陳新華

(東?？h畜牧獸醫(yī)站,江蘇東海 222300)

雞傳染性法氏囊病的診斷

陳新華

(東?？h畜牧獸醫(yī)站,江蘇東海 222300)

本文通過對(duì)東海縣八例疑似雞傳染性法氏囊感染病例的流行病學(xué)資料分析，臨床癥狀，剖檢病理變化進(jìn)行的觀察，臨診診斷為傳染性法氏囊病毒感染。收集病料送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷，通過瓊脂凝膠沉淀實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)，其中六例為誤診，兩例確診為雞傳染性法氏囊病。

雞 傳染性法氏囊病 診斷與防治

雞傳染性法氏囊?。↖BD）是由傳染性法氏囊病病毒引起的一種急性、高度傳染性疾病。該病發(fā)病突然、病程短，出現(xiàn)腹瀉、顫抖、極度虛弱的癥狀。法氏囊水腫和腎臟腫脹，腿肌和胸肌出血、腺胃和肌胃交界處條狀出血，是IBD特征性的病變。

1 發(fā)病情況

病例1：東?？h雙店鎮(zhèn)前雙村王某于2015年4月上旬購進(jìn)當(dāng)?shù)夭蓦u150只進(jìn)行圈養(yǎng)至40日齡時(shí)，發(fā)現(xiàn)雞精神不振、食欲差、拉稀、發(fā)病雞有44只，發(fā)病率36.6%，1d內(nèi)死亡28只，死亡率18.6%，縣獸醫(yī)站門診獸醫(yī)通過詢問王某得知，雞群在飼養(yǎng)期間分別在8日齡和22日齡用新城疫IV系苗飲水進(jìn)行二免外，未做其他免疫。

病例2：東海縣石榴鎮(zhèn)蔣習(xí)村姜某2015年4月中旬購進(jìn)蛋雞500只圈養(yǎng)，飼養(yǎng)至42日齡時(shí)，雞突然發(fā)病，精神不振，排出白色稀糞，發(fā)病雞有70多只，發(fā)病率為14%，2d內(nèi)共死亡48只，死亡率為9.6%。死亡之速度快，死亡率高，縣獸醫(yī)站門診獸醫(yī)通過了解姜某得知，雞群在飼養(yǎng)期間7日齡和14日齡分別用新支H120和中等毒力法氏囊苗飲水免疫2次，未做其他免疫。

病例3：東?？h牛山鎮(zhèn)張莊村張某2015年5月上旬購進(jìn)當(dāng)?shù)夭蓦u100只飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至46日齡時(shí)雞突然發(fā)病；有1/3雞精神不振，排出黃白或黃綠色稀糞，發(fā)病率為35%，由于張某就診及時(shí)，病雞死亡數(shù)量不大，死亡率約9%，門診醫(yī)生通過了解張某得知，雞在飼養(yǎng)期間未用過任何疫苗免疫。

病例4：東海縣牛山鎮(zhèn)河塘村養(yǎng)雞戶盧某2015年5月上旬購蛋雞4000多只圈養(yǎng)，飼養(yǎng)至58日齡時(shí)，雞群突然發(fā)病、拉稀、精神不振、發(fā)病雞大約有1/3，發(fā)病率為34%，2d內(nèi)死亡460多只，死亡率11.5%，通過向王某了解得知，該雞群在飼養(yǎng)期間于7日齡和21日齡分別用新支H120和新城疫IV免疫2次，在14日齡和28日齡用中等毒力傳染性法氏囊病疫苗免疫2次，其他未做免疫。

病例5：東?？h青湖鎮(zhèn)青南村李某在2015年5月中旬購肉雞300只，飼養(yǎng)至37日齡時(shí)，雞突然發(fā)病，發(fā)病雞有150多只，發(fā)病率達(dá)50%，排白色綠色稀糞，死亡率46%，門診醫(yī)生詢問戶主得知，飼養(yǎng)期間在7日齡和14日齡時(shí)分別使用新支H120和中等毒力法氏囊苗飲水免疫2次，另外，未做其他免疫。

病例6：東海縣石榴鎮(zhèn)馬圩村陳某在2015年5月中旬購當(dāng)?shù)夭蓦u400只，飼養(yǎng)至46日齡時(shí)，雞突然發(fā)病，精神沉郁，食欲減少，排出黃白色或黃綠色稀糞，發(fā)病雞有200余只，發(fā)病率為50%，死亡率達(dá)15%，門診醫(yī)生詢問陳某得知，此雞群飼養(yǎng)期間在7日齡和22日齡時(shí)用新城疫IV系苗飲水免疫2次，另外，未做其他免疫。

