蔣 明，陳 斌，李 智，董蓮花

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

DNA甲基化標(biāo)記及其在豬生產(chǎn)上的研究進(jìn)展

蔣 明，陳 斌*，李 智，董蓮花

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

表觀遺傳學(xué)是在不影響DNA序列變化的前提下，而發(fā)生的可遺傳基因表達(dá)的變化[1]。DNA甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象之一，它的主要作用是通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用或者改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)來抑制基因的表達(dá)[2]，啟動(dòng)子區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的DNA的甲基化作用尤其突出，DNA甲基化參與生命體活動(dòng)的很多過程，目前檢測DNA甲基化的方法有亞硫酸氫鈉處理為基礎(chǔ)的PCR方法、酶切處理為基礎(chǔ)的Southern雜交和免疫沉淀法，這些方法總的來說就是整體水平上的基因組甲基化檢測、特異性位點(diǎn)的檢測以及甲基化新位點(diǎn)的尋找。供查詢甲基化位點(diǎn)以及相關(guān)研究的數(shù)據(jù)庫有MethDB、MethCancerDB、MethyCancer和Pubmeth[3]。近年來，由于DNA甲基化的高通量檢測技術(shù)的出現(xiàn)，DNA甲基化在生物信息方面的研究得到了很大的發(fā)展。

1??DNA甲基化標(biāo)記

DNA甲基化是在甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase， DNMT）的催化作用下使得DNA序列中腺嘌呤（A）或者胞嘧啶（C）與S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基共價(jià)結(jié)合[4]，存在N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和7-甲基鳥嘌呤3種形式，主要以5-甲基胞嘧啶形式存在。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)存在3種DNMT，分別為DNMT1、DNMT2和DNMT3[5-7]。它們在DNA甲基化的建立、維持和去甲基化過程中起著非常重要的作用，DNMT1是最早被發(fā)現(xiàn)的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，與細(xì)胞內(nèi)定位和催化機(jī)能有關(guān)聯(lián)，主要功能是維持細(xì)胞分裂過程中新生鏈的DNA甲基化狀態(tài)、形式和甲基化轉(zhuǎn)移酶活性。它的過量表達(dá)可能導(dǎo)致癌癥[8]。DNMT3中又包含DNMT3a、DNMT3b與DNMT3L， 是機(jī)體在早期發(fā)育階段時(shí)DNA甲基化過程所不可缺少的一部分，參與DNA的重新甲基化過程。對于DNMT2的研究，相對的比較少，而且目前對其功能的認(rèn)識還存在爭議，因?yàn)樗募谆富钚苑浅５娜酢?/p>

甲基化主要是在CpG二核苷酸位點(diǎn)，在DNA序列中的某些區(qū)域，CpG序列密集，達(dá)到均值5倍以上的密度，鳥嘌呤和胞嘧啶在這些區(qū)域富集，我們稱之為CpG島（CpG island），CpG島的維持是靠生命體進(jìn)化來完成的。由于5-甲基胞嘧啶可以與胸腺嘧啶相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致CpG在哺乳動(dòng)物基因組中的分布是不均勻的，研究表明，基因啟動(dòng)子和第一外顯子處沒有甲基化的CpG占其CpG總量的50%以上[9]，但是對于整個(gè)生命體來說，將近80%的CpG均發(fā)生甲基化，而且通常位于組織特異基因的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)座元件，這些地方往往是染色體著絲粒的重復(fù)區(qū)域和重復(fù)序列所在處[10]。啟動(dòng)子區(qū)CpG甲基化的異常會抑制轉(zhuǎn)錄的過程，有研究顯示，CpG的甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄活性呈負(fù)相關(guān)，如果CpG高密度的甲基化將會徹底的抑制啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄過程。

