郭安臣,趙一龍,蘇芳,李巍巍,王擁軍,王群
缺血性卒中占全部卒中的60%~80%,是由于腦血液供應(yīng)障礙引起缺血、缺氧,營養(yǎng)剝奪,導(dǎo)致缺血中心的壞死和缺血周邊出現(xiàn)半暗帶區(qū)。即便恢復(fù)血液供應(yīng),也會造成再灌注損傷,導(dǎo)致患者的病情繼續(xù)加重。針對腦缺血損傷的主要措施是積極采取腦保護(hù)措施。基于腦保護(hù)研發(fā)的藥物在臨床前實驗中均表現(xiàn)出明顯的療效,而臨床試驗卻無法獲得理想的結(jié)果,沒有一種腦保護(hù)藥物通過美國藥品食品管理局的批準(zhǔn)[1]。因此,從新的模型制作、新的藥物發(fā)現(xiàn)和保護(hù)機(jī)制進(jìn)行更深入的研究對缺血性卒中的研究和臨床治療有更重要的意義。本文就腦缺血體外模型的現(xiàn)狀,制備方法進(jìn)行綜述希望對腦缺血的研究提供參考。
1.1 神經(jīng)元 神經(jīng)元一直被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的細(xì)胞,神經(jīng)元的損傷、功能失調(diào)甚至凋亡將直接導(dǎo)致神經(jīng)功能的缺失,因此既往很多治療腦血管病的神經(jīng)保護(hù)藥物都以保護(hù)神經(jīng)元為目標(biāo),其中原代培養(yǎng)的神經(jīng)元和神經(jīng)元細(xì)胞系相比更是受到研究人員的重點(diǎn)關(guān)注[2]。
神經(jīng)元損傷主要涉及下列機(jī)制:①興奮性氨基酸的毒性作用腦缺血缺氧時大量興奮性氨基酸,尤其是谷氨酸的暴發(fā)性釋放,N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體過度激活,形成所謂的“興奮毒性”,造成突觸后神經(jīng)元過度興奮、潰變、壞死[3]。②細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,發(fā)生缺血性卒中時,電壓依賴性Ca2+通道開放,引起損傷性Ca2+內(nèi)流,細(xì)胞外大量Ca2+內(nèi)流入細(xì)胞內(nèi),此時的Na+流出細(xì)胞外,同時激活蛋白激酶C(protein kinase C)、磷脂酶C(phospholipase C)和磷脂酶D(phospholipase D)途徑,導(dǎo)致花生四烯酸堆積,對神經(jīng)元造成損傷[4]。③自由基生成增加。自由基是指最外層電子軌道上含有一個或多個未配對電子的物質(zhì)??煞譃閮深悾阂活愂怯裳跽T發(fā)的自由基稱為氧自由基;另外一類是氧自由基與多聚不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產(chǎn)物是脂自由基。氧自由基主要指O2-和-OH等,研究顯示,自由基損傷以缺血后再灌注時為最重,可能由于溪流和滴流的供血攜帶了微量氧進(jìn)入組織,為維持脂質(zhì)過氧化程序提供條件,加重自由基損傷[5]。④炎癥反應(yīng)。已經(jīng)證實,缺血損傷后產(chǎn)生組織炎癥反應(yīng),表現(xiàn)在炎癥因子上調(diào),促黏附分子和黏附分子的表達(dá)增加。已知的致炎因子包括白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等;黏附分子包括細(xì)胞間黏附分子1、內(nèi)皮細(xì)胞選擇素、血管細(xì)胞黏附分子等[6-7]。小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)在大鼠全腦缺血標(biāo)本也比較強(qiáng)烈,應(yīng)激的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β。動物實驗顯示,大腦中腦動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠局灶缺血區(qū)20 min內(nèi)可見反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞,缺血再灌注損傷后缺血中心區(qū)內(nèi)充滿小膠質(zhì)細(xì)胞。這些實驗提出抗炎治療是神經(jīng)保護(hù)措施的理論依據(jù)[8]。⑤細(xì)胞凋亡不僅在發(fā)育過程中,而且在疾病發(fā)生中越來越受到人們的重視,它可能參與腫瘤、老年性癡呆等神經(jīng)退變性疾病、艾滋病等疾病發(fā)生[9]。以前的研究認(rèn)為,腦缺血過程中的細(xì)胞死亡是一種被動的壞死,然而最近的研究提示,缺血缺氧可能誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10]。實驗發(fā)現(xiàn),在缺血性損害的急性期及遲發(fā)性神經(jīng)無損害期,凋亡細(xì)胞均存在,而在遲發(fā)性神經(jīng)元死亡期以細(xì)胞凋亡為主。缺血性損害的急性期,凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞并存,提示神經(jīng)細(xì)胞凋亡與壞死均參與腦缺血急性期細(xì)胞損害,但各自程度與缺血損害的輕重有關(guān)。輕度缺血時壞死表現(xiàn)輕微,細(xì)胞凋亡成為細(xì)胞損害的主要形式。在遲發(fā)性神經(jīng)元損害期,無論是輕度缺血還是重度缺血,細(xì)胞凋亡均是細(xì)胞丟失的主要形式。
