張松 余坤飛 熊武 袁佛良 吳淑獻 潘松 周軍

DACT1基因甲基化在鼻咽癌細胞侵襲中的作用

張松 余坤飛 熊武 袁佛良 吳淑獻 潘松 周軍

目的探討DACT 1基因甲基化狀態(tài)在鼻咽癌細胞侵襲中的作用。方法采用甲基化特異性PCR及RT-PCR檢測CNE2細胞在S-腺苷-L-甲硫氨酸處理前后DACT1基因的甲基化狀態(tài)及其表達情況,用transwell小室法觀察S-腺苷-L-甲硫氨酸對CNE2細胞侵襲的影響。結(jié)果未經(jīng)S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE2細胞中DACT1基因非甲基化,DACT1高表達,S-腺苷-L-甲硫氨酸處理后DACT 1基因高甲基化,DACT 1不表達,且CNE 2細胞侵襲受抑制。結(jié)論DACT 1基因甲基化狀態(tài)與其表達有關(guān),可能在鼻咽癌細胞侵襲中起重要作用。

DACT1基因；鼻咽癌；CNE2細胞系；侵襲

最近研究發(fā)現(xiàn),DACT 1(Dapper1/Dpr1)基因是一個腫瘤相關(guān)基因,其在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用。有研究提示,在非小細胞肺癌中DACT 1的表達與腫瘤病理分級、大小、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。鼻咽癌中DACT 1的表達情況及其與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系還未見報道。本研究將通過改變DACT 1甲基化狀態(tài)改變其表達情況,觀察DACT 1基因在鼻咽癌細胞侵襲中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) CNE2細胞購于中國生命科學(xué)院上海細胞所,在5％二氧化碳、37℃的條件下,用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。在細胞處于對數(shù)生長期時用胰蛋白酶消化后分離CNE 2細胞,然后以等量接種在六孔板上,第2天,將六孔板中的6孔隨機分為兩組,一組用S-腺苷-L-甲硫氨酸處置,另一組不加任何藥物,藥物作用1 d后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),2 d后收獲細胞用于后續(xù)實驗。

1.2 甲基化特異性PCR 上述細胞收獲后用DNA提取試劑盒提取各組細胞的DNA,然后用DNA甲基化試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾,根據(jù)GeneBank中DACT 1基因序列用甲基化引物設(shè)計軟件分別設(shè)計甲基化和非甲基化引物序列。甲基化引物序列(M)：5-CGGGATAGTAGTAGTCGGC-3(S),5-CGCTAAAACTACGACCGCG-3(R),非甲基化引物(U)：5-GTT GGGATAGTAGTAGTTGGT-3(S),5-AAACACTAAAACTACA ACCACA-3。分別用兩種引物對上述亞硫酸鹽修飾的各組細胞的DNA進行擴增,退火溫度分別是60℃(甲基化)和58℃(非甲基化)。分別取PCR產(chǎn)物10 μl用2％瓊脂糖凝膠電泳,觀察DACT 1基因甲基化情況。

1.3 RT-PCR 采用TRIzol 試劑提取上述細胞的總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄形成DNA第一鏈(cDNA)。根據(jù)GeneBank中基因序列分別設(shè)計DACT 1和β-actin兩對引物,分別以cDNA為模板行PCR。DACT 1引物：5-GGAAGAGGACAG GCTTGGAAAC-3(S),5-GTCCCATTGTTCAGAGAAGGTATC-3(R)；β-actin引物：5-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3,5-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3,退火溫度均是60℃。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳,觀察DACT 1表達情況。

1.4 細胞侵襲實驗(transwell小室法) 將對照和加藥處理24 h的細胞消化制成105個/ml懸液,取1 ml 細胞懸液于1500 rpm離心5 min,棄上清。加入200 μl 無血清培養(yǎng)基,吹打均勻后放入transwell小室中。 Transwell板中加入500 μl含10％ FBS 1640的完全培養(yǎng)基,將小室放入板中。37℃下于5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將小室取出,用PBS洗去培養(yǎng)基,結(jié)晶紫染色10 min,自來水將表面的結(jié)晶紫洗除干凈,用棉簽將上室中的細胞擦除干凈,于倒置顯微鏡下觀察,每組細胞隨機取10個視野記錄細胞數(shù),分析觀察兩組細胞侵襲能力。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗；計數(shù)資料以率(％)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

