高宇 王春梅 黃志亮 郝淑夢(mèng)

1.內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院老年病科，內(nèi)蒙古自治區(qū)牙克石022150；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；3.內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院心胸外科，內(nèi)蒙古自治區(qū)牙克石022150

蒙古族人PCSK9基因E670G多態(tài)性與冠心病相關(guān)性研究

高宇1,2王春梅1黃志亮3郝淑夢(mèng)1

1.內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院老年病科，內(nèi)蒙古自治區(qū)牙克石022150；
2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；
3.內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院心胸外科，內(nèi)蒙古自治區(qū)牙克石022150

目的探討PCSK9基因E670G位點(diǎn)多態(tài)性與我國(guó)蒙古族人群冠心?。–HD）發(fā)病的相關(guān)性。方法收集2010年10月～2012年10月就診于內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院老年病科經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影（CAG）確診的蒙古族CHD患者60例作為蒙古族CHD組，另選擇無(wú)血緣關(guān)系的蒙古族健康體檢者60例（蒙古族健康人群組）、60例漢族CHD患者（漢族CHD組）及60例漢族健康人群（漢族健康人群組）作為研究對(duì)象。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)，對(duì)PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因進(jìn)行分析。結(jié)果蒙古族CHD組及蒙古族健康人群組的PCSK9基因的3個(gè)E670G多態(tài)性位點(diǎn)分型結(jié)果均符合哈迪溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡定律。蒙古族CHD組與蒙古族健康人群組相比突變型雜合子TC、突變型純合子CC基因型分布頻率患CHD的危險(xiǎn)度分析OR值分別是野生型純合子TT基因型分布頻率的2.49、2.95倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；蒙古族CHD組C等位基因分布頻率明顯高于蒙古族健康人群組（58.0%比47.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；漢族CHD組C等位基因分布頻率略高于漢族健康人群組（51.0%比48.0%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論蒙古族CHD發(fā)病率高可能與PCSK9基因的遺傳易感性及E670G多態(tài)性位點(diǎn)有關(guān)，C等位基因突變?cè)黾恿嘶糃HD的風(fēng)險(xiǎn)。

蒙古族；冠心病；前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/西布曲明9a型；多態(tài)性；相關(guān)性

冠狀動(dòng)脈性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）是一種嚴(yán)重影響我國(guó)公眾健康的主要疾病，其中急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是導(dǎo)致CHD患者死亡的常見原因，近年來(lái)其發(fā)病率及病死率呈逐年上升的趨勢(shì)。CHD的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多基因調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的疾病，包括吸煙、脂質(zhì)紊亂、種族、環(huán)境、遺傳等因素，目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)一些遺傳易感基因多態(tài)性與其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)［1-3］。國(guó)內(nèi)外研究表明，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/西布曲明9a型（proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9）、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein cholesterol receptor，LDL-R）及膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）基因多態(tài)性存在人群缺失多態(tài)或突變，與CHD的遺傳易感性相關(guān)，且具有明顯的種族和地域差異［4-5］。目前國(guó)內(nèi)外研究不同種族PCSK9基因多態(tài)性與CHD發(fā)病的研究較多，國(guó)內(nèi)已有研究均集中在漢族CHD遺傳易感性與PCSK9基因多態(tài)性的關(guān)系的研究，而對(duì)蒙古族人群的研究尚未見報(bào)道。本研究采用內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族集中聚居優(yōu)勢(shì)，對(duì)蒙古族群體CHD的遺傳易感性與PCSK9基因多態(tài)性的關(guān)系進(jìn)行探討，并與其在漢族人群中的分布進(jìn)行比較，以期為CHD的發(fā)病機(jī)制及診療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2010年10月～2012年10月在內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院老年病科住院經(jīng)確診的蒙古族CHD患者60例（蒙古族CHD組）及同族無(wú)血緣關(guān)系健康人群60例（蒙古族健康人群組），60例漢族CHD患者（漢族CHD組）及同族健康人群60例（漢族健康人群組）。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡大于18歲而小于75歲；②病程大于6個(gè)月；③冠狀動(dòng)脈造影（CAG）提示主支或主要分支局限性或節(jié)段性狹窄大于75%；④心電圖提示大于2個(gè)導(dǎo)聯(lián)的ST段的壓低或改變；⑤臨床癥狀典型。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝腎功能異常；②近期有感染性疾病或甲功異常；③有自身免疫系統(tǒng)疾??；④CAG提示主支或主要分支局限性或節(jié)段性狹窄小于30%；⑤臨床無(wú)癥狀或心電圖提示無(wú)異常改變。所有人員均采用EDTA真空抗凝采血針管抽取晨起空腹外周靜脈血2 mL各做聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP）使用，采血后立即顛倒混勻并轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱中保存。蒙古族及漢族CHD患者120例，其中男76例，女44例，平均年齡（61.6±9.8）歲；蒙古族及漢族健康人群120例，其中男81例，女39例，平均年齡（59.4±7.8）歲；兩組性別構(gòu)成比、年齡、吸煙史等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。以上研究對(duì)象為排除PCR擴(kuò)增失敗的樣本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑及儀器DNA快速提取試劑盒、Biometra擴(kuò)增儀、TANEN凝膠成像分析儀等均購(gòu)于上海生物工程有限公司。

