劉超 李志偉 張艷橋

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因共同參與、涉及多條信號(hào)通路、緩慢而持續(xù)的過程[1]。在后基因組時(shí)代，得益于高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，研究者們從不同的腫瘤細(xì)胞中獲得了大量的基因組信息。這些基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，不同的基因在同一發(fā)展階段，甚至同一個(gè)基因在不同的階段都發(fā)揮著不同的生物學(xué)作用。如何探索這些基因與腫瘤的關(guān)系成為了研究者們面臨的最重要的挑戰(zhàn)。所以，對(duì)于腫瘤相關(guān)基因的功能研究，需要在不同的細(xì)胞分化階段，對(duì)不同的基因表達(dá)進(jìn)行有效的干擾，并以此為基礎(chǔ)研究該基因?qū)τ谀[瘤發(fā)生發(fā)展的影響。為此，研究者們迫切需要一個(gè)快速且有效的基因編輯技術(shù)，來人為地控制細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)水平。CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated nuclease 9）基因編輯技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，如鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger endonuclease, ZFN）[2]和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease, TALEN）[3]以及小片段干擾RNA技術(shù)后，更進(jìn)一步地填補(bǔ)了研究者們?cè)诖朔矫娴目杖?，并且從多個(gè)方向快速地推進(jìn)了腫瘤研究的進(jìn)展。

1 關(guān)于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的介紹

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過程中產(chǎn)生的適應(yīng)性的免疫防御機(jī)制，用來保護(hù)自身的基因組免受外源核酸如噬菌體、病毒等的干擾和破壞[4]。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一套適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，他應(yīng)用CRISPR RNA（crRNA）以堿基互補(bǔ)的形式引導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別入侵的外源基因組，并對(duì)其DNA進(jìn)行剪切。根據(jù)Cas蛋白的序列和結(jié)構(gòu)將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為I型、II型和III型[5]。其中I型和III型系統(tǒng)都需要多個(gè)Cas蛋白原件，而II型僅僅需要Cas9蛋白[6]。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)（即CRISPR/Cas9系統(tǒng)）已經(jīng)在化膿鏈球菌[7]和奈瑟球菌[8]內(nèi)重點(diǎn)研究，并且已被發(fā)展成為一套理想的程序化的基因編輯工具。

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成結(jié)構(gòu)

1.1.1 Cas9核酸內(nèi)切酶（CRISPR-associated nuclease 9） Cas9核酸內(nèi)切酶是II型CRISPR/Cas系統(tǒng)最必不可少的組成元件，他能夠以針對(duì)具有特異性DNA序列的DNA進(jìn)行雙鏈剪切[5]。Cas9核酸內(nèi)切酶是一個(gè)大的多結(jié)構(gòu)域蛋白，其中兩個(gè)核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域分別為：位于N端的RuvC核酸內(nèi)切酶樣的結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)在中部有類似HNH核酸酶的活性的結(jié)構(gòu)域。在體外實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，化膿鏈球菌內(nèi)的Cas9蛋白可以對(duì)靶DNA造成雙鏈斷裂切口。其中，HNH核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域完成對(duì)與crRNA互補(bǔ)鏈的剪切，而RuvC樣核酸內(nèi)切酶切割另外一條非互補(bǔ)鏈[9]。有趣的是，當(dāng)對(duì)這兩個(gè)內(nèi)酸酶位點(diǎn)進(jìn)行突變后，并不影響CRISPR/Cas9復(fù)合體與外源性間隔序列位點(diǎn)的結(jié)合。另外，在間隔序列旁有一段保守的短的核酸序列，如NGG、NGGNG、NAAR和NNAGAAW，即間隔序列臨近基序——PAM結(jié)構(gòu)（protospacer adjacent motif），對(duì)于Cas9蛋白進(jìn)行結(jié)合和剪切都是至關(guān)重要的[10]。不同的微生物需要不同的PAM結(jié)構(gòu)，但是對(duì)于Cas9蛋白需要識(shí)別特異的PAM結(jié)構(gòu)的機(jī)制仍然是未知的[11]。

1.1.2 反式激活crRNA（transactivating crRNA, tracrRNA）tracrRNA是CRISPR/Cas9系統(tǒng)第二個(gè)組成的部分，他是一個(gè)非蛋白編碼RNA，主要用來完成crRNA的成熟和之后的DNA剪切[12]。在化膿性鏈球菌中，tracrRNA由兩個(gè)起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生分別長(zhǎng)度為171個(gè)核苷酸和89個(gè)核苷酸序列前體tracrRNA，隨后兩者再進(jìn)一步加工成為75個(gè)核苷酸的成熟體tracrRNA。tracrRNA前體的一部分序列能夠與crRNA前體互補(bǔ)，有助于crRNA的成熟[7]。

1.1.3 CRISPR RNA（crRNA） CRISPR RNA攜帶著CRISPR/Cas系統(tǒng)中間隔序列的序列，負(fù)責(zé)捕捉外源性的DNA序列，起到復(fù)合體定位的功能。在化膿鏈球菌中，前體crRNA（pre-crRNA）是一條長(zhǎng)度為511個(gè)核苷酸的RNA，他包括一個(gè)前導(dǎo)區(qū)和一系列重復(fù)-間隔-重復(fù)的序列組成[7]。前體crRNA需要借助tracrRNA、RNaseIII以及Cas9蛋白經(jīng)過兩步剪切才能成為成熟的crRNA，其長(zhǎng)度約為39個(gè)-42個(gè)核苷酸序列，其中包括一個(gè)獨(dú)一無二的20個(gè)核苷酸的間隔序列和一個(gè)19個(gè)-22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的重復(fù)序列。這些序列可以特異性地識(shí)別到入侵基因組的剪切位點(diǎn)，指導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用過程