2??甲基化與基因組印記

哺乳動(dòng)物的絕大多數(shù)基因進(jìn)行父母雙方的等位基因表達(dá)，等位基因表觀遺傳的不對稱修飾將會導(dǎo)致基因組印記，這樣的等位基因歸類為“印記基因”，呈現(xiàn)出差異性表達(dá)，使得后代在轉(zhuǎn)錄表達(dá)的時(shí)候只繼承親本一方的遺傳信息，而親本的另一方處于沉默狀態(tài)，其中父本等位基因處于沉默狀態(tài)的稱之為父系印記，反之亦然。DNA甲基化是調(diào)控印記的重要方式之一，在印記的維持中起著舉足輕重的作用，是印記所必須的。印記基因常常伴隨著差異甲基化區(qū)（differentially methylated regions，DMRs），DNA通過甲基化修飾抑制順式作用元件和反式作用因子的結(jié)合，使得基因的表達(dá)量或者是其表達(dá)的狀態(tài)從本質(zhì)上改變，繼而導(dǎo)致基因的表達(dá)成為了單等位，即基因印記。哺乳動(dòng)物體內(nèi)印記基因的甲基化的建立是在兩個(gè)不同的發(fā)育階段[11]，第1階段為合子階段，生殖細(xì)胞發(fā)育的時(shí)候，印記是消失的，這個(gè)階段DNA甲基化水平得到了大幅度的上升，等到精子和卵細(xì)胞結(jié)合成合子后，基因組印記開始建立并維持甲基化；第2階段為合子植入后期，處于該階段的基因進(jìn)行二次甲基化，同時(shí)引起次級印記的建立，這次印記的建立是可以遺傳的，并存在于整個(gè)生命過程中。

3??甲基化與X染色體失活

雌性動(dòng)物體內(nèi)含有2條X染色體，雄性動(dòng)物體內(nèi)含有1條X染色體，1條Y染色體，胚胎發(fā)育的早期階段，為了使雌性與雄性性染色體在表達(dá)上的劑量平衡，雌性動(dòng)物體內(nèi)會隨機(jī)失活一條X染色體來滿足早期胚胎的生長發(fā)育，X染色體失活（X-chromosome inactivation，XCI）是表觀遺傳修飾的重要組成部分，是一個(gè)非常系統(tǒng)化的過程。X失活中心(X-inactivationcenter，XIC)是X染色體失活的核心，由不編碼蛋白質(zhì)的RNA（noncoding RNA）對其核心進(jìn)行調(diào)節(jié)和 修 飾， 其 中RNA Xist(Inactive X-specifictranscript)最為重要，這段RNA的長度為17 kb，它的主要職能是招募Polycomb蛋白質(zhì)(復(fù)合物蛋白)，這種蛋白質(zhì)可以包裹X染色體，從而使得X染色體沉默[12]。曹更生等[13]研究表明克隆Holstein奶牛囊胚Xist基因的DNA甲基化程度是處于較低水平，其中來源胎兒成纖維細(xì)胞（FFB）的Xist基因甲基化程度為43%，輸卵管上皮細(xì)胞處的比較少，僅僅只有17%，與體細(xì)胞相比，Xist基因比胚胎時(shí)期高，尤其是輸卵管處的甲基化，比前者足足高了46%，即Xist基因的甲基化不是一成不變的，而是可以被重新編碼。陳潔等[14]為了研究DNA甲基化在核移植過程中是否也是充分表觀重編碼，通過亞硫酸氫鹽測序法，對比分析H19與Xist基因在核移植牛與正常牛肺臟的DNA甲基化程度，結(jié)果顯示核移植牛的Xist甲基化程度比正常的高，但是他們二者之間的差異不顯著，即核移植過程中DNA甲基化可能出現(xiàn)不完全重編碼，而其他動(dòng)物之間是否也會出現(xiàn)以上的現(xiàn)象，還有待科研者做進(jìn)一步的研究。