1.2.2 外周血DNA的制備取高溫消毒過(guò)的2 mL EP管，取2 mL全靜脈血，加入4 mL細(xì)胞裂解液，顛倒搖勻，10 000 r/min離心3 min，吸出上清液，保留細(xì)胞核沉淀，加入20 μL蛋白酶K溶液，混勻，再加入200 μL GB緩沖液，混勻，56℃水浴10 min，靜置10 min，再加入200 μL無(wú)水乙醇，混勻，10 000 r/min離心3 min，吸出上清液，將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，再次12 000 r/min離心3 min，以增加基因組DNA的獲得率。所提取DNA濃度值至0.05 μg/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)①引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0及Oligo 6等生物軟件；②設(shè)計(jì)引物序列：上游：5＇-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3＇，下游：5＇-TAGGAG TCTTGTCTCATGCCT-3＇，共計(jì)160 bp，各0.4 μmol/L。

1.2.4 PCR擴(kuò)增與基因分型采用PCR-RFLP技術(shù)研究PCSK9基因E670G位點(diǎn)多態(tài)性。擴(kuò)增反應(yīng)流程：94℃預(yù)變性10 min，然后95℃變性40 s；62℃退火40 s；72℃延伸40 s，共36個(gè)循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸50 s。PCSK9基因E670G的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化酶切，酶切反應(yīng)體系總量10 μL，加入10 U E670G限制性內(nèi)切酶，PCR產(chǎn)物經(jīng)滅菌蒸餾水7 μL，37℃水浴過(guò)夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳60 min，電壓100 V，使用凝膠成像分析儀分析結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后產(chǎn)生3種基因型：純合子型TT（野生型）、純合子型等位基因CC（突變型）、雜合子基因型TC（雜合型）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，通過(guò)直接計(jì)數(shù)法對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及頻率進(jìn)行計(jì)算，應(yīng)用LDA及Chromas軟件對(duì)PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)分型結(jié)果進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡定律測(cè)定及測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，等位基因和基因型頻率分布采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用OR和95%CI確定PCSK9基因E670G多態(tài)性基因型及等位基因頻率與CHD發(fā)病的相對(duì)危險(xiǎn)度。

2 結(jié)果

2.1 PCSK9基因E670G多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果及測(cè)序分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳凝膠成像系統(tǒng)攝影記錄及測(cè)序分析結(jié)果如圖1、2所示：純合子型TT（野生型），可見430 bp 1個(gè)片段；純合子型等位基因CC（突變型），可見260 bp及180 bp 2個(gè)片段；雜合子基因型TC（雜合型），可見3個(gè)片段，分別為430、260 bp及180 bp。

2.2 兩組患者PCSK9基因多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)

應(yīng)用LDA軟件對(duì)四組測(cè)試對(duì)象進(jìn)行PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)，結(jié)果如表1、2所示，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，均P＞0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究對(duì)象來(lái)自同一群體，具有較好的代表性。

2.3 四組患者PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率檢驗(yàn)結(jié)果比較

蒙古族CHD組與蒙古族健康人群組PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)TT、CC、TC基因型及T、C等位基因的分布頻率分別是25.0%、38.0%、40.0%、32.0%、35.0%和30.0%、43.0%、53.0%、58.0%、47.0%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)后，蒙古族CHD組和蒙古族健康人群組基因型及等位基因的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.819，P=0.002；χ2=5.642，P=0.018）。見表3。

漢族CHD組與漢族健康人群組PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)TT、CC、TC基因型及T、C等位基因的分布頻率分別是32.0%、30.0%、30.0%、30.0%、35.0%和37.0%、49.0%、60%、52.0%、48.0%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)后，漢族CHD組與漢族健康人群組基因型及等位基因的分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.527，P= 0.468；χ2=0.254，P=0.614）。見表3。

