每孔設(shè)5個(gè)副孔，48 h后MTT法測(cè)490 nm處吸光度值。另一96孔板，每孔加入10 μmol/L環(huán)靶明作用，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 d后進(jìn)行MTT檢測(cè)，記錄各孔490 nm波長(zhǎng)處吸光度值。重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mg63細(xì)胞凋亡：每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入5.0、10.0、20.0 μmol/L環(huán)靶明作用，對(duì)照組加入等體積無(wú)水乙醇，空白組加入等體積培養(yǎng)液。48 h后，AnnexinV/ PI雙染色測(cè)定細(xì)胞凋亡。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1RT-PCR：RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示，在骨肉瘤mg63細(xì)胞中Gli1、PTCH1均有表達(dá)，并且在環(huán)靶明濃度5.0和10.0 μmol/L的組中Gli1和PTCH1的mRNA表達(dá)均有下調(diào)。以18S作為內(nèi)參，擴(kuò)增Gli1和PTCH1基因，每組設(shè)3個(gè)副孔。5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的環(huán)靶明組和對(duì)照組進(jìn)行比較。結(jié)果顯示環(huán)靶明組的Gli1和PTCH1基因的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2MTT：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示環(huán)靶明對(duì)mg63細(xì)胞有明顯的抑制增殖的作用，并有一定的濃度依賴性，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其中在5.0～20.0 μmol/L處抑制明顯。10.0 μmol/L環(huán)靶明作用mg63細(xì)胞，隨著環(huán)靶明作用時(shí)間的延長(zhǎng)，mg63細(xì)胞的增殖能力明顯下降，與對(duì)照組和空白組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），環(huán)靶明不同作用時(shí)間組之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組和空白組對(duì)mg63細(xì)胞增殖的作用不明顯，二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3流式：隨著環(huán)靶明濃度的增加，骨肉瘤mg63細(xì)胞凋亡率提高。環(huán)靶明作用48 h后，5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、20.0 μmol/L組的細(xì)胞凋亡率分別為（6.56±0.78）%、（12.76±1.3）%、（25.63± 2.3）%，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（1.32±1.2）%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討 論

Hedgehog信號(hào)通路參與人類(lèi)胚胎發(fā)育和胚胎形成及后期細(xì)胞分化和生長(zhǎng)過(guò)程。于1980年由Nüsslein-Volhard C和Wieschaus E在果蠅中首先發(fā)現(xiàn)。其主要傳導(dǎo)過(guò)程可概括為Hedgehog-PTCH1-SMO-Gli。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Hh通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要的關(guān)系。其中Gli1的活化被認(rèn)為是Hh通路激活的標(biāo)志。在眾多腫瘤的研究中學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，Hedgehog通路特異性阻斷劑環(huán)靶明能夠抑制Hh通路的激活，降低Gli1的表達(dá)。其主要機(jī)制可能是環(huán)靶明能夠特異性結(jié)合SMO，使之失活，阻斷了Hedgehog通路的傳遞，使Gli1不能活化。本實(shí)驗(yàn)以骨肉瘤mg63細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)環(huán)靶明干預(yù)mg63細(xì)胞的生長(zhǎng)，來(lái)研究阻斷Hedgehog通路對(duì)骨肉瘤mg63細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為骨肉瘤的臨床治療提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Hedgehog通路在骨肉瘤mg63細(xì)胞中呈激活狀態(tài)。RT-PCR顯示PTCH1和SMO在骨肉瘤mg63細(xì)胞中高表達(dá)。因此作者認(rèn)為，使用Hedgehog通路特異性阻斷劑環(huán)靶明能夠達(dá)到抑制骨肉瘤mg63細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡的效果。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，環(huán)靶明作用骨肉瘤mg63細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)能夠降低PTCH1和Gli1的mRNA表達(dá)。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，環(huán)靶明作用48h后，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞抑制率明顯增高。10.0 μmol/L環(huán)靶明作用mg63細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的抑制可見(jiàn)有明顯的時(shí)間相關(guān)性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的提高，骨肉瘤mg63細(xì)胞的凋亡率明顯增高。上述結(jié)果提示，Hedgehog通路在骨肉瘤細(xì)胞的增殖中起到維持作用，阻斷該通路，可以抑制骨肉瘤mg63細(xì)胞的增殖。

對(duì)于Hedgehog通路怎樣導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及如何維持腫瘤增殖的機(jī)制至今仍未完全闡明。但是本實(shí)驗(yàn)研究證明，通過(guò)阻斷該通路，可以抑制骨肉瘤mg63細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。至于其機(jī)制，仍需對(duì)其下游基因及與Hedgehog通路相交互的其他通路做進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，特異性的抑制Hedgehog通路可以達(dá)到治療骨肉瘤的目的。對(duì)于骨肉瘤的生物靶向治療提供了依據(jù)。

［1］Link MP，Goorin AM，Miser AW，et al.The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity［J］.N Engl J Med，1986，314（25）：1600-1606.

［2］Meyers PA1，Heller G，Healey J，et al.Chemotherapy for nonmetastatic osteogenic sarcoma： the Memorial Sloan-Kettering experience［J］.Clin Oncol，1992，10（1）：5-15.

R738.1

B

1671-8194（2015）012-0043-02

山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專(zhuān)項(xiàng)資金（項(xiàng)目編號(hào)：2013k01）