傅超,李晨

(1.青島市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 青島 266071；2.青島阜外心血管病醫(yī)院，山東 青島 266034)

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應(yīng)用2215細(xì)胞研究中藥抗乙肝病毒的進(jìn)展

傅超1,李晨2

(1.青島市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 青島 266071；2.青島阜外心血管病醫(yī)院，山東 青島 266034)

目的 應(yīng)用2215細(xì)胞作為藥物體外篩選模型目前已發(fā)展到比較成熟的階段，按照現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)對(duì)不同藥物處理方法分類(lèi)，本文歸納總結(jié)中草藥、中藥提取物、中成藥以及含藥血清等應(yīng)用2215細(xì)胞進(jìn)行抗乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)的實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀，為中藥抗乙肝病毒的研究和開(kāi)發(fā)提供了參考。

2215細(xì)胞；中藥；抗乙肝病毒；研究進(jìn)展

乙型肝炎是一種嚴(yán)重影響我國(guó)以及世界人類(lèi)健康和生活質(zhì)量的疾病。目前，西藥治療乙肝存在大量問(wèn)題，諸如缺乏特效藥，不良反應(yīng)多，藥物依賴(lài)性強(qiáng)和價(jià)格昂貴等。HBV感染與肝硬化、肝癌的發(fā)生有著密切因果關(guān)系[1]，從現(xiàn)有療效確切的我國(guó)傳統(tǒng)中藥中尋找抗乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)的活性物質(zhì)具有重要的學(xué)術(shù)和應(yīng)用價(jià)值。

體外細(xì)胞培養(yǎng)是篩選抗HBV藥物的有用工具。2215細(xì)胞模型是Sells 等[2]在1987年將克隆的2個(gè)頭尾相連的HBV DNA全基因及抗G418質(zhì)粒直接導(dǎo)入受體細(xì)胞——人肝癌細(xì)胞株 (liver hepatocellular cells，HepG2)細(xì)胞構(gòu)建而成。目前，該細(xì)胞模型已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)且廣泛用于抗HBV 藥物篩選和評(píng)價(jià)等研究，現(xiàn)已成為申報(bào)抗HBV 新藥必須進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚3]。

現(xiàn)就中草藥的不同處理方法對(duì)2215細(xì)胞分泌乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)影響的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展作以下綜述。

1 中草藥及提取物

在對(duì)中草藥的篩選中，葉下珠顯示出較好的抗HBV作用。國(guó)內(nèi)外均有不同品種葉下珠抗病毒作用比較的報(bào)道[4-5]。臺(tái)灣細(xì)葉油柑(PhyllanthussimplexRetz.)為葉下珠屬植物，黃正昌等[6]應(yīng)用2215細(xì)胞株及雛鴨乙型肝炎模型，對(duì)臺(tái)灣細(xì)葉油柑水提取物和醇提取物進(jìn)行了體內(nèi)外抗乙肝活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，臺(tái)灣細(xì)葉油柑水提取物和醇提取物對(duì)HBsAg分泌均有一定抑制作用，但其醇提物對(duì)HBeAg的分泌無(wú)抑制作用。在體內(nèi)抗鴨乙肝病毒實(shí)驗(yàn)中，臺(tái)灣細(xì)葉油柑水提物10 g/(kg·d)和5 g/(kg·d)劑量組于給藥5 d、給藥10 d和停藥3 d時(shí)有顯著體內(nèi)抑制鴨乙型肝炎病毒核酸(duck hepatitis B virus DNA，DHBV-DNA)作用，而其醇提物則無(wú)抑制DHBV-DNA作用。提示臺(tái)灣細(xì)葉油柑水提取物有抗乙肝病毒作用。