1.2 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 大腦由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成,生物的進(jìn)化程度越高,膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)細(xì)胞中所占的比例也越高,人腦內(nèi)90%的細(xì)胞皆為膠質(zhì)細(xì)胞。最新研究表明,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中的發(fā)病及治療過程中發(fā)揮重要作用,成為治療缺血性卒中的新靶點(diǎn)[11]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)促紅細(xì)胞生成素的主要來源,促紅細(xì)胞生成素能夠減少神經(jīng)元的凋亡,降低興奮性氨基酸毒性及一氧化氮(nitric oxide,NO)引起的細(xì)胞死亡。同時卒中后星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠表達(dá)血管樣表皮生長因子,這種血管樣表皮生長因子有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用,能夠抑制遲發(fā)性細(xì)胞凋亡;且能夠促進(jìn)血管的再生,對缺血性卒中的康復(fù)有重要意義[12-14]。細(xì)胞移植實驗表明,移植到腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠高表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors)、血小板源性生長因子(plateletderived growth factors)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein)等,而星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過這些細(xì)胞因子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。
1.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞與血腦屏障 缺血性卒中除神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生病理生理性改變外,向大腦供血的血管壁的完整性也遭到破壞。血管壁由血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜構(gòu)成,正常情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放活性因子,調(diào)節(jié)血管張力、凝血、纖溶功能及維持正常血壓均有一定的作用,一旦血管內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜受到損傷,可使血小板黏附、聚集,導(dǎo)致血栓形成,而且受刺激的內(nèi)皮細(xì)胞可釋放促凝血因子參與外源性凝血過程,加速血栓形成[16-17]。
血管內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞一起形成血腦屏障,血腦屏障能夠阻止損傷因子進(jìn)入腦組織,同時也阻止了神經(jīng)保護(hù)藥物進(jìn)入腦組織發(fā)揮作用的可能性[18]。血管內(nèi)皮損傷和缺血性卒中密切相關(guān),目前對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的確切機(jī)制及防治方法尚未完全清晰,因此,進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制對治療缺血性卒中有重要意義。
1.4 腦片模型 細(xì)胞培養(yǎng)雖然具備實驗條件易于控制,方便操作,細(xì)胞的生物學(xué)特征明確,但是,由于脫離了體內(nèi)環(huán)境,使其喪失了組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞之間的聯(lián)系以及與之相關(guān)的生化特性。為了更好地研究缺血性卒中后各種細(xì)胞的變化,探索缺血性卒中的發(fā)病機(jī)制,尋找更有效的治療方法。有學(xué)者建立了腦片模型,它相對于原代腦內(nèi)的各種細(xì)胞,腦片可在體外培養(yǎng)數(shù)周時間,能保留體內(nèi)狀態(tài)下的細(xì)胞構(gòu)成,突觸回路,受體分布,細(xì)胞間的相互作用和三維立體結(jié)構(gòu),具有正常和完整的突觸通路、遞質(zhì)傳遞和電生理等功能;腦片培養(yǎng)排除了體內(nèi)模型中血腦屏障(bloodbrain barrier)的干擾,可采用人工培養(yǎng)基或添加各種藥物,易于控制培養(yǎng)環(huán)境[19]。