4??甲基化與核小體定位

核小體是染色質(zhì)的基本構(gòu)成單位，核小體與核小體之間以Linker DNA連接，并形成念珠狀結(jié)構(gòu)。在真核生物的細(xì)胞中， H4、H3、H2B和H2A這4種組蛋白各2組拷貝被DNA分子盤繞形成組蛋白八聚體。組蛋白八聚體在DNA雙螺旋上的具體位置稱之為核小體定位。細(xì)分可將核小體定位兩類[15]：1)染色體座位相對于DNA中心點(diǎn)的平移定位；2)組蛋白結(jié)合表面與DNA雙螺旋的旋轉(zhuǎn)定位。目前研究表明，核小體定位與調(diào)控進(jìn)化、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程中有著十分重要的作用。組蛋白本身具有靜電位阻的作用，這個(gè)功能可以阻止其他蛋白質(zhì)與核小體DNA結(jié)合的機(jī)會，這些蛋白質(zhì)包括RNA聚合酶、DNA聚合酶以及其他類負(fù)責(zé)生命過程的酶類，只有缺乏核小體的區(qū)域，基因轉(zhuǎn)錄才可以被啟動(dòng)，遺傳信息才能得以表達(dá)[16]。當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)定位有核小體，而且核小體占據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子將不能與TFBS相結(jié)合，基因的轉(zhuǎn)錄過程被抑制。劉宏德等[17]通過研究和分析TFBS和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）周圍核小體定位情況和DNA甲基化與核小體定位之間的聯(lián)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TSS與TFBS周圍核小體的變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，處于定位和缺失的一個(gè)循環(huán)狀態(tài)，DNA甲基化與核小體定位在TFBS之間是一種互補(bǔ)狀態(tài)，核小體定位和DNA低甲基化之間有關(guān)聯(lián)，在TSS周圍，卻是以同步模式存在，即DNA高甲基化的同時(shí)也會提高核小體水平。Chodavarapu等[18]通過對擬南芥的大量單核小體進(jìn)行全基因組核小體定位分析，表明核小體DNA處的甲基化程度高于側(cè)翼部位的DNA，核小體的定位影響整個(gè)基因組中DNA的甲基化模式，DNMT偏向于以核小體DNA為靶體，這個(gè)現(xiàn)象同樣在人類基因組中出現(xiàn)，即核小體與DNA甲基化之間的聯(lián)系是保守的，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)核小體在外顯子處富集，尤其偏向定位于外顯子和內(nèi)含子的邊界。

5??甲基化相關(guān)的miRNAs

microRNA(miRNAs)是 一 類 內(nèi)源性的非編碼RNA分子，長度大約為22～24個(gè)核苷酸[19]，大部分的miRNAs在那些容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的染色體區(qū)域定位，而且小RNA在進(jìn)化過程中的保守性非常的高，靶mRNA能夠特異性地與miRNA堿基互補(bǔ)配對，降解mRNA或抑制mRNA的翻譯過程，從而對基因的轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行表達(dá)調(diào)控[20]。miRNA的產(chǎn)生和作用過程需要2個(gè)關(guān)鍵酶：DCL1和AGO1。它們是miRNA能夠穩(wěn)定維持的重要酶類，目前研究發(fā)現(xiàn)，miRNA168與miRNA162在AGO1和DCL1的作用下合成，這兩個(gè)miRNA的存在使得miRNA的產(chǎn)生和作用機(jī)制處于一個(gè)反饋調(diào)控的系統(tǒng)之中[21]。miRNA編碼的基因啟動(dòng)子序列的CpG島可以發(fā)生DNA的甲基化，DNA甲基化引起的表達(dá)沉默能夠?qū)iRNA在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)，miRNA也可以對表觀遺傳進(jìn)行調(diào)控，前面介紹過DNA甲基化是在甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase， DNMT）的催化作用下使得DNA序列中腺嘌呤（A）或者胞嘧啶（C）與S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基共價(jià)結(jié)合的過程，miRNA可以影響DNMT的表達(dá)從而調(diào)節(jié)DNA的甲基化[22]，Han等[23]在研究結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116時(shí)發(fā)現(xiàn)，DNA的甲基化能夠調(diào)控約為10%左右的miRNA，原因在于CpG島高水平的去甲基化能夠引起這些基因的重新表達(dá)。Zhou X等[24]還發(fā)現(xiàn)人類被miRNA編碼的基因的上流區(qū)域中有三分之一內(nèi)含有CpG島，而且許多miRNAs（如：miR-124a、miR-137、miR-25等 ）的異常甲基化將會導(dǎo)致基因的表達(dá)沉默，繼而導(dǎo)致腫瘤的形成，因此加強(qiáng)對DNA甲基化與miRNA的研究意義重大。