大蒜多糖(garlic polysaccharide，GP)是從大蒜球根中提取的活性成分，具有抗氧化、抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)等作用[7]，鄭敏等[8]在2215細(xì)胞接種24h后加入大蒜多糖A、B、C，以ELISA法檢測(cè)HBeAg與HBsAg，并用MTT染色法觀(guān)察藥物的細(xì)胞毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜多糖A、B、C對(duì)2215細(xì)胞半數(shù)毒性濃度分別為110.53、108.65及16.00 mg/mL；可劑量依賴(lài)性抑制HBsAg的分泌，其半數(shù)抑制濃度(half inhibition concentration，IC50)分別為9.31、21.30和1.31 mg/mL，治療指數(shù)分別為11.87、5.10和12.21，對(duì)HBeAg的分泌則均無(wú)明顯抑制作用，即得出大蒜多糖A、B、C在培養(yǎng)2215細(xì)胞中可抑制HBsAg的分泌的結(jié)論。

芒果苷系芒果葉的主要有效成分。據(jù)報(bào)道芒果苷具有保肝利膽、平喘鎮(zhèn)咳、抗病毒等作用。運(yùn)晨霞等[9]以Western blot檢測(cè)芒果苷對(duì)2215細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中、 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terrninal Kinase,JNK/ c-Jun)、p38蛋白含量及磷酸化水平的作用，以報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)芒果苷對(duì)2215細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(activator protein-1，AP-1)活性影響，結(jié)果顯示，芒果苷對(duì)2215細(xì)胞MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、JNK、p38蛋白含量及磷酸化水平無(wú)明顯作用，但可以抑制JNK蛋白和其下游AP-1轉(zhuǎn)錄因子的活性，認(rèn)為芒果苷通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制HBV在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。

葡萄科蛇葡萄屬藥用植物大葉蛇葡萄(AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg.)具有保肝等作用[10]，陳梅玲等[11]將大葉蛇葡萄乙醇提取物作用于乙肝病毒DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系2215細(xì)胞，以細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)觀(guān)察藥物對(duì)2215細(xì)胞的毒性，用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定藥物對(duì)培養(yǎng)8天的2215細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg表達(dá)抑制作用。結(jié)果大葉蛇葡萄提取物半數(shù)中毒濃度(median toxic concentration，TC50)為250 μg/mL，最大無(wú)毒濃度(maximal atoxic concentration，TC0)為125 μg/mL；其對(duì)細(xì)胞HBsAg和HBeAg抑制的IC50為43.1 μg/mL、54.8 μg/mL，治療指數(shù)(therapeutic index，TI)為5.8、4.7，表明大葉蛇葡萄乙醇提取物具有一定的體外抗乙肝病毒作用。

藤茶系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄[Ampelopsisgrossedentata(Hand—Mazz)w．Y．Wang]的嫩莖葉，其主要成分是黃酮類(lèi)化合物，含量約為45.52%。研究表明，藤茶總黃酮對(duì)2215細(xì)胞HBsAg、HBeAg的分泌有明顯抑制作用[12]。雙氫楊梅樹(shù)皮素 (dihydromyricetin ampelosis，DHM)為藤茶總黃酮中含量最多的一種單體成分，鄭作文等[13]接種2215細(xì)胞24h后，加入DHM培養(yǎng)，觀(guān)察 DHM對(duì)細(xì)胞的毒性，在無(wú)毒質(zhì)量濃度下，將藥物加入2215細(xì)胞培養(yǎng)，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中 HBsAg和 HBeAg水平。結(jié)果在最大無(wú)毒質(zhì)量濃度下，DHM對(duì)2215細(xì)胞分泌 HBsAg及 HBeAg具有明顯的抑制作用。對(duì)于 HBsAg，DHM IC50為 l7.7 μg/mL， TI為15.4；對(duì)于HBeAg，IC50為21.8 μg/mL，TI為12.5。DHM 對(duì)2215細(xì)胞分泌 HBsAg及 HBeAg有明顯的抑制作用。