OR相關(guān)性分析結(jié)果顯示：蒙古族CHD組與蒙古族健康人群組PCSK9基因E670G多態(tài)位點(diǎn)突變基因型CC患CHD的危險(xiǎn)度是野生型TT的2.95倍，而突變等位基因C可比其他等位基因增加1.78倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而漢族CHD組與漢族健康人群組間各基因型及等位基因分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

所以，蒙古族CHD發(fā)病率可能與PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)基因型有關(guān)，基因突變?cè)黾恿嘶糃HD的風(fēng)險(xiǎn)，而漢族CHD發(fā)病率與PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率可能無(wú)關(guān)。

3 討論

CHD因冠脈粥樣硬化等多種原因?qū)е卵芄芮华M窄性疾病，是威脅中老年患者健康的主要危險(xiǎn)性疾病因素之一。然而，CHD是多因素、多步驟、多基因調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的疾病，特別是單個(gè)或多個(gè)基因的遺傳易感性作用對(duì)CHD發(fā)病有直接關(guān)系［6-7］。美國(guó)一項(xiàng)CHD臨床研究發(fā)現(xiàn)，不同的種族及同種族不同的環(huán)境地域?qū)HD的易感性也有明顯的不同［8］。早在20世紀(jì)90年代，美國(guó)醫(yī)學(xué)界就PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)是否為CHD的遺傳易感性以及與性別的差異進(jìn)行過(guò)激烈爭(zhēng)論，其中以Saade等［9］為主的大型研究機(jī)構(gòu)認(rèn)為PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)與CHD的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而以Werner等［10］和Jelassi等［11］學(xué)者的兩項(xiàng)研究顯示無(wú)關(guān)聯(lián)。國(guó)內(nèi)近些年對(duì)PCSK9基因也有相關(guān)報(bào)道，但研究結(jié)果也不盡相同，具有代表性的最新報(bào)道有廣東省的'艷輝等［12］對(duì)該地區(qū)漢族人群進(jìn)行了病例對(duì)照研究，還有研究者對(duì)四川地區(qū)CHD與PCSK9基因E670G多態(tài)性進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道［13］，我國(guó)臺(tái)灣人Hsu等［14］認(rèn)為PCSK9基因影響血脂代謝，但并不是CHD的生物標(biāo)志物。

內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市地處祖國(guó)最北端，天氣環(huán)境條件較為惡劣，除漢族外，蒙古族是人口聚居最多的一個(gè)少數(shù)民族。本研究結(jié)果顯示PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)有3種基因型：純合子型TT（野生型）、純合子型等位基因CC（突變型）、雜合子基因型TC（雜合型）。PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布在蒙古族CHD組與蒙古族健康人群組之間有顯著性差異，突變基因型CC患CHD的危險(xiǎn)度是野生型TT的2.95倍，而突變等位基因C可增加1.78倍；表明蒙古族群體PCSK9基因E670G多態(tài)性對(duì)CHD具有遺傳易感性可能，突變基因型和等位基因頻率分布可能增加了CHD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。而漢族CHD組與漢族健康人群組研究結(jié)果顯示，PCSK9基因E670G多態(tài)性與其發(fā)病率無(wú)相關(guān)性，這與國(guó)內(nèi)部分研究結(jié)果相悖，造成結(jié)果不同的原因可能是該地區(qū)漢族人口較少，環(huán)境因素及地區(qū)差異也可能是導(dǎo)致該結(jié)果的原因。

近些年國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9基因E670G多態(tài)性位點(diǎn)位于富含半胱氨酸的C末端，參與對(duì)自身催化的調(diào)節(jié)，若去除該結(jié)構(gòu)域?qū)?dǎo)致PCSK9的聚集，PCSK9在調(diào)節(jié)血漿LDL-C水平中具體發(fā)揮怎樣的作用仍不明了［15-16］。其機(jī)制可能是通過(guò)轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)肝臟的LDL-R水平，PCSK9基因過(guò)度表達(dá)引起肝臟LDL-R的下降，還影響LDL-R介導(dǎo)的LDL-C的攝取，從而影響膽固醇、血漿總膽固醇的水平，導(dǎo)致血漿LDL-C水平升高，所以，PCSK9基因E670G多態(tài)性與載脂蛋白、血漿總膽固醇水平等之間存在相關(guān)，可作為血漿LDL-C水平及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，引發(fā)CHD發(fā)生，并具有劑量效應(yīng)［17-18］。目前國(guó)內(nèi)外已開始進(jìn)行Ⅰ期和Ⅱ期藥物實(shí)驗(yàn)，例如，賽諾菲公司研發(fā)的SAR236553和羅氏公司研發(fā)的RG7652等，可以說(shuō)為未來(lái)降脂藥物的選擇提供了新的空間［19-20］。