6??DNA甲基化與豬的胴體性狀、生長性狀的關(guān)聯(lián)

在豬的實(shí)踐育種工作中，常常采用選種選配的手段對種公畜和母畜進(jìn)行合理的搭配，利用雜種優(yōu)勢來提高胴體重、瘦肉率、屠宰率以及眼肌面積等胴體性狀，雜種優(yōu)勢的機(jī)制是基因的加性效應(yīng)以及非加性效應(yīng)的互補(bǔ)，這些機(jī)制在實(shí)際操作過程中存在一些不足，給雜種優(yōu)勢的預(yù)測帶來一定的困難，近年來，科研者開始將目光轉(zhuǎn)向分子水平。隨著甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術(shù)的成熟，人們開始探討豬的基因組中CpG島上個(gè)體DNA基因甲基化差異對胴體性狀、生長性狀的影響。蔣曹德等[25]從3個(gè)層次（個(gè)體特殊甲基化百分差異、個(gè)體中性甲基化百分差異和個(gè)體全部甲基化百分差異）對大白和梅山豬二元雜的胴體性狀進(jìn)行分析，結(jié)果顯示各性狀值是隨著個(gè)體特殊甲基化百分差異的變化而變化的，同時(shí)經(jīng)過回歸分析得出平均背膘厚、平均臀部背膘厚等性狀與特殊甲基化百分差異顯著，DNA甲基化標(biāo)記是可以在分子標(biāo)記中作為理論根據(jù)的。楊春[26]對萊蕪豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和胃7個(gè)組織用熒光定量化敏感擴(kuò)增片段多態(tài)性方法（fluorescent labeled methylation sensitive amplified polymorphism，F(xiàn)MSAP）進(jìn)行全基因組DNA甲基化研究。結(jié)果顯示，不同組織之間的甲基化程度都不顯著，但肌肉組織總的DNA甲基化程度在所有組織中是最高的，肝臟的最低，楊思強(qiáng)[27]還發(fā)現(xiàn)DNA的甲基化與豬的睪丸生成過程也有一定的聯(lián)系，4～30日齡時(shí)，睪丸中的甲基化主要集中在間質(zhì)區(qū)域，這時(shí)睪丸也是以間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育為主，表明睪丸基因的甲基化與其發(fā)育程度同步。

7??小結(jié)

DNA甲基化在真核生物中是一種非常重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，能夠在不影響DNA序列變化的前提下，而引起可遺傳基因表達(dá)的變化，甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸位點(diǎn)，是在甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化作用下使得DNA序列中腺嘌呤或者胞嘧啶與S-腺苷甲硫氨酸上的甲基共價(jià)結(jié)合的產(chǎn)物，在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)存在DNMT1、DNMT2和DNMT3這3種甲基化轉(zhuǎn)移酶，它們在DNA甲基化的建立、維持和去甲基化過程中起著非常重要的作用。DNA甲基化與基因組印記、X染色體失活和核小體定位之間有著密切關(guān)系，而且還影響著動(dòng)物的胴體品質(zhì)、生長性狀和疾病生成的機(jī)制，有著非常重要的研究意義。

[1] Madrigano J， Baccarelli A，Mittleman M A， et al. Aging and epigenetics[J].Epigenetics， 2012， 7(1)：63-70.

[2] 趙云雷，葉武威，王俊娟，等.DNA 甲基化與植物抗逆性研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2009，29 (7)： 1479-1489.

[3] 凡時(shí)財(cái)，張學(xué)工.DNA甲基化的生物信息學(xué)研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009， 36(2)： 143-150.

[4] 趙敬賢，張路培，高會江，等.全基因組DNA甲基化圖譜及其在動(dòng)物遺傳育種中的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013， (9)： 47-53

[5] Song J， Rechkoblit O， Bestor T H， et al. Structure of DNMT1-DNA complex reveals a role for autoinhibition in maintenance DNA methylation[J]. Science，2011，331(6020)： 1036-1040.