升麻具有清熱解毒、升舉陽(yáng)氣功能，主治頭痛、牙痛、口瘡、咽喉腫痛等證，體內(nèi)外藥理試驗(yàn)表明升麻中酚酸性成分具有明顯抗病毒作用，劉方舟等[14]采用2215細(xì)胞模型進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA含量進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)升麻中提取物SMT 75%乙醇提取物、SMT總皂苷、SMT總有機(jī)酸體外抗乙肝病毒作用，結(jié)果顯示升麻提取物對(duì)2215細(xì)胞HBeAg、HBV-DNA分泌有一定抑制作用，其中升麻總皂苷的0.018，0.036 g劑量組，升麻總有機(jī)酸的0.02 g劑量組對(duì)HBeAg、HBV-DNA分泌與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

白背葉為大戟科植物Mallotusapelta(Lour.)Muel-Arg，臨床常用于治療肝炎。夏星等[15]以不同濃度的白背葉提取物培養(yǎng)接種24 h的2215細(xì)胞8 d，評(píng)價(jià)細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的細(xì)胞毒性，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)最大無(wú)毒濃度下的培養(yǎng)液中HBsAg和HBeAg水平，結(jié)果白背葉提取物對(duì)2215細(xì)胞HBeAg、HBsAg分泌有顯著抑制作用，其中抑制HBsAg的IC50為8.61 μg/mL，抑制HBeAg的IC50為20.87 μg/mL。

爵床科植物六月青Goldfussiapsilostachys(C.B.Clarke ex W.W.Smith)Brem總皂苷成分可以抑制鴨乙肝病毒[16-17]。林興等[18]以六月青總皂苷培養(yǎng)接種過(guò)的2215細(xì)胞，拉米夫定作為陽(yáng)性對(duì)照，MTT法檢測(cè)藥物抗HBV作用，結(jié)果其對(duì)培養(yǎng)液中HBeAg分泌及HBV-DNA的復(fù)制具有明顯抑制作用，呈顯著的濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；對(duì)HBsAg的IC50為9.45 mg/L，TI為36.98，抗HBV作用顯著。

2 中藥復(fù)方

復(fù)方黃根片、復(fù)方三姐妹片等8個(gè)中藥復(fù)方，是具有廣西特色的抗慢性乙型病毒性肝炎的復(fù)方。鄧家剛等[19]通過(guò)觀(guān)察這8個(gè)中藥復(fù)方對(duì)2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用，篩選出體外可能抗乙肝病毒的復(fù)方。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT法對(duì)8個(gè)中藥復(fù)方進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，在無(wú)毒濃度下分別檢測(cè)8個(gè)中藥復(fù)方對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用。復(fù)方黃根片最TC0為1375 μg/mL，對(duì)細(xì)胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分別為29.85%，89.99%；復(fù)方三姐妹片的TC0為1250 μg/mL，對(duì)細(xì)胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分別為1.69%，80.78%；復(fù)肝湯的TC0為730.05 μg/mL，對(duì)細(xì)胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分別為33.09%，40.98%；護(hù)肝解毒丸的TC0為2700 μg/mL，對(duì)細(xì)胞分泌的HBsAg沒(méi)有作用，對(duì)HBeAg抑制率為64.16%；達(dá)肝清顆粒的TC0為626.2 μg/mL，對(duì)細(xì)胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分別為3.70%，43.83%；柴胡四草湯的TC0為278.91 μg/mL；壯肝散的TC0為3281.25 μg/mL；健脾利濕方的TC0為976.56 μg/mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃根片、復(fù)方三姐妹片、護(hù)肝解毒丸、復(fù)肝湯對(duì)HBeAg有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)HBsAg的抑制作用比較弱；達(dá)肝清顆粒對(duì)HBeAg有一定的抑制作用，對(duì)HBsAg的抑制作用比較弱；柴胡四草湯、壯肝散、健脾利濕方對(duì)HBeAg，HBsAg幾乎沒(méi)有抑制作用。