1.2.1 CRISPR序列的捕獲與記憶 在初始階段，噬菌體或外源性的核酸首次入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR系統(tǒng)需要把外源核酸上的一部分序列即原間隔序列整合到宿主基因組上成為間隔序列，然后這部分儲(chǔ)存在間隔序列內(nèi)的信息再用于抵抗外源基因的干擾[13]。所以起始階段屬于CRISPR系統(tǒng)行使功能的適應(yīng)階段。大量研究發(fā)現(xiàn)所有的CRISPR系統(tǒng)中都含有Cas2基因編碼區(qū)，表明Cas2在CRISPR系統(tǒng)作用的過程中起著非常重要的作用，研究結(jié)果也表明Cas2參與了新的間隔序列的形成[5]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)在CRISPR基因座上臨近間隔序列的附近有幾個(gè)非常保守的核苷酸的序列，稱為間隔序列臨近基序——PAM。不同的細(xì)菌和古細(xì)菌需要不同的PAM結(jié)構(gòu)，在化膿鏈球菌中的II型CRISPR系統(tǒng)的PAM結(jié)構(gòu)序列為NGG。PAM結(jié)構(gòu)的作用是將間隔序列定位于入侵的噬菌體或質(zhì)粒的DNA序列中，即宿主對(duì)入侵的外源核酸進(jìn)行掃描，在其DNA序列中定位若干個(gè)PAM，并將PAM結(jié)構(gòu)旁的序列定義為新的原間隔序列并被剪切后陸續(xù)的整合到CRISPR系統(tǒng)新合成的兩個(gè)重復(fù)序列之間。以此完成對(duì)外源核酸序列的捕獲和記憶。

1.2.2 CRISPR系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后加工 CRISPR系統(tǒng)的表達(dá)包括tracrRNA和crRNA的轉(zhuǎn)錄與成熟過程。重復(fù)序列和間隔序列在前導(dǎo)序列的啟動(dòng)下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄形成pre-crRNA，pre-crRNA通過剪切形成成熟的crRNA。以化膿鏈球菌內(nèi)的II型CRISPR系統(tǒng)為例[7]，tracrRNA由兩個(gè)起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長(zhǎng)度分別為171個(gè)核苷酸和89個(gè)核苷酸序列的前體tracrRNA，隨后二者再進(jìn)一步加工成為75個(gè)核苷酸的成熟體tracrRNA。前體tracrRNA的一部分序列能夠與crRNA前體互補(bǔ)，有助于crRNA的成熟。Pre-crRNA需要借助tracrRNA、RNaseIII以及Cas9蛋白經(jīng)過兩步剪切才能成為成熟的crRNA，crRNA長(zhǎng)度約為39個(gè)-42個(gè)核苷酸序列，其中包括一個(gè)單獨(dú)的20個(gè)核苷酸的間隔序列和一個(gè)19個(gè)-22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的重復(fù)序列。正常情況下細(xì)菌中的CRISPR的表達(dá)水平比較低。但是，當(dāng)噬菌體或外源質(zhì)粒再次入侵時(shí)，CRISPR會(huì)被迅速地誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。

1.2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)外源核酸進(jìn)行剪切 成熟后的crRNA與tracrRNA會(huì)有部分互補(bǔ)的區(qū)域，從而形成雙鏈的RNA，再與Cas9蛋白共同形成核糖核蛋白復(fù)合物。crRNA上的間隔序列會(huì)特異性地結(jié)合到外源核酸與其互補(bǔ)的序列上，然后解開DNA雙鏈，形成R環(huán)使crRNA與互補(bǔ)鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由復(fù)合體中Cas9蛋白中HNH結(jié)構(gòu)域剪切與crRNA的互補(bǔ)DNA鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域剪切非互補(bǔ)鏈。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)復(fù)合體的作用下，外源性的核酸會(huì)在特定的位置被剪切，形成雙鏈斷裂切口（double strand break, DSB），從而完成細(xì)菌對(duì)外源核酸的干擾[9]。

1.3 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的作用過程 基于對(duì)II型CRISPR/Cas系統(tǒng)即CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究，研究者們已經(jīng)將該套系統(tǒng)改造成為一套理想的程序化的基因編輯工具。Cas9介導(dǎo)的基因編輯依賴兩個(gè)連續(xù)的步驟：首先，Cas9核酸內(nèi)切酶在crRNA的介導(dǎo)下對(duì)基因組DNA進(jìn)行剪切；然后，DNA的DSB會(huì)被細(xì)胞內(nèi)天然的DNA修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)[14]。

