Klotho蛋白與血管內(nèi)皮關(guān)系研究進(jìn)展

林雅軍胡剛魏潔

(衛(wèi)生部北京醫(yī)院衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京100730)

關(guān)鍵詞〔〕Klotho蛋白；衰老；血管內(nèi)皮細(xì)胞

中圖分類號〔〕R592〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

第一作者：林雅軍(1976-)，男，博士，副研究員，主要從事細(xì)胞衰老研究。

血管內(nèi)皮功能失調(diào)是諸多心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的始動因子。冠心病患者及糖尿病患者血管內(nèi)皮功能明顯受損〔1，2〕。研究〔3〕發(fā)現(xiàn)Klotho(KL)基因缺陷小鼠的動脈發(fā)生類似人類動脈粥樣硬化樣病理變化及人類早衰樣癥狀。本文探討KL基因與血管內(nèi)皮功能的關(guān)系及二者對老年相關(guān)疾病的影響。

1KL基因和蛋白的特征

KL是以希臘紡織生命線的女神命名的，是1997年Kuro-o〔4〕從一個基因突變小鼠發(fā)現(xiàn)的，此種小鼠表現(xiàn)出類似人類早衰綜合征樣的多種異常表型。人和小鼠KL基因定位于染色體13q12區(qū)域，大鼠則定位于染色體12q12區(qū)域。KL基因全長約50kb，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子。在KL基因結(jié)構(gòu)中存在一個潛在的可變剪切位點(diǎn)，這一位點(diǎn)如果接受了一個50bp片段的插入，該插入序列末尾的兩個核苷酸TA就會與外顯子4的第一個核苷酸G共同構(gòu)成一個終止密碼TAG，使得DNA由此截?cái)嘈纬梢粋€短的開放閱讀框，僅含有3個外顯子，編碼分泌型KL蛋白。但如果可變剪切位點(diǎn)沒有50bp片段的插入，其將編碼具有1 014個氨基酸的模型KL蛋白。人膜型KLcDNA全長3 036bp、分泌型cDNA全長1 647bp；小鼠和大鼠膜型KLcDNA長度相同為3 042bp，小鼠分泌型為1 650bp，而大鼠無分泌型。人與小鼠的KLcDNA有80%的同源、與大鼠有83%的同源〔5〕。

KL蛋白的細(xì)胞外區(qū)域由KL1和KL2兩個同源區(qū)域構(gòu)成。每一個區(qū)域與哺乳動物乳糖-皮根苷水解酶同源，與細(xì)菌和植物的β-糖苷酶同源〔2〕。其具有外切糖苷酶活性，能夠水解糖類、糖蛋白和糖脂β-糖苷鍵。通過一個未知的酶切掉細(xì)胞外區(qū)域(帶有或不帶質(zhì)膜區(qū)域)產(chǎn)生KL蛋白的分泌型，其存在血液、尿液和腦脊液。另外，如果在第三個外顯子處發(fā)生切割會產(chǎn)生僅僅包含KL、而KL跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)缺失的另一種分泌型的KL蛋白〔6〕。因此，KL基因至少產(chǎn)生3種蛋白：膜型和兩個分泌型，也就是膜型KL蛋白脫落產(chǎn)生的整個胞外功能區(qū)，和由選擇性剪切酶剪切形成的胞外功能區(qū)。

KL基因在有限的組織中表達(dá)，主要在腎臟遠(yuǎn)曲小管和腦脈絡(luò)膜表達(dá)。在腦垂體、甲狀旁腺、胰腺、睪丸、卵巢、胎盤、骨骼肌、膀胱、結(jié)腸和內(nèi)耳中也表達(dá)〔5〕。在KL基因突變小鼠(轉(zhuǎn)基因純和小鼠)，KL基因表達(dá)受到抑制，表明在KL基因5′端進(jìn)行的插入突變產(chǎn)生一個嚴(yán)重的下效等位基因〔4〕；并且通過常規(guī)基因靶向處理能夠產(chǎn)生無效等位基因〔7〕。無效等位基因的純合子(KL-/-)小鼠表現(xiàn)出與下效等位基因純合子小鼠(KL突變小鼠)相同的衰老表型。KL-/-小鼠和KL基因突變小鼠在本文中通稱為KL基因缺陷小鼠。

2KL基因缺陷小鼠血管內(nèi)皮改變

KL基因缺陷小鼠能夠正常生長到3w，并且在外形上與其同窩野生型小鼠沒有顯著差別。然而，從3w起直至其8～9w后死亡，其停止生長。盡管在發(fā)育過程中出現(xiàn)多種類似人類衰老的異常，但是至今沒有發(fā)現(xiàn)其特殊的死因〔4〕。