海珠益肝膠囊的組方主要由葉下珠、海藻等中藥組成，具有清熱解毒、化痰消瘀之功效，經(jīng)臨床應(yīng)用有良好的療效[20]。宴雪生等[21]通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以確定對(duì)2215細(xì)胞無(wú)毒性作用的最高藥物濃度，直接加藥物到細(xì)胞培養(yǎng)液中，用固相放射免疫方法測(cè)定其HBsAg、HBeAg含量。結(jié)果表明海珠益肝膠囊TC0<1.25 mg/mL，海珠益肝膠囊有明顯抑制HBsAg、HBeAg的作用，各濃度間存在量效關(guān)系，其中對(duì)HBeAg的作用優(yōu)于對(duì)HBsAg的作用。得知海珠乙肝膠囊對(duì)2215細(xì)胞HBV標(biāo)志物有顯著的抑制作用。

復(fù)方肝舒康由馬鞭草、移星草、巴戟天、人參等十二味中藥組成，臨床治療病毒性肝炎有顯著療效。李虹霖等[22]以復(fù)方肝舒康各提取部位作用于HBV轉(zhuǎn)染的2215細(xì)胞，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)其對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制作用，結(jié)果復(fù)方肝舒康乙酸乙酯提取物對(duì)HBsAg半數(shù)有效濃度IC50為14.0 μg/mL，治療指數(shù)26.7；對(duì)HBeAg的IC50為19.7 μg/mL，治療指數(shù)19.04。說(shuō)明復(fù)方肝舒康抗HBV作用明顯，其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是乙酸乙酯部位。

蛇黃肝炎合劑由白花蛇舌草、田基黃、蒲公英、黃芪等九味藥物組成，具有清熱解毒、益氣護(hù)肝等功效，孔祥廉等[23]以HBV轉(zhuǎn)染的人2215細(xì)胞株為靶細(xì)胞，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察其對(duì)HBV分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用，結(jié)果蛇黃肝炎合劑在1:16倍稀釋時(shí)對(duì)細(xì)胞的破壞率為63.49%，無(wú)毒濃度1:32倍稀釋下能抑制HBsAg達(dá)64.83%，抑制細(xì)胞分泌HBeAg達(dá)86.1%，提示本藥物為2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg抑制作用顯著。

壯藥汗衣臺(tái)為防己科植物皺波青牛膽的(Tinosporacrispa(L.)Miers)的藤莖。該屬植物在印度、泰國(guó)等東南亞國(guó)家被廣泛藥用，具有通經(jīng)活血、清熱排毒等作用[24]。廖丹等[25]以不同濃度汗衣臺(tái)及其配伍藥孵育2215細(xì)胞，ELISA法測(cè)定分泌HBsAg和HBeAg含量，熒光定量檢測(cè)HBV-DNA，結(jié)果復(fù)方(P<0.01)與汗衣臺(tái)單用(P<0.05)均有抑制HBeAg以及HBV-DNA分泌的作用。

3 含藥血清

中藥血清藥理學(xué)方法是近年來(lái)興起的一種適合中藥特點(diǎn)的更科學(xué)的中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。它可防止中藥制劑本身的理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，還能模擬反映中藥在胃腸道消化吸收、再經(jīng)生物轉(zhuǎn)化、最后產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過(guò)程，并代表了藥物在體內(nèi)產(chǎn)生作用的真正有效成分，尤其是適用于中藥及中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜的特點(diǎn)，由于體外試驗(yàn)存在著一定的局限性，體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)M難度大，近年來(lái)已有越來(lái)越多學(xué)者趨向于利用血清藥理學(xué)對(duì)中藥抗HBV的作用進(jìn)行研究。

李剛等[26]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)藤茶總黃酮含藥血清對(duì)2215細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg的抑制作用。藤茶總黃酮含藥血清能顯著抑制2215細(xì)胞HBsAg、HBeAg的分泌，20%、10%藤茶總黃酮含藥血清對(duì)2215細(xì)胞HBsAg和HBeAg的分泌有非常顯著的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