首先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)剪切特定的DNA序列，需要三個(gè)重要的元件，包括：Cas9蛋白、tracrRNA、依據(jù)需要設(shè)計(jì)的特異性地crRNA。將這三個(gè)元件轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)該系統(tǒng)表達(dá)時(shí)，其tracrRNA會(huì)與crRNA形成雙鏈RNA并定向地與目標(biāo)DNA結(jié)合，同時(shí)Cas9蛋白會(huì)對(duì)目標(biāo)DNA的正鏈和反鏈進(jìn)行剪切，形成DSB，隨后細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)天然的DNA修復(fù)系統(tǒng)，完成DNA的修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，將pre-crRNA和tracrRNA構(gòu)建成一個(gè)融合RNA（single-guide RNA, sgRNA）來模擬成熟的crRNA和tracrRNA，同樣可以與Cas9共同作用特異地切割目的DNA，從而將CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)化成Cas9蛋白和sgRNA兩個(gè)組分。在大多情況下，Cas9蛋白和sgRNA兩個(gè)組分切割DNA的效率比Cas9蛋白、pre-crRNA和tracrRNA三個(gè)組分的效率高。

DSB修復(fù)的方式有兩種，一種是非同源末端連接（native nonhomologous end joining, NHEJ）[15]，這種修復(fù)方式往往會(huì)導(dǎo)致隨機(jī)的小片段的缺失或者插入（indels）以此來導(dǎo)致靶基因的故障，但這種編輯方式是不能夠進(jìn)行精確控制的；另一種是同源重組介導(dǎo)的修復(fù)（homology-directed repair, HDR）[16]，在雙鏈DNA斷點(diǎn)產(chǎn)生后，同時(shí)引入模板DNA序列，這部分序列根據(jù)需要，插入特定的一段序列（knock in）、刪除特定的序列（knock out）或突變特定的堿基或序列，這時(shí)候通過同源重組的作用進(jìn)行斷鏈修復(fù)，就可以把需要編輯的序列引入到特定的位點(diǎn)，以此完成精確的基因編輯。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一個(gè)新興的基因編輯技術(shù)，目前在生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，對(duì)該系統(tǒng)的應(yīng)用模式主要集中在以下三個(gè)方向：①利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點(diǎn)編輯目標(biāo)基因，目前已廣泛應(yīng)用于各種真核、原核生物的基因工程方面[17]；②基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組規(guī)模的基因編輯，再結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)篩選與表型相關(guān)基因的技術(shù)[18]；③利用滅活核酸酶活性后的Cas9（dCas9），將其改造成為一個(gè)利用RNA引導(dǎo)的歸航裝置，并通過改變與dCas9相融合的效應(yīng)器來擴(kuò)展該系統(tǒng)更加廣泛的用途[19]。目前，在腫瘤的研究中CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也被廣泛應(yīng)用，并獲得了許多令人欣慰的成果。

2.1 研究基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制中的應(yīng)用

2.1.1 白血病相關(guān)基因功能研究 先天性和獲得性的7號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失，常見于骨髓異常增生綜合癥和急性粒細(xì)胞白血病中，并且往往提示與不良預(yù)后相關(guān)[20]。但是對(duì)于位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的相關(guān)抑癌基因的功能的研究目前尚不清晰。組蛋白H3K4三甲基化轉(zhuǎn)移酶（MLL3）是7號(hào)染色體上的一個(gè)抑癌基因，他屬于MLL蛋白家族，可以對(duì)H3K4位置的賴氨酸進(jìn)行甲基化，進(jìn)而影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性[21]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因在結(jié)腸癌、髓母細(xì)胞瘤、乳腺腫瘤、白血病等疾病中廣泛存在[22,23]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)可以完成對(duì)單條或者兩條等位基因的編輯。有研究[24]利用該技術(shù)對(duì)MLL3基因進(jìn)行編輯，并獲得了該基因表達(dá)水平下調(diào)至野生型的50%水平的小鼠模型。以此為基礎(chǔ)，配合其他因7號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失的事件，最終促進(jìn)白血病的發(fā)生。有趣的是，MLL3半數(shù)抑制后導(dǎo)致的白血病，與人類7號(hào)染色體缺失或者7號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失后導(dǎo)致的白血病一樣，都是對(duì)常規(guī)化療的敏感性欠佳，而對(duì)BET抑制劑JQ1有較好的療效。因此，研究者們認(rèn)為他們構(gòu)建的小鼠模型成功地證實(shí)了MLL3基因是7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的一個(gè)單倍劑量不足的抑癌基因，并且為這種嚴(yán)重的疾病的治療提供了一個(gè)新的策略。

2.1.2 實(shí)體瘤相關(guān)基因功能研究 CRISPR/Cas9技術(shù)同樣運(yùn)用到了對(duì)實(shí)體瘤的研究中，以一項(xiàng)關(guān)于直腸癌與PIK3R1基因關(guān)系的研究為例[25]。在這項(xiàng)研究中，研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)在直腸癌細(xì)胞系水平上敲除PIK3R1基因，之后分別檢測(cè)該敲除細(xì)胞系與野型細(xì)胞系在上皮細(xì)胞間質(zhì)化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）及細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性等方面的變化，以此證明PIK3R1基因具有調(diào)節(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤干細(xì)胞特性的功能。

2.2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立小鼠腫瘤模型腫瘤模型的建立，為研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制和對(duì)治療探索提供了極大的幫助。小鼠模型是目前可以整合基礎(chǔ)和臨床腫瘤研究的理想載體，已廣泛應(yīng)用于腫瘤研究的各個(gè)領(lǐng)域。小鼠腫瘤模型按照建立的方法可分為以下幾類[26]：①自發(fā)和誘發(fā)小鼠模型；②移植型小鼠模型；③基因敲除小鼠模型；④轉(zhuǎn)基因小鼠模型等。