KL基因缺陷的小鼠在出生4w后即可出現(xiàn)動脈硬化，并隨增齡而加重，表現(xiàn)為主動脈嚴(yán)重鈣化，肌性中動脈中層鈣化、內(nèi)膜增厚，腎臟小動脈嚴(yán)重鈣化等，這些血管變化與人類動脈硬化非常相似。把外源性正常KLcDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)給KL基因缺陷小鼠后，其動脈硬化程度可得到顯著改善〔8〕。

組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)和其抑制劑(PAI)-1是纖溶系統(tǒng)的主要成分，是纖溶系統(tǒng)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)物質(zhì)，在纖溶系統(tǒng)的活化過程中占有重要的地位。兩者之間的動態(tài)平衡對維持正常的血液流動有著重要意義。兩者失衡將導(dǎo)致出血或血栓形成。成小苗等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，KL基因缺陷小鼠血漿活化PAI-1抗原和多種組織PAI-1mRNA水平顯著提高。升高的PAI-1與年齡和異位鈣化進(jìn)展及腎臟腎小球纖維沉積相關(guān)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)PAI-1mRNA在腎小管內(nèi)皮細(xì)胞，心肌細(xì)胞，腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞和M?nckeberg動脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。

血管內(nèi)皮作為循環(huán)血液與血管平滑肌之間的中介組織，除具有天然屏障作用外，還具有調(diào)節(jié)血管張力、參與血管腔內(nèi)止血過程和調(diào)控血管平滑肌增殖的功能。這些功能是通過血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一系列血管活性物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。一氧化氮(NO)為主要的舒張松弛因子，內(nèi)皮素(ET)為主要的縮血管因子，這兩類活性物質(zhì)相互對立又相互聯(lián)系，共同維持血管及血液內(nèi)環(huán)境的平衡。Maekawa等〔10〕觀察到KL基因缺陷小鼠依賴乙酰膽堿的主動脈舒張功能較野生型明顯下降，證實(shí)了KL基因缺陷小鼠內(nèi)皮源性NO較野生型生成減少，NO合成減少可能是KL基因缺陷小鼠易發(fā)生動脈硬化的原因。RT-PCR檢測表明血管內(nèi)皮細(xì)胞中無KL基因表達(dá)，推測KL基因維持血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO可能是通過其分泌型的KL蛋白或者由KL蛋白介導(dǎo)的循環(huán)因子來實(shí)現(xiàn)的。為驗(yàn)證這一推測，研究進(jìn)行了KL基因缺陷小鼠與野生型的聯(lián)體結(jié)合試驗(yàn)，在聯(lián)體飼養(yǎng)2w后發(fā)現(xiàn)主動脈的舒張功能明顯增強(qiáng)，4w后主動脈和提睪肌動脈的舒張功能趨于正常，與野生型無明顯差異，進(jìn)一步證實(shí)了KL蛋白作為循環(huán)因子與血管內(nèi)皮細(xì)胞失調(diào)的相關(guān)性〔10，11〕。在隨后的研究中以存在多種動脈硬化危險(xiǎn)因素的自發(fā)性2型糖尿病(OLETF)大鼠為研究對象，經(jīng)腺病毒將KL基因?qū)隣LETF大鼠后可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，增加內(nèi)皮細(xì)胞的NO合成，同時(shí)還具有減輕血管周圍組織纖維化、逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)、降低血壓的作用，而這些對減輕動脈硬化都有重要作用。以上研究均表明KL基因與內(nèi)皮功能失調(diào)、NO合成及動脈硬化存在因果關(guān)系。鑒于KL基因在動脈硬化發(fā)病中的重要作用，補(bǔ)充KL蛋白或者針對KL基因的治療可能在改善動脈硬化方面有益。

Fletcher等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-21治療OLETF大鼠10w后，血管內(nèi)皮細(xì)胞NO合成增加，腎臟KL基因的表達(dá)上調(diào)，血糖、血壓、血脂等代謝紊亂得到改善，分析原因可能與腎臟具有豐富的KL基因表達(dá)和曲格列酮治療可減輕腎臟損害有關(guān)，但是否直接通過上調(diào)KL基因表達(dá)而出現(xiàn)上述作用還不明確。Masuda等〔13〕在基因補(bǔ)救治療方面做了進(jìn)一步研究，他們在KL基因缺陷小鼠中導(dǎo)入了可被鋅誘導(dǎo)的KL基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)融合了一個金屬硫蛋白-1啟動子的外源性KL基因，可在鋅誘導(dǎo)下表達(dá)KL基因。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過鋅水飼養(yǎng)后KL基因缺陷小鼠的動脈粥樣硬化損傷可逐漸減輕，經(jīng)過11w后原損傷可完全消失，以上實(shí)驗(yàn)證明了基因補(bǔ)救治療的有效性。