病例7：東?？h曲陽鄉(xiāng)曹莊村曹某在2015年4月下旬購肉雞800只，飼養(yǎng)至45日齡時(shí)，該雞群有300余只雞發(fā)病，發(fā)病率達(dá)37.5%，死亡率達(dá)20%，該雞發(fā)病突然，死亡速度快，排出白色稀糞。門診醫(yī)生詢問得知，此雞群在飼養(yǎng)期間8日齡和23日齡分別用新支H120和新城疫IV飲水免疫兩次，另外未做其他免疫。

病例8：東?？h牛山鎮(zhèn)鄭莊村鄭某在2015年4月下旬購草雞200只，飼養(yǎng)至58天時(shí)，該雞群有1/2的雞發(fā)病突然，發(fā)病率達(dá)50%，死亡率為18%，該雞據(jù)鄭某講在自己院子里養(yǎng)，飼養(yǎng)期間未使用過任何疫苗。

2 診斷

采集以上病例病雞做病理解剖，8個(gè)病例均發(fā)現(xiàn)法氏囊腫大，疑似為雞傳染性法氏囊病，進(jìn)一步送實(shí)驗(yàn)室做了診斷。

2.1 診斷試劑

蒸餾水、氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；瓊脂粉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；已知標(biāo)準(zhǔn)卵黃抗體（實(shí)驗(yàn)室提供）；Taq DNA 聚合酶、dNTP購自上海華美生物工程公司；AMV購自Promega公司；Agarose為西班牙產(chǎn)品；100bp DNA Marker、200bp DNA Marker購自TaKaRa公司（大連）；Trizol 為Invitrogen公司產(chǎn)品；DEPC購自BBI公司；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2.2 主要儀器

恒溫箱（上?？茖W(xué)醫(yī)器有限公司）；高壓鍋（Tomy公司）；打孔器、濕盒、平皿、離心機(jī)（上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠）；PCR儀（2700型）為美國 ABI公司產(chǎn)品；Bio-Rad-3000X1型電泳儀為美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品；純水儀為Millipore公司產(chǎn)品；UV-2000紫外分析儀為 Kodak公司產(chǎn)品。

2.3 診斷方法

2.3.1 病料處理

取病死雞的法氏囊，經(jīng)過剪碎研磨，按1∶5的量加入雙抗PBS混勻，分裝于指形管中，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 瓊脂板的制備

用8%氯化鈉、1%瓊脂粉、100ml蒸餾水混合，121℃15min高壓后制成瓊脂溶液，倒入平皿中，厚度為3～4 mm。

2.3.3 打孔和加樣

把事先制好打孔的圖案放在瓊脂板下面，用打孔器在瓊脂平板上打孔，并挑去孔內(nèi)瓊脂，然后封底，孔徑為3 mm，孔與孔之間為4 mm，中央孔加標(biāo)準(zhǔn)抗體，將1號(hào)待檢抗原分別加入到1、2孔中，將2號(hào)待檢抗原分別加入到3、4孔中……將8號(hào)待檢抗原加到15、16孔中，加抗原、抗體時(shí)，以加滿不溢出為度，將加完樣的瓊脂平板加蓋后，在室溫靜置片刻，待抗原稍微擴(kuò)散而液面下陷后，平放于帶蓋的濕盒中，置于37 ℃的溫箱中，于24h觀察并記錄結(jié)果。

2.4 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

2.4.1 引物設(shè)計(jì)

參考OIE上已發(fā)表引物，序列如下：

引物Upper U3、Lower L3為擴(kuò)增IBDV的特異性引物，擴(kuò)增片段為604bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，工作濃度為25umol/L。

注：下游引物也用作反轉(zhuǎn)錄引物

2.4.2 病毒RNA的提取

取病料懸液進(jìn)行差速離心：先用3000r/m離心10min，再6000r/ m離心5min，取上清250μl，加TRIZOL400μl，上下顛倒混勻，置室溫作用5-10min，加400μl氯仿，劇烈震蕩，使充分混勻。12000r/m離心10min，小心吸取上清300μl，加冰預(yù)冷的異丙醇，600μl/管，顛倒混勻，-20℃放置10min，12000r/m離心10min（此時(shí)可見半透明的RNA貼與管底），棄上清，每管加入70%乙醇（用DEPC水配制）1000μl，充分潤洗指形管，12000r/m離心2min，棄上清，置超凈臺(tái)將余下的酒精吹干，加20μl DEPC處理水，70℃水浴溶解10mim[15]。