基因敲除小鼠腫瘤模型是指利用基因敲除的方法去除抑制腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因，從而誘導(dǎo)小鼠腫瘤發(fā)生的小鼠模型[27]。這對(duì)于認(rèn)識(shí)單一基因或數(shù)個(gè)基因在腫瘤發(fā)生中的作用而言，是一個(gè)理想模型。在過去30年中，基因編輯技術(shù)的開發(fā)和進(jìn)步，同樣促進(jìn)了用于研究人類惡性腫瘤特點(diǎn)的小鼠腫瘤模型。2014年，在Nature和Cell雜志上分別介紹了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建的小鼠腫瘤模型。

2.2.1 小鼠肝癌模型 利用小鼠模型對(duì)癌癥基因的研究，傳統(tǒng)上多是采取在受精卵水平上進(jìn)行基因編輯，然后將該編輯后的受精卵培養(yǎng)成為成鼠[28]。在這篇Nature的文章中，張鋒的研究團(tuán)隊(duì)介紹了一種新的構(gòu)建小鼠基因敲除腫瘤模型的方法，即利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在野型小鼠的體內(nèi)進(jìn)行基因編輯[29]。研究者們利用小鼠尾靜脈液壓注射技術(shù)，將表達(dá)有Cas9核酸內(nèi)切酶和一個(gè)sgRNA的DNA質(zhì)粒注射入小鼠肝臟，同時(shí)或者單獨(dú)對(duì)小鼠的Pten和P53抑癌基因進(jìn)行編輯。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)Pten突變后的小鼠，會(huì)導(dǎo)致Akt磷酸化水平的升高，以及過多的脂質(zhì)在小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)積聚。與此同時(shí)，研究者們同樣利用傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)——Cre-loxP重組酶系統(tǒng)模擬了小鼠敲除Pten和p53后導(dǎo)致的肝癌模型的表型，與前者表型一致。通過對(duì)小鼠肝臟和腫瘤組織的DNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中存在抑癌基因Pten和p53雙等位基因插入或者缺失的突變。此外，研究者們還利用CRISPR系統(tǒng)，將Cas9表達(dá)質(zhì)粒、靶向β-catenin的sgRNA以及能夠誘導(dǎo)β-catenin突變的寡鏈核苷酸共同注射入小鼠體內(nèi)，導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生突變后的β-catenin蛋白發(fā)生核移位，最終導(dǎo)致小鼠肝臟的癌變。這項(xiàng)研究揭示了新興的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)直接進(jìn)行抑癌或者原癌基因編輯的可行性，并且提供了肝癌模型構(gòu)建的新方法，同時(shí)為基因組學(xué)的研究提供了新的思路。

通過該項(xiàng)試驗(yàn)，研究者們證實(shí)了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在成年小鼠的肝臟內(nèi)進(jìn)行抑癌基因和原癌基因的編輯。這種方法避開了在胚胎干細(xì)胞水平上進(jìn)行的編輯，以及飼養(yǎng)雜合體小鼠的繁瑣。另外，借助腺病毒的方式、更加高效的sgRNA以及更長(zhǎng)的相互匹配的模板，這些比之前更加有效的遞送技術(shù)，也許能夠提高該項(xiàng)技術(shù)的編輯效率，并有機(jī)會(huì)擴(kuò)展更多的器官適用于此?？傊@項(xiàng)研究擴(kuò)展了CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用，使之更加廣泛，并且推動(dòng)了小鼠腫瘤模型研究的發(fā)展。

2.2.2 小鼠肺癌模型 在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建小鼠肝癌模型后不久，張鋒及其團(tuán)隊(duì)的研究人員又成功利用該技術(shù)構(gòu)建出了小鼠肺癌模型[30]。與之前構(gòu)建小鼠肝癌模型的方法不同的是，研究者們首先構(gòu)建出了Cas9基因敲入小鼠。這一模型小鼠簡(jiǎn)化了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體內(nèi)進(jìn)行基因編輯的步驟，并提高了編輯效率。利用這一新型的Cas9小鼠，研究人員成功編輯了小鼠體內(nèi)的各種細(xì)胞類型的多個(gè)基因，并成功構(gòu)建出了小鼠肺腺癌模型。

為了擴(kuò)展CRISPR/Cas9技術(shù)在體內(nèi)進(jìn)行基因編輯的應(yīng)用，研究者們利用Cre-loxP系統(tǒng)將Cas9基因敲入小鼠體內(nèi)，構(gòu)建出一個(gè)細(xì)胞內(nèi)能夠穩(wěn)定表達(dá)Cas9核酸內(nèi)切酶的小鼠（Cas9小鼠），這樣便克服了向成鼠體內(nèi)導(dǎo)入Cas9蛋白的困難。隨后，研究者們分別在體內(nèi)和體外，利用腺病毒、慢病毒以及顆粒介導(dǎo)的形式對(duì)小鼠的神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)入sgRNA。利用這些小鼠，研究者們選擇了三個(gè)基因，即KRAS、p53和LKB1，當(dāng)這些基因發(fā)生突變時(shí)能夠誘導(dǎo)肺腺癌的發(fā)生。然后，利用腺病毒的形式向該Cas9小鼠中，導(dǎo)入p53和LKB1基因的sgRNA以及利用同源重組的方式來編輯KRAS基因，致其發(fā)生突變，最終導(dǎo)致在小鼠體內(nèi)出現(xiàn)肺腺癌的病理變化。結(jié)合研究人員的研究結(jié)果，證實(shí)了Cas9小鼠模型在生物學(xué)和疾病建模中的廣泛應(yīng)用。