壯藥依肝達(dá)是通過(guò)長(zhǎng)期的民間臨床觀(guān)察而擬定的治療急慢性乙型肝炎和肝硬化的驗(yàn)方， 主要由壯族民間草藥飯湯子、田基黃、三姐妹等組成，，具有清熱解毒、利濕退黃和促進(jìn)肝功能恢復(fù)之功效，臨床療效顯著。梁寧等[27]采用ELISA法檢測(cè)依肝達(dá)含藥血清對(duì)2215細(xì)胞分泌的 HBsAg和HBeAg的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，依肝達(dá)含藥血清 (20%、10%)明顯降低2215細(xì)胞分泌的 HBsAg、HBeAg抗原水平(P< 0.01)，與陽(yáng)性組無(wú)明顯差別。

苦玄參為玄參科植物苦玄參(PicriafeltarraeLour)的干燥全草，曾金強(qiáng)等[28]以苦玄參不同提取部位含藥血清作用于2215細(xì)胞，用酶聯(lián)免疫法測(cè)定HBsAg和HBeAg水平，發(fā)現(xiàn)各提取部位對(duì)HBsAg均有抑制作用；乙醇提取部位、水提取部位等極性較大成分對(duì)HBeAg的抑制作用明顯，抑制率最高達(dá)80%。

4 討論

目前對(duì)于乙肝病的治療，研究方法主要集中在抗病毒上。HBV是一種較為嚴(yán)格的嗜肝DNA病毒，由于病毒黏附以及DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制對(duì)宿主有嚴(yán)格的要求，HBV只感染人類(lèi)和類(lèi)人猿。對(duì)HBV的研究由于缺乏合適的可利用的動(dòng)物模型而受到一定限制[29]?，F(xiàn)階段中藥抗HBV效果大多利用HepG2215細(xì)胞株和以嗜肝DNA病毒感染動(dòng)物這2種模型來(lái)評(píng)價(jià)[30]，應(yīng)用2215細(xì)胞作為藥物體外篩選模型，與以往的體內(nèi)試驗(yàn)相比，該方法簡(jiǎn)便可行，可以為抗HBV藥物的篩選從另一個(gè)角度提供一定的信息。但體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不能完全反映體內(nèi)所特有的免疫調(diào)節(jié)和體內(nèi)代謝對(duì)藥物效果的影響，進(jìn)一步證實(shí)藥物抗病毒作用還須結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。筆者認(rèn)為，抗乙肝病毒的體外研究應(yīng)通過(guò)中藥化學(xué)、分析化學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞藥理學(xué)及分子生物學(xué)等多學(xué)科理論和技術(shù)加以研究，并緊密結(jié)合中醫(yī)藥的基礎(chǔ)理論，以使其更系統(tǒng)化。

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(編校：王冬梅)

Research progress of 2215 cell in hepatitis B virus resistance tests for traditional Chinese medicine

FU Chao1,LI Chen2

(1.Qingdao Center for Food and Drug Control, Qingdao 266071, China; 2.Qingdao FuWai Hospital of Cardiovascular Disease, Qingdao 266034, China)

Using 2215 cells for drug screening in vitro model at present has developed to the mature stage.According to the different ways to deal with existing experiment of drug classification.In this paper, the research status of 2215 cells in hepatitis B virus (HBV) resistance experiment for Chinese herbal medicine, Chinese medicine extract, proprietary Chinese medicine and the drug-containing serum were summarized to provide the reference for research and development of traditional Chinese medicine for anti HBV .

2215 cells; traditional Chinese medicine (TCM); anti-HBV; research progress

傅超，男，碩士，主管藥師，研究方向；藥品檢驗(yàn)，E-mail：alexandar_2026@sina.com。

R965.1

A

1005-1678(2015)02-0180-04