本實(shí)驗(yàn)采用PCR-RFLP方法及病例-對(duì)照研究分析PCSK9基因的E670G多態(tài)性在不同民族CHD患者分布特點(diǎn)，為CHD的預(yù)防和個(gè)性化治療、遺傳發(fā)病機(jī)制、危險(xiǎn)性分層評(píng)估等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果顯示，PCSK9基因的E670G多態(tài)性可能是蒙古族人群CHD發(fā)病的遺傳危險(xiǎn)因素之一，突變基因型CC與突變等位基因C可能增CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。CHD患者中突變等位基因C攜帶者可能與急性冠脈綜合征相關(guān)。由于存在地區(qū)、環(huán)境、生活習(xí)慣、種族等局限，此結(jié)論尚需在后續(xù)研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本、并采用多種其他分析方法多中心、長(zhǎng)期的前瞻性的病例對(duì)照研究加以驗(yàn)證，才能真正確定PCSK9基因E670G多態(tài)性是否與CHD發(fā)生存在內(nèi)在的聯(lián)系。

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Relationship between E670G polymorphism of PCSK9 gene and susceptibility to coronary heart disease in the Mongolian nationality

GAO Yu1,2WANG Chunmei1HUANG Zhiliang3HAO Shumeng1
1.Department of Geriatrics,Inner Mongolia Forestry General Hospital,Inner Mongolia Autonomous Region,Yakeshi 022150,China;2.Clinical Medicine College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Heilongjiang Province, Harbin150040,China;3.Department of Cardio-Thoracic Surgery,Inner Mongolia Forestry General Hospital,Inner Mongolia Autonomous Region,Yakeshi022150,China

ObjectiveTo explore the relationship between E670G polymorphism of PCSK9 gene and susceptibility to coronary heart disease(CHD)in the Mongolian people.Methods60 healthy Mongolian people(healthy Mongolian people group),60 Han people with CHD(CHD Mongolian people group);60 healthy Han people(healthy Han people group),and 60 Han people with CHD(CHD Han people group)from October 2010 to October 2012 in Inner Mongolia Forestry General Hospital were collected as study objects.The gene polymorphism of E670G in PCSK9 gene of four groups were detected by PCR-RFLP.Three SNPs in E670G polymorphism of PCSK9 gene(TT,TC,CC)were genotyped by the PCR-RFLP,and the differences of allele frequency and genotype between four groups were analyzed.ResultsNo significant deviations from the Hardy-Weinberg equilibrium were observed in these three SNPs genotypes in E670G polymorphism of PCSK9 gene(TT,TC,CC)in CHD and healthy peoples(P＜0.05).The distribution frequency of PCSK9-E670G genotypes was significant differences of frequencies were found in genotypes TT,TC and CC between CHD Mongolian people group and healthy Mongolian people group(P＜0.05).The risks of TC and CC for CHD were 2.49 and 2.95 folds respectively to TT genotype,the difference was statistically significant(P＜0.05).The distribution frequency of allele C in the CHD Mongolian people group(58.0%)was statistically higherthan that of the healthy Mongolian people group(47.0%),the difference was statistically significant(P＜0.05);the distribution frequency of allele C in CHD Han people group was higher than the healthy Han people group(51.0%vs48.0%),but there was no statistically significant difference between two groups(P＞0.05).ConclusionGene polymorphism of PCSK9 genotypes may be associated with the risk of Coronary heart disease in the Mongolian nationality but not in Han nationality.The mutation of PCSK9 gene may increase the incidence of CHD in the Mongolian nationality.

The Mongolian nationality;CHD;PCSK9;Polymorphism;Correlation

R541.4［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0018-05

2014-12-12本文編輯：任念）

內(nèi)蒙古民族大學(xué)科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)NMD1349）。

高宇（1980-），女，內(nèi)蒙古牙克石人，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2013級(jí)在讀碩士研究生；研究方向：心血管病基礎(chǔ)與臨床研究。

［作者簡(jiǎn)介］王春梅（1956-），女，內(nèi)蒙古牙克石人，碩士生導(dǎo)師；研究方向：心血管病的基因診斷與治療。