3KL蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制

KL蛋白主要參與體內(nèi)鈣磷代謝，維持體內(nèi)鈣磷平衡，此外，其還參與胰島素抗性過程和對活性氧物質(zhì)的抗性等〔14〕，而其對血管內(nèi)皮的功能主要包括以下方面：

3.1抗炎KL蛋白能夠抑制由腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)黏附分子(ICAM)-1和血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1的表達(dá)及核因子(NF)-κB活性和人NF-κB抑制蛋白(IKB)磷酸化。而且KL蛋白能夠逆轉(zhuǎn)TNF引起的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化抑制。KL蛋白能夠抑制單核細(xì)胞黏附于HUVEC，在大鼠主動脈器官培養(yǎng)中抑制黏附分子表達(dá)〔15〕。

3.2抗氧化KL蛋白能夠通過激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路和促進(jìn)NO生成來增加錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)KL蛋白能夠抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的HUVEC中活性氧(ROS)生成〔16〕。另有報(bào)道KL蛋白能夠通過CAMP-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信號通路增加血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶活性〔17〕。

3.3抗凋亡研究發(fā)現(xiàn)KL蛋白過度表達(dá)能夠減少過氧化氫(H2O2)誘發(fā)的SV40轉(zhuǎn)化的非洲綠猴骨細(xì)胞(COS)-1和Jurkat細(xì)胞凋亡，能夠減少H2O2和依托泊苷誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。通過SA-β-gal染色發(fā)現(xiàn)KL蛋白能夠干預(yù)H2O2誘發(fā)的細(xì)胞早衰。證實(shí)經(jīng)重組KL蛋白處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，其Caspase-3和Caspase-9的活性明顯下降，而p53和p21表達(dá)也下調(diào)，提示KL蛋白有抗衰老和細(xì)胞凋亡的作用。由于內(nèi)皮細(xì)胞衰老和凋亡是動脈硬化的重要環(huán)節(jié)，可見KL基因還可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞衰老和凋亡而防止動脈硬化〔18〕。Carracedo等〔19〕曾也在內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到KL蛋白有抗凋亡和氧化應(yīng)激的作用。

3.4促進(jìn)血管生成對單側(cè)下肢缺血的KL基因缺陷小鼠模型進(jìn)行激光多普勒血流分析表明，KL基因缺陷小鼠缺血與正常的激光多普勒血流比例減少。主動脈環(huán)培養(yǎng)分析表明KL基因缺陷小鼠血管生成受損，并伴隨內(nèi)皮來源的NO釋放減少。而且與野生型小鼠比較，移植同源骨髓細(xì)胞摻入缺血組織毛細(xì)血管的比率降低，伴隨骨髓和外周血中c-kit+CD31+內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)樣的單核細(xì)胞減少。3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑——西立伐他汀和匹伐他汀能夠恢復(fù)KL基因缺陷小鼠新生血管的損傷，伴隨骨髓和外周血中c-kit+CD31+細(xì)胞增加，并且增加主動脈環(huán)培養(yǎng)中的血管生成〔20，21〕。

研究表明人類KL基因多個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與動脈硬化性疾病相關(guān)，如KL基因C1818T多態(tài)性CT基因型與老年人特別是老年男性的急性冠脈綜合征發(fā)病存在相關(guān)性〔22〕；KL基因395A等位基因與動脈硬化呈負(fù)相關(guān)；對79歲以上的人群研究發(fā)現(xiàn)，KL-VS等位基因雜合子的5年生存率較高，提示雜合子更具有長壽優(yōu)勢。同時(shí)發(fā)現(xiàn)高密度脂蛋白膽固醇和收縮壓同KL-VS基因型有關(guān)，雜合子發(fā)生腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)性較低，純合子發(fā)生腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)性最高?？傊?，KL蛋白能夠通過抗炎、抗氧化、抗凋亡和促進(jìn)血管生成等方面作用保護(hù)血管內(nèi)皮免受有害因子的損傷，預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生，有望減少老年人心腦血管疾病的發(fā)生率和病死率。

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〔2013-12-17修回〕

(編輯杜娟)