張艷 李倩倩 霍薇

血管性癡呆動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀

張艷 李倩倩 霍薇

血管性癡呆(vascular dementia，VD)指各種腦血管病引起的獲得性認(rèn)知障礙，它是癡呆的重要類型，已經(jīng)越來越引起重視。VD相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在研究中廣泛應(yīng)用，包括短暫性全腦缺血模型、永久性全腦缺血模型、局灶性腦缺血模型和腦小血管病模型。本文將這些模型的制備方法、腦組織的病理學(xué)變化和認(rèn)知功能損害的特點(diǎn)等進(jìn)行綜述，期望對(duì)臨床和實(shí)驗(yàn)研究有所幫助。

血管性癡呆；動(dòng)物模型

血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment，VCI)是指大腦任何血管因素引起的認(rèn)知功能障礙，主要包括非癡呆性血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment no dementia，VCIND)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)和混合型癡呆等，它可以單獨(dú)發(fā)生或與Alzheimer病合并出現(xiàn)。為深入研究VCI/VD的發(fā)病機(jī)制、病理學(xué)改變、認(rèn)知功能損害的特點(diǎn)和治療措施等，研究者已經(jīng)建立了多種模擬人類疾病特征的動(dòng)物模型。本文將對(duì)這些動(dòng)物模型的制備方法、腦組織的病理學(xué)變化和認(rèn)知功能損害的特點(diǎn)等進(jìn)行綜述，期望對(duì)VCI/VD的研究有所幫助。

1 短暫性全腦缺血模型

短暫性全腦缺血模型是通過可逆性、短暫性夾閉相應(yīng)腦血管，或結(jié)合動(dòng)脈放血造成低血壓等方法，制備的全腦缺血模型。該模型對(duì)于慢性腦缺血、VD和相關(guān)藥物治療等的研究具有實(shí)際意義。其缺點(diǎn)在于操作方法對(duì)動(dòng)物全身狀態(tài)影響較大，梗死部位不固定。

1.1 四血管法(four vessels occlusion，4-VO) 四血管法為目前國際公認(rèn)的VD模型制備方法，也可用于神經(jīng)保護(hù)藥物的研究。操作方法：首先分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈備用，然后電凝或結(jié)扎雙側(cè)椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)需要短暫地阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并于一定時(shí)間后開放而實(shí)現(xiàn)血流再灌注。該方法常用動(dòng)物為大鼠，也可為猴和兔等。Chung等[1]發(fā)現(xiàn)給予大鼠反復(fù)兩次腦缺血再灌注，每次缺血持續(xù)10 min，間隔期為1 h，在術(shù)后第7天，經(jīng)八臂迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到大鼠的空間工作記憶受損，表現(xiàn)為大鼠對(duì)食物在迷宮中的空間位置記憶錯(cuò)誤，正確找到食物的次數(shù)減少，而錯(cuò)誤頻率增加。病理學(xué)檢查見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡，皮層和丘腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。而且海馬和皮層的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)釋放量顯著減少，ACh水平降低。經(jīng)過反復(fù)3次的腦缺血再灌注后，應(yīng)用八臂迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除了導(dǎo)致大鼠前述的顯著的空間記憶損害外，一些大鼠還會(huì)有運(yùn)動(dòng)功能障礙[1]。

1.2 三血管法(three vessels occlusion，3-VO) 操作方法：先分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈備用，結(jié)扎基底動(dòng)脈，然后用動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈，形成3條動(dòng)脈阻斷的全腦缺血模型。一定時(shí)間后，解除雙側(cè)頸總動(dòng)脈的夾閉，血流再通即形成再灌注。常用動(dòng)物為大鼠。此法可通過阻斷頸總動(dòng)脈的時(shí)間長(zhǎng)短來控制腦缺血程度。Horeck等[2]通過Morris水迷宮檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3-VO模型造成大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的損害，與二血管法(two vessels occlusion，2-VO)的研究結(jié)果相似。因?yàn)?-VO模型鼠術(shù)后急性腦缺血比較嚴(yán)重，采用3-VO模型可以盡量降低急性腦缺血程度，減少對(duì)慢性腦缺血病理生理過程的干擾。