1.5 神經(jīng)血管單元 盡管國內(nèi)外研究者圍繞缺血后神經(jīng)元的損傷與修復(fù)機(jī)制進(jìn)行了大量的研究并取得一定進(jìn)展,但仍缺乏有效治療方法。過去對腦缺血損傷研究大多局限在神經(jīng)元本身,或者將大腦中不同的細(xì)胞群體和結(jié)構(gòu)分割開來研究,忽略了大腦功能的整體性和不同結(jié)構(gòu)間的相互作用。2003年,美國科學(xué)家Lo等提出腦神經(jīng)血管單元的概念。神經(jīng)血管單元這一概念的提出,為臨床治療缺血性卒中提供了新的靶點(diǎn)?!澳X神經(jīng)血管單元”是由微血管(這些血管的內(nèi)皮-基質(zhì)-星形細(xì)胞足突復(fù)合體是一個完整的部分)、血管周圍的星形細(xì)胞突起及由這些突起所支持的神經(jīng)元及軸突共同組成的復(fù)合體,包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管周細(xì)胞、基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)[20]。
缺血性卒中體外模型制備主要涉及細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)?,F(xiàn)對常用細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方法做簡要介紹。
2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng)
2.1.1 經(jīng)典原代神經(jīng)元培養(yǎng)方法 多采用15~18 d孕齡的胎鼠或新生鼠,在無菌條件下取材、機(jī)械分離、酶消化等步驟獲得細(xì)胞懸液,接種至包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿內(nèi),用添加B27的Neurobasal無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),并用阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長,可獲得純度較高的原代培養(yǎng)神經(jīng)元,培養(yǎng)7~10 d后用于實驗[12]。
2.1.2 經(jīng)典原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法 經(jīng)典原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法是由McCarthy 和Vellis于1980年建立的。膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的取材過程與神經(jīng)元原代培養(yǎng)類同,只是培養(yǎng)時換成利于膠質(zhì)細(xì)胞生長的杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基(Dulbecco minimum essential medium,DMEM)完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),體外培養(yǎng)l0~12 d后細(xì)胞融合并分層:上層主要為小膠質(zhì)細(xì)胞,下層主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞。通過不同時間的水平搖動,使得小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞得以純化,并應(yīng)用于相關(guān)實驗[22]。2.1.3 原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 一般從成年動物大腦皮質(zhì)取材,剪刀破碎成1 mm大小,膠原酶消化后,經(jīng)密度梯度離心或過篩方法獲得,然后接種至Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)板內(nèi),培養(yǎng)4~5 d后融合形成緊密連接的單層細(xì)胞[23]。
而建立體外血腦屏障模型,則需要同時培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,將兩種細(xì)胞分別培養(yǎng)在Transwell細(xì)胞小室的上下層,通過測試通透性和跨內(nèi)皮電阻(transendothelial electrical resistance,TEER)判斷血腦屏障模型的完成情況。進(jìn)一步利用血腦屏障模型進(jìn)行藥物及其他試驗[24]。
2.1.4 腦片制備 腦片制備多采用出生后6~8 d的乳鼠。低溫麻醉后,用75%的乙醇浸泡消毒,斷頭取腦,迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的人工腦脊液中,用振動切片機(jī)進(jìn)行切片,切片厚度為200~400 μm。整個過程要無菌。腦片穩(wěn)定過夜后可進(jìn)行后續(xù)實驗[25]。