目前，該小鼠模型已經(jīng)被提供給全世界范圍內(nèi)的多家科學(xué)團(tuán)隊(duì)，研究人員們正在利用該小鼠模型繼續(xù)進(jìn)行基因組學(xué)的研究。

2.2.3 小鼠白血病模型 近年來基因組測(cè)序研究的結(jié)果顯示，在人類惡性腫瘤的發(fā)生過程中，往往存在4個(gè)甚至更多個(gè)基因的突變，但是利用傳統(tǒng)的小鼠模型育種方法，很難在小鼠模型中模擬出這種基因突變的復(fù)雜性。2014年6月在Nature子刊上刊登了一篇文章介紹了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)克服了這一限制[31]。來自美國哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員仍然利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，將sgRNA和Cas9共同遞送入同一只小鼠的造血干細(xì)胞中，對(duì)其中的5個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯，從而導(dǎo)致小鼠骨髓惡性腫瘤的發(fā)生。因此而獲得的該急性粒細(xì)胞白血病模型小鼠能夠成功地與白血病患者中出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路的相關(guān)的細(xì)胞因子等基因突變相匹配。這項(xiàng)研究結(jié)果向我們展示了，利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)sgRNA和Cas9的系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯，能夠被用來進(jìn)行體內(nèi)的多基因突變腫瘤模型的構(gòu)建，從而更好地模擬人類疾病的復(fù)雜性。

2.3 利用CRISPR衍生技術(shù)篩選與腫瘤表型相關(guān)的基因 得益于CRISPR/Cas9技術(shù)在基因編輯方面的高效性，在同一個(gè)細(xì)胞系中在基因組規(guī)模上，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因的編輯成為了可能。因此，研究人員們可以在基因組規(guī)模上，篩選出細(xì)胞內(nèi)的哪些基因和研究者們感興趣的表型相關(guān)。利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式可以同時(shí)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)入成千上萬個(gè)靶向不同基因的sgRNA。最近，多篇文章的發(fā)表，證實(shí)了這種篩選方式在人類細(xì)胞中陰性和陽性的篩選能力。以往在基因組規(guī)模上進(jìn)行這種功能缺失的篩選都是應(yīng)用的RNAi的方法[32]，但是這種方法僅僅能夠讓基因的表達(dá)水平下調(diào)，并且有著較為嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。相反，Cas9介導(dǎo)的sgRNA文庫篩選系統(tǒng)已經(jīng)被證實(shí)具有更高的篩選敏感性，而且?guī)缀蹩梢园邢蛘{(diào)節(jié)任何一段DNA序列[33-35]。在將來利用sgRNA篩選文庫可能會(huì)擴(kuò)展到對(duì)非編碼基因序列的篩選中[34]。

另外，隨著dCas9（endonuclease-de ficient Cas9即核酸內(nèi)切酶活性缺失的Cas9）技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，通過將不同的功能原件與其融合，基因篩選的方式可能不再只是功能缺失表型的篩選[18]。例如，將dCas9與轉(zhuǎn)錄激活原件融合，就可以進(jìn)行功能獲得表型的基因篩選。

2.3.1 利用GecKO文庫篩選與黑色素瘤耐藥相關(guān)的基因2014年Science和Nature雜志上連續(xù)報(bào)道了3篇關(guān)于利用Cas9技術(shù)在人類細(xì)胞中進(jìn)行基因篩選的文章[18,36-38]。其中，張鋒及其團(tuán)隊(duì)[18]構(gòu)建出了靶向人類基因組中18,080個(gè)基因的龐大的sgRNA文庫，并命名為GecKo（genome-scale CRISPR-Cas9 knockout）Library。在這個(gè)文庫中，設(shè)計(jì)人員們針對(duì)每一個(gè)基因設(shè)計(jì)了3個(gè)-4個(gè)sgRNA，即整個(gè)文庫包含了64,751個(gè)不同的sgRNA。結(jié)合慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和高通量測(cè)序的方法，最終完成該文庫對(duì)表型相關(guān)基因的篩選。

首先，研究人員利用該文庫對(duì)黑色素瘤細(xì)胞和多能干細(xì)胞的必需基因進(jìn)行了陽性和陰性篩選。接下來，研究者們?cè)诤谏亓鯝375細(xì)胞系中利用GecKo文庫篩選了黑色素瘤細(xì)胞中與vemurafenib（一種RAF抑制劑）耐藥相關(guān)的基因。通過高通量測(cè)序后的對(duì)比，研究人員最終得到了6個(gè)高度可疑的候選基因，其中NF1和MED12基因已經(jīng)在以前的研究中被證實(shí)與該藥物耐藥相關(guān)，另外還有基因NF2、Cul3、TADA2B和TADA1，這4個(gè)基因是新發(fā)現(xiàn)的可能與該藥物耐藥相關(guān)的基因。

