劉海成（內(nèi)蒙古巴彥淖爾市動物疫病預(yù)防控制中心 015000）

動物疫病診斷中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用

劉海成（內(nèi)蒙古巴彥淖爾市動物疫病預(yù)防控制中心 015000）

隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)在逐漸誕生一種多重PCR技術(shù)，這種技術(shù)能夠一次性的鑒別多重疾病，使得疫病診斷上升到了分子水平，有著非常大的優(yōu)勢，本文從實際的工作經(jīng)驗出發(fā)，探索多重PCR技術(shù)在動物疫病診斷中的應(yīng)用。

動物疫病診斷；多重PCR技術(shù)；DNA體外擴增

PCR技術(shù)又叫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，也叫體外擴增技術(shù)。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展以及在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用，為人們在疫病診斷提供了豐富的經(jīng)驗和科研素材，人們對于疫病診斷技術(shù)也越來越成熟，多重PCR技術(shù)就是在這個基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。它在保證高敏感度和高效率基礎(chǔ)下，能夠一次性的完成對多個疾病的診斷過程。多重PCR技術(shù)最早應(yīng)用于疾病診斷是在1988年對人類杜氏肌營養(yǎng)不良基因外顯因子的診斷過程，后來逐漸的被應(yīng)用于動物疫病的診斷當(dāng)中，實踐證明，多重PCR技術(shù)對于動物疫病中的細菌性、病毒性、寄生蟲疾病有著非?？焖佟?zhǔn)確、特異的診斷方法。

1 多重PCR技術(shù)的特點

多重PCR技術(shù)整體上和常規(guī)的PCR技術(shù)相差無幾，位移的不同點是多重PCR技術(shù)是在同一體系中加入了多對引物，能夠?qū)ν环从丑w系中的多個病原微生物進行檢測，或者同一微生物多個類別的目的基因進行分型，從而實現(xiàn)一次性完成多個病原體微生物的檢測過程，從而大大地降低了檢測的時間，節(jié)省了試劑的用量，而且診斷過程和PCR技術(shù)一樣非常的具備準(zhǔn)確性和特異性。需要注意的多重PCR技術(shù)的引物設(shè)計和反應(yīng)條件要求非常的高，這也是實現(xiàn)多個疫病診斷的重要環(huán)節(jié)。另外在多重PCR技術(shù)的優(yōu)化過程中可能會遇到擴增產(chǎn)物很少甚至消失的情況，特別注重對引物的設(shè)計過程，從而保證多重PCR技術(shù)的精確性[1]。

2 多重PCR技術(shù)在動物疫病診斷中的應(yīng)用

2.1 應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查

在流行病學(xué)調(diào)查中重要的一點就是對豬鏈球菌的檢測，這種病菌是引起腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎等疫病的重要原因之一。由于這類細菌K抗原的不同，豬鏈球菌可以分為35種不同血清類型。多重PCR技術(shù)能夠?qū)Χ鄠€血清類型的豬鏈球菌進行檢測，由于臨床學(xué)上認為仔豬感染的主要的感染源來自于亞臨床感染的豬。為此對于這些豬的疫病監(jiān)測能夠很好的了解豬鏈球菌的流行病學(xué)的機理，從而對疫病進行很好的控制。根據(jù)Henk和Wis等人的研究成果，該菌檢測的時候采用了3對引物，這三對引物的設(shè)計主要是為了對應(yīng)epf基因編碼中EF蛋白1型和高致病性2型菌株，為了避免假陰性帶來的干擾效果，格局pGL2-B質(zhì)粒設(shè)計了一個作為內(nèi)部陽性對照效果的949bp引物，并設(shè)計實驗選用了45份豬扁桃體樣本，使用多重PCR技術(shù)進行檢測得到的結(jié)果和傳統(tǒng)的細菌學(xué)方法結(jié)果呈現(xiàn)一致性，但是速度明顯要快于常規(guī)的細菌學(xué)檢測的方法，而且能夠特異性和敏感的診斷出1（14）、2（1/2）、7、9以及2型弱毒豬鏈球菌[2]。