2.1.5 神經(jīng)血管單元制作方法 神經(jīng)血管單元制作以Transwell培養(yǎng)小室為媒介,結(jié)合原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),將神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)在一個體系中,同一體系的三種細(xì)胞培養(yǎng)成熟后,從形態(tài)學(xué)、屏障特性、特征性蛋白表達(dá)水平及niche環(huán)境的變化對神經(jīng)血管屏障進(jìn)行研究[26]。
2.2 制備缺血性卒中體外模型的干預(yù)方法 缺血性卒中的主要病因是由于血栓阻塞血管造成缺血缺氧區(qū)域的細(xì)胞發(fā)生病變,因此有關(guān)制備缺血性卒中模型的干預(yù)方法適用于所有細(xì)胞模型。
2.2.1 缺血、缺氧 氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)是使用低氧裝置結(jié)合無糖、無血清培養(yǎng)基或是向無糖培養(yǎng)基中持續(xù)通入不含氧的混合氣體(5%CO2+95%N2)來模擬缺糖、缺氧環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)缺血、缺氧處理一段時間后,再把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常氧濃度和含糖培養(yǎng)基條件下繼續(xù)培養(yǎng),以模擬細(xì)胞或組織缺血再灌注損傷的病理生理學(xué)過程。
2.2.2 興奮毒性 一般采用谷氨酸或谷氨酸鹽和NMD,NMDA等試劑。100 μmol/L的谷氨酸鹽作用于皮質(zhì)神經(jīng)元5 min即可造成大量損傷。在損傷的基礎(chǔ)上研究神經(jīng)元損傷的機(jī)制,或者探索減輕損傷的方法。
2.2.3 自由基過度形成 自由基過度形成主要采用過氧化氫、叔丁基過氧化氫、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)等模擬腦缺血和缺血再灌注產(chǎn)生的活性氧(超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等)所引起的氧化應(yīng)激損傷。模擬腦缺血時自由基過度形成的微環(huán)境,從而進(jìn)行抗自由基或神經(jīng)保護(hù)研究。
2.2.4 炎癥因子 對于體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞或腦組織,可給予脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化,從而產(chǎn)生多種炎癥效應(yīng):TNF-α等炎癥因子的釋放,激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶合成NO,下調(diào)谷胱甘肽的表達(dá)等,對揭示缺血性腦卒中的免疫機(jī)制有重要意義。
2.2.5 細(xì)胞內(nèi)鈣超載 鈣離子具有重要的功能,靜息狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為100 nmol/L,比細(xì)胞外鈣離子濃度低2萬倍,這種跨膜濃度梯度差由多種機(jī)制維持,包括細(xì)胞膜對鈣離子通透性的限制、主動排鈣機(jī)制及細(xì)胞內(nèi)鈣潴留等。各種損傷因素導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常增加,可比正常時高出100~200倍,稱為鈣超載。鈣超載后細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)功能障礙,激活鈣依賴性磷脂酶,釋放對細(xì)胞有毒性的物質(zhì);升高鈣調(diào)蛋白酶活性,導(dǎo)致細(xì)胞外鈣離子向細(xì)胞內(nèi)流動,引起細(xì)胞死亡。細(xì)胞鈣超載模型可用咖啡因、氯化鉀、NMDA等誘導(dǎo)。
目前在抗腦缺血的機(jī)制及藥物篩選研究中,雖然整體動物模型比較接近于腦缺血病理狀態(tài),但是由于實驗動物的個體差異較大,實驗人員在制備動物模型時的技術(shù)水平不同,對實驗結(jié)果容易造成影響。而且動物模型的制備有一定難度,損傷的均一性難以掌握,工作量大,周期長,花費(fèi)高。而利用細(xì)胞模型則可以克服動物模型的不足。而且可以根據(jù)腦缺血病理生理機(jī)制中的不同進(jìn)程,有選擇地從不同角度選用不同類型的細(xì)胞模型,對于研究缺血性卒中的發(fā)病機(jī)制及大規(guī)模篩選藥物有重要的意義。
1 Jeyaseelan K, Lim KY, Armugam A.Neuroprotectants in stroke therapy[J]. Expert Opin Pharmacother, 2008, 9:887-900.
2 Tuttolomondo A, Di Sciacca R, Di Raimondo D, et al. Neuron protection as a therapeutic target in acute ischemic stroke[J]. Curr Top Med Chem, 2009, 9:1317-1334.