2.3.2 利用GecKO文庫篩選與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因 2015年2月，張鋒教授及其研究團(tuán)隊(duì)[39]再接再厲，在Cell雜志上發(fā)表了最新的研究成果：利用CRISPR/Cas9技術(shù)改造的GecKo文庫在小鼠體內(nèi)篩選出和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。在這項(xiàng)研究中，研究人員選擇了一個(gè)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞系——KPD，然后借助慢病毒載體，將融合有GFP的Cas9基因序列整合到該細(xì)胞系基因組中，構(gòu)建出Cas9-GFP-KPD細(xì)胞系。接下來研究人員將之前構(gòu)建的mGecKoa文庫（包括67,405個(gè)sgRNA分別靶向20,611個(gè)基因和1175個(gè)microRNA）仍然以慢病毒的形式轉(zhuǎn)導(dǎo)入Cas9-GFP KPD細(xì)胞系中，并在體外培養(yǎng)一周。之后，將該轉(zhuǎn)導(dǎo)有Cas9及sgRNA文庫的細(xì)胞系及未經(jīng)文庫干擾的細(xì)胞系分別植入裸鼠體內(nèi)。將小鼠培養(yǎng)一段時(shí)間后，比較兩組小鼠腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，得出差異性基因，提示這些基因與非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

2.3.3 CRISPR介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)篩選白血病的抑癌基因 對(duì)于哺乳動(dòng)物來說，細(xì)胞內(nèi)同一個(gè)基因的表達(dá)水平在不同的細(xì)胞類型以及疾病發(fā)展的不同階段是不一樣的，但是研究者們對(duì)這種轉(zhuǎn)錄水平的變化的了解卻是相對(duì)落后的。有文獻(xiàn)[33]展示了一項(xiàng)新的系統(tǒng)，能夠用來系統(tǒng)地研究細(xì)胞內(nèi)基因在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)和上調(diào)時(shí)的變化。首先，研究人員通過將融合有轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域的dCas9（即CRISPRi技術(shù)），靶向到基因序列啟動(dòng)子附近的不同位置，從而達(dá)到不同的干擾效果。并以此建立標(biāo)準(zhǔn)，最終能夠可控的、在最小脫靶的情況下將基因表達(dá)水平下調(diào)90%-99%。然后，將轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合到dCas9上，來激活基因的表達(dá)（CRISPRa技術(shù)）。結(jié)合這兩項(xiàng)技術(shù)，最終可以把基因的表達(dá)水平調(diào)節(jié)在0.1倍-10倍的范圍內(nèi)。利用這一標(biāo)準(zhǔn)，研究人員構(gòu)建出了一個(gè)基因組規(guī)模的CRISPRi和CRISPRa文庫，并利用此文庫進(jìn)行基因的篩選。通過白血病細(xì)胞生長(zhǎng)為基礎(chǔ)的篩選，可以篩選出細(xì)胞生長(zhǎng)的必需基因、腫瘤的抑癌基因和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的基因。另外，研究者們還利用此文庫進(jìn)行了細(xì)胞對(duì)一種霍亂和白喉融合毒素的耐藥和敏感表型的基因篩選，并以此建立了一個(gè)假想的信號(hào)通路圖。基于這些研究結(jié)果，設(shè)計(jì)者們認(rèn)為，CRISPRi和CRISPRa文庫可以作為一個(gè)有力的工具，提供豐富且完整的信息以探索復(fù)雜的信號(hào)通路。

2.4 在腫瘤基因治療中的探索應(yīng)用 基因治療是指通過特殊的方法改變患者的遺傳物質(zhì)，將人的正?；蚧蛘哂兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入患者的靶細(xì)胞，直接針對(duì)患者的異?；虮旧磉M(jìn)行的治療，從而達(dá)到治療疾病的目的[40]。腫瘤的基因治療具有特異性、安全性、有效性的特點(diǎn)，是目前腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

2.4.1 膀胱癌基因治療研究中的新思路 在全世界范圍內(nèi)，膀胱癌都是一個(gè)非常常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤。傳統(tǒng)上針對(duì)于膀胱癌的治療多是化療或者放療，但是這些治療往往會(huì)殺死除腫瘤細(xì)胞以外的正常細(xì)胞，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用和治療失敗[41]。而針對(duì)于人類腫瘤相關(guān)基因的基因治療策略，是一個(gè)非常具有前景的膀胱癌治療方式。利用這種治療策略，需要啟動(dòng)凋亡和細(xì)胞毒性的基因，而且只有腫瘤細(xì)胞才會(huì)表達(dá)活躍的啟動(dòng)子進(jìn)行基因編輯，從而特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡或壞死。但是在腫瘤細(xì)胞中尋找這種特殊的啟動(dòng)子是很困難的，因?yàn)槟承┗螂m然在某個(gè)器官的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)活躍，這個(gè)基因也有可能在其他不同組織的正常細(xì)胞內(nèi)也會(huì)表達(dá)水平相對(duì)活躍。這就造成了以下困難：首先是這種治療策略的低效性；其次就是很多特殊的腫瘤基因啟動(dòng)子往往是低表達(dá)的。因此，現(xiàn)在亟需一個(gè)能夠提高腫瘤基因治療效率和可行性的方法。