2.2 應(yīng)用于類癥鑒別

其中造成雞群呼吸道傳染病的感染源有多種，常見的有禽流感、雞傳染性喉氣管炎、雞新城疫、雞毒霉形體等。而且對于不同年齡階段的雞群感染也具有不同的針對性，這些疾病由于擁有高發(fā)病率和死亡率所以危險性極高，如果不能有效的檢測和控制會給養(yǎng)雞戶或者養(yǎng)雞場造成巨大的經(jīng)濟損失。由于造成的臨床表現(xiàn)相似，因此從解剖學(xué)的角度無法進行區(qū)分，而且在實際的檢測中不僅干擾項非常的多而且操作也非常的麻煩，為此我們引入了多重PCR技術(shù)實現(xiàn)對該類傳染病病原的檢測過程。具體的操作為：首先根據(jù)以上幾種病原體各自的保守序列選擇6對引物，擴增的長度分別為1050bp、 1720bp、 732bp、 674bp、 310bp、 207bp 的片段， 并改進三溫式多重PCR技術(shù)，使用二溫式多重PCR技術(shù)檢測這幾種病原體感染，實驗結(jié)果顯示，多重PCR技術(shù)能夠很好的實現(xiàn)對這六種病原的檢測過程，而且檢測效率和準(zhǔn)確性非常的高，具有非常好的臨床效果[3]。

2.3 應(yīng)用于病原微生物的分型鑒定

根據(jù)謝芝勛等人的研究，以M基因和HA基因作為靶基因設(shè)計了3對引物，利用這三對引物分別對AIV H5和H7亞型特異性引物進行了檢測，利用引物擴增了三種不同長度的cDNA片段，并且通過多重PCR技術(shù)進行優(yōu)化成功的實現(xiàn)了對AIV、H5、H7的分型多重PCR技術(shù)的鑒定試驗。實驗結(jié)果顯示分型鑒定的具備PCR技術(shù)中的特異性和敏感性。根據(jù)引物對不同亞型病原微生物的cDNA片段不同，表現(xiàn)出多重PCR技術(shù)的微生物分型鑒定中應(yīng)用的科學(xué)性和臨床可行性。

2.4 應(yīng)用于動物寄生蟲診斷

由于臨床檢查手段的限制，對于很多在反芻動物胃腸道中寄生蟲的診斷效果非常差，在動物感染以后常規(guī)的檢測手段很難發(fā)現(xiàn)幾種寄生蟲之間的區(qū)別，例如蛇形毛圓線蟲和奧式奧斯特他線蟲在外型上就十分的相似，在對于這些相似的寄生蟲進行診斷的時候常規(guī)的臨床檢測遇到了困難，使用常規(guī)的觀察法和蟲卵檢測的結(jié)果的準(zhǔn)確性很難保證，嚴(yán)重地影響了動物疫病診斷的效果，因此Zar就利用多重PCR技術(shù)實現(xiàn)了對多種動物寄生蟲的診斷過程，同樣的是利用幾種寄生蟲rDNA重復(fù)序列中特殊序列段的差異的不同設(shè)計了幾對特異性的引物對，從而實現(xiàn)了對多種線蟲的檢測。同時對幾種線蟲的單一DNA模板進行了敏感性實驗，實驗結(jié)果顯示特異性片段基本不受干擾能夠進行有效的擴增，驗證了足夠的敏感性。

3 多重PCR技術(shù)存在的問題與發(fā)展

多重PCR技術(shù)保留了常規(guī)PCR技術(shù)的特異性和敏感性的同時，具有對多個基因的一次性檢測的過程，優(yōu)勢非常的明顯，在動物疫病檢測中的應(yīng)用也非常的廣泛。特別是在多重感染、流行病學(xué)、多種寄生蟲的檢測比常規(guī)的檢測辦法更加的優(yōu)越。但同時多重PCR技術(shù)也存在著一定的問題和缺陷，主要表現(xiàn)在：首先由于擴增反應(yīng)抑制物以及孔間溫差的存在，導(dǎo)致可能會假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，其次由于病原體之間的交叉感染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。其次是多重PCR技術(shù)由于較高的技術(shù)成本和設(shè)備投入導(dǎo)致非常的昂貴，沒有辦法大面積的普及，而且由于實踐經(jīng)驗的不足導(dǎo)致多重PCR技術(shù)還沒有形成完善的操作規(guī)范。

4 結(jié)語

當(dāng)前隨著我國畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，對于動物疫病檢測技術(shù)的要求越來越高，學(xué)習(xí)和研究多重PCR技術(shù)有著非常實際的社會意義，對于普及多重PCR技術(shù)在動物疫病檢測方面有著很大的幫助。

[1]黃溢泓,韋正吉,李志源,等.多重PCR技術(shù)在動物病原檢測中的應(yīng)用[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,40（4）:423-426.

[2]賀顯晶,孫東波,周玉龍,等.豬群中7種高發(fā)傳染病多重PCR診斷方法的建立[J].畜牧與飼料科學(xué),2010,31（9）:4-5.

[3]宏云,尚崇華,等.多重PCR技術(shù)在畜禽病原學(xué)檢測中的應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49（7）:1719-1721.

劉海成（1973-），男，內(nèi)蒙古巴彥淖爾市人，獸醫(yī)師，主要從事動物疫病實驗室診斷工作。