3 Hazell AS. Excitotoxic mechanisms in stroke:an update of concepts and treatment strategies[J]. Neurochem Int, 2007, 50:941-953.
4 Bano D, Nicotera P. Ca2+signals and neuronal death in brain ischemia[J]. Stroke, 2007,38:674-676.
5 Allen CL, Bayraktutan U. Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke[J]. Int J Stroke, 2009, 4:461-470.
6 Grotta J. Lubeluzole treatment of acute ischemic stroke. The US and Canadian Lubeluzole Ischemic Stroke Study Group[J].Stroke, 1997, 28:2338-2346.
7 Dyker AG, Lees KR. Duration of neuroprotective treatmemt for ischemic stroke[J]. Stroke, 1998, 29:535-542.
8 Zivin JA. Factors determining therapeutic window for stroke[J]. Neurology, 1998, 50:599-603.
9 Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease[J]. Science, 1995,267:1456-1462.
10 Jacobson MD, Raff MC. Programmed cell death and Bcl-2 protection in very low oxygen[J].Nature, 1995, 374:814-816.
11 Shao W, Zhang SZ, Tang M, et al. Suppression of neuroinflammation by astrocytic dopamine D2 receptors via αB-crystallin[J]. Nature,2013, 494:90-94.
12 Zhao Y, Rempe DA. Targeting astrocytes for stroke therapy[J]. Neurotherapeutics, 2010,7:439-451.
13 Li Y, Liu Z, Xin H, et al. The role of astrocytes in mediating exogenous cell-based restorative therapy for stroke[J]. Glia, 2014,62:1-16.
14 Hines DJ, Haydon PG. Inhibition of a SNARE-sensitive pathway in astrocytes attenuates damage following stroke[J]. J Neurosci, 2013,33:4234-4240.
15 Jiang P, Chen C, Wang R, et al. hESC-derived Olig2+progenitors generate a subtype of astroglia with protective effects against ischaemic brain injury[J]. Nat Commun, 2013,4:2196.
16 Rajendran P, Rengarajan T, Thangavel J, et al. The vascular endothelium and human diseases[J]. Int J Bio Sci, 2013, 9:1057-1069.
17 Zhao YH, Yuan B, Chen J, et al. Endothelial progenitor cells:therapeutic perspective for ischemic stroke[J]. CNS Neurosci Ther, 2013,19:67-75.
18 Shah K, Abbruscato T. The role of blood-brain barrier transporters in pathophysiology and pharmacotherapy of stroke[J]. Curr Pharm Des,2014, 20:1510-1522.
19 Noraberg J, Poulsen FR, Blaabjerg M, et al.Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair[J]. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 2005, 4:435-452.
20 Lo EH, Dalkara T, Moskowitz MA. Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci, 2003, 4:399-414.
21 Pacifici M, Peruzzi F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells:a quick protocol[J]. J Vis Exp, 2012, 24:e3965.
22 McCarthy KD, de Vellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue[J]. J Cell Biol, 1980, 85:890-902.
23 Chen Z, Rubin J, Tzima E. Role of PECAM-1 in arteriogenesis and specification of preexisting collaterals[J]. Circ Res, 2010,107:1355-1363.
24 Sajja RK, Prasad S, Cucullo L. Impact of altered glycaemia on blood-brain barrier endothelium:an in vitro study using the hCME/D3 cell line[J]. Fluids Barriers CNS, 2014,11:8.
25 Adamchik Y, Frantseva MV, Weisspapir M, et al. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures[J]. Brain Res Brain Res Protoc,2000, 5:153-158.
26 Xue Q, Liu Y, Qi H, et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons,astrocytes and microvascular endothelial cells of rat[J]. Int J Bio Sci, 2013, 9:174-189.
【點(diǎn)睛】
缺血性卒中體外模型對于研究發(fā)病機(jī)制,篩選神經(jīng)保護(hù)藥物,探討治療方案具有重要意義。