1.3 2-VO 操作方法：分離并夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，使血流阻斷5 min，同時(shí)從尾尖部放血(不超過1 mL/100 g體質(zhì)量)，然后使血流復(fù)通。C57BL/6小鼠的后交通動(dòng)脈發(fā)育不良，Yamamoto等[3]發(fā)現(xiàn)，采用2-VO法短暫(5 min)阻斷血流，術(shù)后第7天通過被動(dòng)逃避實(shí)驗(yàn)和Y迷宮檢測(cè)，可觀察到小鼠的學(xué)習(xí)功能受損，海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用受到抑制。2-VO(20 min)可導(dǎo)致海馬CA1區(qū)廣泛的神經(jīng)元死亡。Walker等[4]發(fā)現(xiàn)2-VO方法還會(huì)導(dǎo)致腦白質(zhì)損害，該作者對(duì)小鼠全腦缺血再灌注后3 d，在缺血的胼胝體和尾狀核的白質(zhì)纖維束，可見星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，金屬基質(zhì)蛋白酶2(MMP-2)的表達(dá)和活性增加，并出現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡和髓鞘堿性蛋白缺失。

2 永久性全腦缺血模型

永久性全腦缺血模型是通過永久性結(jié)扎相應(yīng)腦血管而制備的全腦缺血模型，根據(jù)操作方法分為4-VO、3-VO、2-VO和雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄模型等。其中2-VO是研究VD的較好動(dòng)物模型。永久性全腦缺血模型的缺點(diǎn)是全腦缺血模型影響全身其他器官的功能，與由單一腦動(dòng)脈閉塞所致的VD亞型不同。

2.1 4-VO Pulsinelli 等[5]通過阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈及椎動(dòng)脈血流成功建立了四血管閉塞法大鼠全腦缺血模型。操作方法：頸前正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，將無損動(dòng)脈夾輕放于雙側(cè)動(dòng)脈周圍；同時(shí)枕部切口暴露第一頸椎翼小孔，電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。24 h后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成明顯的腦缺血。Pulsinelli等四血管法大鼠全腦缺血模型被廣泛采用,但也存在著易出血、椎動(dòng)脈不易阻斷、操作中呼吸抑制等缺點(diǎn)。為提高模型的可靠性，許多學(xué)者對(duì)Pulsinelli等四血管法模型做了改良。Barros等[6]通過先結(jié)扎雙側(cè)椎動(dòng)脈，間隔1周后再次結(jié)扎雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，制備慢性腦低灌流的4-VO模型。在術(shù)后第40天，通過被動(dòng)逃避實(shí)驗(yàn)和Y迷宮檢測(cè)，16月齡大鼠表現(xiàn)為輕度學(xué)習(xí)功能受損；其中部分大鼠出現(xiàn)皮質(zhì)神經(jīng)元缺血性壞死。

2.3 2-VO Farkas等[9]通過夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，合并低血壓以減少腦血流量，造成急性腦缺血。嚙齒動(dòng)物(沙土鼠除外)腦血液循環(huán)有豐富的側(cè)支循環(huán)，僅結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈不足以明顯降低腦血流量，通過一些改良，如頸部軟組織加壓，或通過剪尾放血、腹腔注射硝普鈉和頸總靜脈處置管抽血等方法降低血壓，增加模型的可靠性。于術(shù)后第7天左右，通過Morris水迷宮試驗(yàn)可觀察到學(xué)習(xí)和記憶功能受損，大約術(shù)后8周經(jīng)八臂迷宮實(shí)驗(yàn)也可檢測(cè)到空間工作記憶受損。2-VO模型動(dòng)物認(rèn)知功能的損害主要是由腦白質(zhì)病變引起的，包括脫髓鞘、髓鞘堿性蛋白的缺失和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化等。一般從術(shù)后4周開始，海馬CA1區(qū)會(huì)出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞密度增加和神經(jīng)元的缺失[9]。血管病變于術(shù)后12個(gè)月出現(xiàn)，表現(xiàn)為毛細(xì)血管壁的管壁增厚和纖維化[10]。