甲基化特異性PCR結(jié)果顯示,未經(jīng)S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1基因是非甲基化的,而經(jīng)過S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1基因是甲基化的,這說明S-腺苷-L-甲硫氨酸能使非甲基化的DACT 1基因重新甲基化。

RT-PCR結(jié)果提示,在未經(jīng)S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1高表達,而在經(jīng)過S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1不表達,這說明S-腺苷-L-甲硫氨酸通過改變DACT 1基因的甲基化狀態(tài)而改變了其表達。

transwell小室實驗結(jié)果顯示,未經(jīng)S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞侵襲數(shù)(χ2=13.50±2.15)明顯多于經(jīng)過S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞侵襲數(shù)(χ2=8.50±1.08,t=5.868,P＜0.001)。這說明DACT 1的表達情況影響CNE 2細胞的侵襲能力。

3 討論

DACT 1基因定位于14q22.3,其編碼836個氨基酸的蛋白質(zhì),氨基端有1個亮氨酸連接區(qū)域,羧基端有1個PDZ連接位點。最近研究發(fā)現(xiàn),其是1個腫瘤相關(guān)基因,其可能通過增強Bata-連環(huán)蛋白的表達,影響Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,調(diào)節(jié)細胞周期及凋亡,進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。Yuan等［1］研究發(fā)現(xiàn),DACT 1在結(jié)腸癌細胞中的高表達能促進癌細胞的生長、增殖、遷移及侵襲能力。有研究認為［2］,在B細胞慢性淋巴細胞白血病細胞中DACT 1的高表達與其基因低甲基化有關(guān)。

DNA甲基化是基因表觀遺傳學(xué)修飾的一種重要方式,即在DNA序列不變的情況下調(diào)節(jié)某些特定基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性,控制該基因的表達［3］?；騿幼訁^(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與基因的活性有關(guān),啟動子區(qū)域CpG島高甲基化是基因失活的主要原因之一。先前研究發(fā)現(xiàn),抑癌基因DAPK及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因uPA的表達與其基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)有關(guān),且這些基因的甲基化狀態(tài)是可逆的,可通過調(diào)節(jié)某些酶的活性改變這些基因的表達,進而影響鼻咽癌及喉癌細胞的生長及侵襲能力［4］。本研究結(jié)果顯示未經(jīng)S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1基因啟動子區(qū)非甲基化,DACT 1高表達,而經(jīng)S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1基因啟動子區(qū)高甲基化,DACT 1不表達,且CNE細胞的侵襲能力明顯減弱。說明S-腺苷-L-甲硫氨酸在DNA復(fù)制過程中能使去甲基化的基因重新甲基化而失去表達,根據(jù)失活基因的功能而調(diào)節(jié)細胞的生長及侵襲,進而在腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用。

綜上所述,DACT 1基因甲基化狀態(tài)與其表達有關(guān),可以通過改變其甲基化狀態(tài)改變其表達,進而調(diào)控腫瘤細胞的生長及侵襲,進而調(diào)節(jié)腫瘤的進展。

［1］Yuan G,Wang C,Ma C,et al. Oncogenic Function of DACT 1 in Colon Cancer through the Regulation of b-catenin. Plos One,2012,7(3):1-17.

［2］Kong WJ,Zhang S,Guo CK,et al. Effect of methylationassociated silencing of the deathassociated protein kinase gene on nasopharyngeal carcinoma. Anti-Cancer Drugs,2006,17(3):251-259.

［3］張松,李爍,高春生. uPA基因啟動子區(qū)低甲基化在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用.腫瘤防治研究,2012,39(6):691-693.

［4］葉星星,蔡志毅,陳佳玉,等.細胞周期素G在鼻咽癌細胞中的表達及其意義. 中國衛(wèi)生檢驗雜志,2010(11):165-166.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.24.218

2015-08-20］

深圳市衛(wèi)生和計劃生育委員會資助項目(項目編號：201302227)

518106 深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科