2.4.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成

（1）變性RNA

加入20%DMSO，混勻，沸水中煮5min，然后迅速置冰盒中，使之冷卻。

（2）反轉(zhuǎn)錄

25μl反轉(zhuǎn)錄體系包括：反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2.5μl，反轉(zhuǎn)錄酶1μl，RNA酶抑制劑0.5μl，模板5μl，反轉(zhuǎn)錄引物0.5μl，dNTP 2μl，添加超純水至總體積25 μl，混勻，置42℃水浴1h[16]。

2.4.4 PCR 擴(kuò)增及電泳

取4μl cDNA為模板，加入合成的特異性引物各0.5μl，其他成分如下：10×buffer5 μl，10mmol/L dNTP1μl，TapDNA聚合酶0.5μl（5U/μl），加超純水至總體積50μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，64℃退火45s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min，4℃保存。取20 μlPCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果

在標(biāo)準(zhǔn)卵黃抗體與1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)被檢樣之間沒有出現(xiàn)沉淀線，呈現(xiàn)陰性反應(yīng)；標(biāo)準(zhǔn)卵黃抗體與3號(hào)、5號(hào)被檢樣之間出現(xiàn)了沉淀線，其中5號(hào)被檢樣沉淀線色較淡，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，確定3號(hào)、5號(hào)病例為IBD。

3.2 RT-PCR結(jié)果

泳道1為1號(hào)樣品RT-PCR產(chǎn)物，泳道2為2號(hào)樣品RT-PCR產(chǎn)物……泳道8為8號(hào)樣品RT-PCR產(chǎn)物，泳道9為200bp DNA Ladder Marker。

結(jié)果第3、5例病例通過RT-PCR擴(kuò)增處出現(xiàn)特異性條帶，其余病例沒有特異性條帶。

3.3 結(jié)論

根據(jù)本次流行的發(fā)病情況，臨床表現(xiàn)，病理剖檢變化和瓊擴(kuò)、RT-PCR實(shí)驗(yàn)診斷，確診病例三和病例五為雞IBD。本次流行和未使用法氏囊疫苗有直接關(guān)系，其次是消毒制度不規(guī)范，疫苗選擇、使用不當(dāng)，免疫程序不合理是造成發(fā)病的另一個(gè)原因。

4 綜合防控措施

根據(jù)傳染病的傳播特點(diǎn)制定綜合防治措施。

4.1 病原和傳播途徑的控制

科學(xué)選址，改進(jìn)布局，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，堅(jiān)持全進(jìn)全出制。新建雞場(chǎng)或有條件擴(kuò)大飼養(yǎng)規(guī)模的雞場(chǎng)，無論是場(chǎng)址的選擇、布局或是日常管理都應(yīng)引起足夠的重視。雞場(chǎng)選址應(yīng)做到地勢(shì)高燥，水源充足，土壤基質(zhì)好，環(huán)境幽靜的地方。選址受到限制的專業(yè)戶，要盡量不與其他畜禽混養(yǎng)，并采取適當(dāng)?shù)母綦x措施。在管理方面按照不同日齡要求調(diào)整雞舍溫度和濕度，及時(shí)通風(fēng)，保證營養(yǎng)要求和充足飲水，每天定時(shí)清糞，無關(guān)人員不得進(jìn)入雞舍等，并做到每周一次定期消毒。把不同日齡的雞分開飼養(yǎng)，嚴(yán)禁放在同一雞舍飼養(yǎng)，最好做到全進(jìn)全出。

4.2 易感雞群的控制

合理的免疫程序和使用安全有效的疫苗，減少易感雞群的數(shù)量。選擇適宜的IBD疫苗，針對(duì)性的制定免疫程序和免疫途徑，是防治IBD疫病的流行的有效措施。

依據(jù)母源抗體水平確定首免日齡，東?？h地區(qū)首免日齡一般是雛雞14日齡時(shí)用中等毒力活疫苗，滴鼻和飲水口服，28日齡再加強(qiáng)一次。

4.3 發(fā)病雞群及時(shí)采取控制措施，病死雞合理處理

對(duì)于發(fā)病雞群，應(yīng)以控制疫情擴(kuò)散為中心，主要采取隔離、消毒和藥物防治等措施。

發(fā)現(xiàn)雞群發(fā)生IBD疑似病例，應(yīng)立即實(shí)施隔離，把疑似病雞排出置于隔離區(qū)，徹底消毒，同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，補(bǔ)充多維素和電解質(zhì)以增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力。

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