2.4 雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄模型 有研究者應(yīng)用線圈縮窄雙側(cè)頸總動(dòng)脈，制備沙土鼠永久性全腦缺血模型[11]。在術(shù)后6周，通過被動(dòng)逃避實(shí)驗(yàn)可觀察到模型動(dòng)物的記憶損害。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后1周在海馬、基底節(jié)和大腦皮質(zhì)存在局灶性神經(jīng)元缺失(直徑約1 mm)，并伴有膠質(zhì)增生；在術(shù)后8周，出現(xiàn)彌漫性白質(zhì)損害，其特征為白質(zhì)稀疏，不伴有局部缺血改變的膠質(zhì)增生，髓鞘堿性蛋白和軸索纖維減少。Nishio等[12]使用彈簧圈縮窄小鼠的雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成永久性腦低灌注。由于該小鼠額葉-皮質(zhì)下環(huán)路受損，不伴有明顯的灰質(zhì)改變，表現(xiàn)為工作記憶障礙，類似于皮質(zhì)下VD。參考記憶和工作記憶的損害出現(xiàn)于術(shù)后5～6個(gè)月。在術(shù)后8個(gè)月，組織學(xué)分析可見海馬萎縮，有細(xì)胞皺縮和凋亡。Miki等[13]選擇C57BL/6小鼠外置彈簧圈制備雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄模型，在輕度腦低灌注組(腦血流量降低至術(shù)前的30%～50%)，小鼠表現(xiàn)為快速移動(dòng)行為和空間參考記憶障礙。在術(shù)后5周，組織學(xué)分析可見腦白質(zhì)疏松，并有小壞死灶，伴隨反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)、軸突缺失和髓鞘崩解，在左側(cè)大腦半球病變更為明顯。

3 局灶性腦缺血模型

局灶性腦缺血模型模擬了人類永久性腦梗死的病理生理過程，梗死灶固定，重復(fù)性好，對(duì)于VD的研究具有重要意義。其缺點(diǎn)是該模型在梗死部位、梗死體積和病變嚴(yán)重程度等方面均與人類腦卒中存在差異，且動(dòng)物術(shù)后可能出現(xiàn)嚴(yán)重偏癱癥狀，從而影響行為學(xué)的檢測(cè)。

3.1 線栓法 1986年Koizumi等首次報(bào)道了不用開顱的大鼠大腦中動(dòng)脈可逆性阻斷模型的制備方法，即大腦中動(dòng)脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)。操作方法：分離一側(cè)頸總動(dòng)脈，由頸外動(dòng)脈殘端插入一頂端粘有硅橡膠的尼龍單絲線，至頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)分叉部時(shí)可阻斷流入大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery，MCA)的血流。1989年Zea-Longa等以頂端燙成光滑圓球的4-0尼龍單絲線，由頸總動(dòng)脈分叉處切口導(dǎo)入，也制成相似的模型。在大鼠和小鼠，單側(cè)的MCAO模型可以產(chǎn)生局灶性缺血灶，受累區(qū)域包括皮質(zhì)、尾狀核和皮質(zhì)下白質(zhì)，引起對(duì)側(cè)的運(yùn)動(dòng)感覺功能障礙。Roof等[14]發(fā)現(xiàn)在永久性大鼠MCAO模型，當(dāng)阻塞部位在MCA近端時(shí)，損害紋狀體和皮質(zhì)，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶功能受累，定位航行實(shí)驗(yàn)異常，肢體放置反應(yīng)和姿勢(shì)反射均受累。MCA遠(yuǎn)端阻塞的大鼠，僅導(dǎo)致皮質(zhì)損害，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)感覺功能障礙，2周后基本恢復(fù)，定位航行實(shí)驗(yàn)正常。小鼠MCAO模型表現(xiàn)出的認(rèn)知功能改變差異很大，主要是與性別、種屬和缺血的持續(xù)時(shí)間有關(guān)。Bou?t等[15]利用瑞士小鼠制備MCAO模型(短暫性缺血30 min)，發(fā)現(xiàn)小鼠在術(shù)后1個(gè)月存在運(yùn)動(dòng)感覺功能障礙，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常，但是被動(dòng)逃避實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出學(xué)習(xí)能力障礙，主要是由于皮質(zhì)和紋狀體受累導(dǎo)致。