[6] Raddatz G， Guzzardo P M， Olova N，et al. Dnmt2-dependent methylomes lack defined DNA methylation patterns[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110(21)： 8627-8631.

[7] O'Doherty A M， O'Shea L C，F(xiàn)air T. Bovine DNA methylation imprints are established in an oocyte size-specific manner，which are coordinated with the expression of the DNMT3 family proteins[J]. Biology of reproduction，2012，86(3)： 67.

[8] 吳瓊， 邵國， 張培禮. DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶與乳腺癌相關(guān)性的研究進(jìn)展[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2013， 29(6)： 134-136.

[9] Deaton A M， Bird A. CpG islands and the regulation of transcription[J]. Genes & development， 2011， 25(10)：1010-1022.

[10] Sandoval J， Heyn H， Moran S， et al. Validation of a DNA methylation microarray for 450，000 CpG sites in the human genome[J]. Epigenetics，2011， 6(6)： 692-702.

[11] 胡嘉祺. Dlk1-Dio3 印記區(qū)域 Meg8基因及 IG-DMR 在體細(xì)胞核移植牛中DNA 甲基化狀態(tài)分析[D].保定： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

[12] Wutz A. Gene silencing in X-chromosome inactivation：advances in understanding facultative heterochromatin formation[J]. Nature Reviews Genetics，2011，12(8)：542-553.

[13] 曹更生，高宇，戴蘊(yùn)平，等.牛不同供體核克隆囊胚 Xist 基因 DNA 甲基化程度的比較研究[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006，33(10)：994-999.

[14] 陳潔，李冬杰，劉艷琴，等.體細(xì)胞核移植牛肺臟中 H19 和 Xist 基因的 DNA 甲基化狀態(tài)[J]. 科學(xué)通報(bào)，2008，53(11)： 1305-1310.

[15] Albert I， Mavrich T N， Tomsho L P， et al. Translational and rotational settings of H2A. Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiaegenome[J]. Nature，2007，446(7135)： 572-576.

[16] Brogaard K， Xi L， Wang J P， et al. A base pair resolution map of nucleosome positions in yeast[J]. Nature， 2012， 486(7404)： 496.

[17] 劉宏德， 孫嘯. 核小體定位模式及其與 DNA 甲基化位點(diǎn)分布的關(guān)系[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)， 2011，27(3)： 248-253.

[18] Chodavarapu R K， Feng S，Bernatavichute Y V， et al. Relationship between nucleosome positioning and DNA methylation[J]. Nature， 2010， 466(7304)：388-392.

[19] 蔣明，冉茂良，陳斌，等.哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號通道與自噬的相關(guān)研究[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26（7）：1738-1745

[20] O'Donnell K A， Wentzel E A， Zeller K I， et al. c-Mycregulated microRNAs modulate E2F1 expression[J]. nature， 2005，435(7043)： 839-843.

[21] Balmer D， Mauch-Mani B. Small Yet Mighty MicroRNAs in Plant-Microbe Interactions[J]. MicroRNA，2013， 2(1)： 73-80.

[22] 王峰， 秦環(huán)龍.大腸癌 microRNA 與DNA甲基化修飾相互調(diào)控的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2010，18(8)： 808.

[23] Han L，Witmer P D W，Casey E，et al.DNA methylation regulates MicroRNA expression[J]. Cancer Biology and Therapy，2007，6(8)： 1284.

[24] Zhou X， Ruan J， Wang G， et al. Characterization and identification of microRNA core promoters in four model species[J]. PLoS computational biology， 2007，3(3)：412-423.

[25] 蔣曹德，鄧昌彥，熊遠(yuǎn)著.豬個(gè)體 DNA甲基化百分差異與胴體性狀的關(guān)系[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13(2)： 179-185.

[26] 楊春.豬不同組織和不同品種肌肉組織基因組 DNA 甲基化分析 [D].長春：吉林大學(xué)，2011.

[27] 楊思強(qiáng).仔豬睪丸組織 DNA 甲基化及印記基因表達(dá)的研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

2014-09-01）

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金贊助（CARS-36）

*通訊作者：陳斌，chenbin7586@126.com