在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，研究人員就巧妙地運(yùn)用了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和邏輯通路的原理，解決了上述問題[42]。在這里，研究人員設(shè)計(jì)出一種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的邏輯通路，輸入端是由兩個(gè)啟動(dòng)子組成，在細(xì)胞系內(nèi)只有當(dāng)這兩個(gè)輸入端口同時(shí)被激活時(shí)，輸出端的基因才會(huì)被激活。首先研究者分別將腫瘤特異性高表達(dá)啟動(dòng)子hTERT與sgRNA融合，將膀胱的組織特異性高表達(dá)啟動(dòng)子hUPII與表達(dá)Cas9的基因融合。當(dāng)細(xì)胞系同時(shí)存在這兩個(gè)啟動(dòng)子高表達(dá)時(shí)，才能激活CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)其下游基因進(jìn)行編輯，從而激活輸出端基因。該實(shí)驗(yàn)中，分別利用熒光素酶報(bào)告基因，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的BAX基因，與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的p21基因，與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的E-cadherin基因作為輸出基因。實(shí)驗(yàn)證明，只有在膀胱癌的細(xì)胞系中，邏輯通路才會(huì)激活這些輸出基因，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表型的進(jìn)一步變化。這項(xiàng)研究為腫瘤基因治療的研究提供了新的思路。

2.4.2 治療HPV感染導(dǎo)致的宮頸癌的研究 高危型人乳頭狀瘤病毒癌基因（E6和E7）表達(dá)異常是宮頸癌發(fā)病的重要原因[43]。所以，這兩個(gè)病毒癌基因也被視為重要的治療靶點(diǎn)。為了開發(fā)特異性的針對(duì)HPV感染相關(guān)腫瘤的基因治療的策略，研究人員基于CRISPR/Cas9技術(shù)建立了靶向編輯E6、E7基因的編輯系統(tǒng)，并將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染入感染HPV-16病毒陽性的宮頸癌細(xì)胞系——SiHa細(xì)胞[44]。結(jié)果表明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行E6、E7基因及其啟動(dòng)子的編輯后，會(huì)導(dǎo)致p53和p21蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，從而顯著降低宮頸癌細(xì)胞系在體外的增殖能力。隨后，研究人員進(jìn)行了裸鼠的皮下接種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建皮下植瘤的動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向編輯E6、E7基因后的腫瘤細(xì)胞接種的小鼠體內(nèi)，腫瘤的生長(zhǎng)受到顯著抑制。這項(xiàng)研究結(jié)果為CRISPR/Cas9系統(tǒng)在靶向編輯高危型HPV致癌基因的基因治療中的應(yīng)用提供了證據(jù)；并且作為一種新的治療策略，在宮頸癌和其他HPV相關(guān)癌癥的治療中提供了新的思路。

2.5 在腫瘤的其他研究方面中的應(yīng)用

2.5.1 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建腫瘤相關(guān)染色體易位模型 人類腫瘤相關(guān)的染色體易位往往是通過兩個(gè)DSB產(chǎn)生的非同源染色體的異常接合形成[45]。在研究白血病和肉瘤發(fā)病的初始機(jī)制時(shí)，需要一個(gè)有效的方法能夠精確的重現(xiàn)這種腫瘤相關(guān)的染色體易位。有研究人員[46]利用gRNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在體外特定的位點(diǎn)構(gòu)建出這種癌癥相關(guān)的染色體易位。利用這一方法，Rodriguez-Perales成功地在人類細(xì)胞系和原代細(xì)胞中模擬出與急性骨髓性白血病和尤因氏肉瘤高度一致的模型。利用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescencein situhybridization,FISH）和分子分析對(duì)這些編輯后的細(xì)胞的融合基因的mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，顯示出CRISPR-Cas9方法的可靠性和精確度，這為染色體易位相關(guān)腫瘤的研究提供了一個(gè)有力的工具。

2.5.2 在腫瘤相關(guān)miRNA研究中的應(yīng)用 microRNA能夠調(diào)節(jié)血管生成的平衡[47,48]。最近的一項(xiàng)研究[49]表明，當(dāng)所有microRNA枯竭，會(huì)導(dǎo)致腫瘤的血管生成受到抑制。研究人員通過敲除Dicer1形成microRNA缺陷的腫瘤。這些腫瘤處于高度缺氧狀態(tài)，但是其血管生成不良，提示了其血管生成相關(guān)信號(hào)的不足。通過基因表達(dá)譜檢測(cè)分析，由于microRNA枯竭，導(dǎo)致了血管生成基因的表達(dá)顯著下調(diào)。但是，在這一背景下，F(xiàn)IH1（HIF-1抑制因子）卻是激活的狀態(tài)，進(jìn)而能夠抑制HIF的轉(zhuǎn)錄活性。隨后，在microRNA缺陷的細(xì)胞系中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除FIH1基因，這時(shí)，HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生、腫瘤缺氧和腫瘤血管生成的情況都會(huì)較之前有相反的變化。繼續(xù)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)FIH1基因非編碼區(qū)中的microRNA的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行編輯，則會(huì)出現(xiàn)FIH1蛋白的表達(dá)正常，但是細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境的反應(yīng)能力卻未能恢復(fù)。這些研究結(jié)果表明，microRNA能夠通過抑制FIH1基因來促進(jìn)腫瘤對(duì)低氧和血管生成的反應(yīng)。

2.5.3 構(gòu)建腫瘤類器官 腫瘤類器官能夠復(fù)制原發(fā)腫瘤的一些關(guān)鍵特性，這種“類器官”培養(yǎng)物適用于大規(guī)模的藥物篩查來檢測(cè)與藥物敏感性相關(guān)的一些遺傳改變，為采用個(gè)體化治療改善癌癥患者的臨床結(jié)局鋪平了道路。目前，人們主要還是利用培養(yǎng)皿中的二維細(xì)胞系或是在小鼠模型中開展抗癌藥物篩查。腫瘤類器官相對(duì)于細(xì)胞系更加近似人類腫瘤，且比小鼠模型更節(jié)省時(shí)間和資源，為研究人員提供了現(xiàn)有方法之間的一個(gè)折中策略。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，Keio大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)建立了源自正常腸道上皮的大腸癌類器官[50]。這項(xiàng)發(fā)表在Nature Medicine雜志上的研究，實(shí)驗(yàn)人員通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)向人類正常腸道上皮組織內(nèi)引入了腫瘤抑制基因APC、SMAD4和TP53突變，以及癌基因KRAS和PIK3CA突變。他們發(fā)現(xiàn)，表達(dá)全部五種突變的類器官，不依賴干細(xì)胞巢的因子就能在體外生長(zhǎng)，而且移植到小鼠腎包膜下會(huì)形成腫瘤。進(jìn)一步研究表明，這種類器官注射到小鼠脾臟之后會(huì)發(fā)生微轉(zhuǎn)移，但癌細(xì)胞并不能在肝臟站穩(wěn)腳跟。而源自人類腺瘤的類器官（染色體不穩(wěn)定）在移植后會(huì)形成大的轉(zhuǎn)移集落。這項(xiàng)研究指出，激活通路突變可以在腫瘤微環(huán)境中維持腫瘤干細(xì)胞特性，但結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲性行為還需要細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)更多的分子損傷。

3 小結(jié)

從來沒有哪項(xiàng)生物學(xué)技術(shù)能像CRISPR/Cas9系統(tǒng)這樣風(fēng)靡整個(gè)科學(xué)界，贏得了全世界科學(xué)家的熱切關(guān)注，并且迅速成為基因編輯的主要技術(shù)手段。同樣，隨著該項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)存在的問題也暴露出來，其中表現(xiàn)最為突出的就是這種基因編輯的脫靶效應(yīng)[51]。

脫靶效應(yīng)是指基因編輯系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)靶點(diǎn)以外的基因片段進(jìn)行修飾。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的向?qū)NA片段與目標(biāo)DNA片段只需要20個(gè)核苷酸進(jìn)行匹配，所以這段RNA也極有可能會(huì)與目標(biāo)外的其他片段發(fā)生結(jié)合。美國麻省總醫(yī)院的Joung博士的團(tuán)隊(duì)研究[52]發(fā)現(xiàn)這種脫靶位點(diǎn)的突變的確存在，其突變率甚至較目標(biāo)靶點(diǎn)的突變效率相同甚至更高。因?yàn)檫@種脫靶效應(yīng)干擾了細(xì)胞內(nèi)其他基因的穩(wěn)定性，由此帶來的非預(yù)期的細(xì)胞生物學(xué)行為和問題也隨之而來，包括基因敲除效率降低、嚴(yán)重的細(xì)胞毒性出現(xiàn)，以及給腫瘤基因治療帶來的挑戰(zhàn)。面對(duì)這些問題，研究者們探索了一系列的方法來改善這種情況，如設(shè)計(jì)特異程度較高的sgRNA；除靶標(biāo)外，盡量避免在基因組中sgRNA后緊隨PAM結(jié)構(gòu)；突變Cas9核酸酶的RuvC-like結(jié)構(gòu)域或HNH結(jié)構(gòu)域，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)改造為切口酶，激活細(xì)胞的同源重組修復(fù)機(jī)制，對(duì)降低細(xì)胞毒性具有一定作用。

目前，隨著基因組信息不斷積累，人類對(duì)于基因功能的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于發(fā)現(xiàn)新的基因的速度。在這個(gè)背景下，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)作為新興的基因編輯技術(shù)一經(jīng)發(fā)表，即獲得廣泛的關(guān)注。這一高效而簡(jiǎn)單的基因編輯技術(shù)，為更多的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)提供了有力的研究基因功能的武器。腫瘤研究作為多年來生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，也從中獲益匪淺。從單一腫瘤相關(guān)基因功能的研究到小鼠腫瘤模型的構(gòu)建，再到Cas9衍生技術(shù)用于腫瘤相關(guān)表型基因的篩選以及在腫瘤基因治療中的探索。在短短的2年時(shí)間內(nèi)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)勢(shì)如破竹地解決著腫瘤研究中的一個(gè)又一個(gè)難題。作為21世紀(jì)最為杰出的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)之一，這項(xiàng)技術(shù)勢(shì)必會(huì)在生物學(xué)基因研究領(lǐng)域內(nèi)掀起一場(chǎng)新的革命，也注定會(huì)推進(jìn)腫瘤研究的快速發(fā)展，并且為更多的腫瘤患者帶去新的希望。