3.2 內(nèi)皮素注射法 腦內(nèi)立體定向注射內(nèi)皮素-1，利用其血管收縮作用，可逆性阻斷MCA的血流，誘發(fā)短暫性、局灶性腦缺血，形成局灶性腦梗死。單側(cè)紋狀體注射內(nèi)皮素的動(dòng)物，在2周時(shí)出現(xiàn)前肢不對(duì)稱和運(yùn)動(dòng)功能受損[16]。目前對(duì)該模型還沒有認(rèn)知功能檢測(cè)的數(shù)據(jù)。

3.3 栓塞法 采用<200 μm的同種大鼠(家兔或猴)血凝塊栓子懸液，由頸外動(dòng)脈注入栓子后將頸外動(dòng)脈結(jié)扎，開放頸總動(dòng)脈，使栓子自頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)的各動(dòng)脈，造成多處小梗死灶(直徑約1 mm)或較大的區(qū)域性梗死。栓子來源也可以是懸浮的膽固醇結(jié)晶、塑料微?；颦傊俏⒘５?。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力受損[17]。

通過血管內(nèi)注射光化學(xué)誘導(dǎo)劑，然后用特定冷光源照射頭顱局部，激發(fā)光化學(xué)反應(yīng)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞，血管內(nèi)血栓形成，進(jìn)而形成血栓-栓塞過程，導(dǎo)致腦梗死。術(shù)后第2天，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)可觀察到學(xué)習(xí)能力受損，經(jīng)過大約5周時(shí)間可能恢復(fù)正常。病變主要在大腦皮質(zhì)，也可累及海馬、基底節(jié)和皮質(zhì)下白質(zhì)[18]。

3.4 高血壓病動(dòng)物模型 自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat)是具有持久性血壓升高的大鼠品系，自發(fā)性高血壓腦卒中傾向大鼠(stroke-prone spontaneously hypertensive rat)是其中一個(gè)重要亞系。在自發(fā)性高血壓腦卒中傾向大鼠亞系中，隨鼠齡增加血壓逐漸升高，并且出現(xiàn)腦萎縮、神經(jīng)元缺失和膠質(zhì)增生，與人類高血壓所導(dǎo)致的腦損害類似。在自發(fā)性高血壓大鼠的大腦皮質(zhì)和基底節(jié)區(qū)，還能夠觀察到大小不等的出血病灶。自發(fā)性高血壓大鼠伴有膽堿能系統(tǒng)傳遞功能障礙，還表現(xiàn)為多巴胺能神經(jīng)元功能減低和去甲腎上腺素能功能亢進(jìn)，類似于注意缺陷-多動(dòng)障礙的疾病特征。通過被動(dòng)逃避實(shí)驗(yàn)和Y迷宮檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該模型鼠存在學(xué)習(xí)和記憶功能障礙[19]。

通過外科手術(shù)縮窄胸主動(dòng)脈制備獼猴慢性高血壓模型[20]。在術(shù)后12個(gè)月，獼猴開始出現(xiàn)認(rèn)知功能減退，表現(xiàn)為短期記憶損害，注意力和執(zhí)行功能障礙。認(rèn)知功能障礙的嚴(yán)重程度與收縮壓和舒張壓的水平相關(guān)。腦內(nèi)病變主要是形狀不規(guī)則的小梗死灶(直徑<500 μm)，伴有膠質(zhì)增生，病灶散在于大腦皮質(zhì)的灰質(zhì)和白質(zhì)、腦干和小腦，在前腦的白質(zhì)區(qū)尤為明顯。

4 腦小血管病(cerebral small vessel diseases，CSVD)的動(dòng)物模型

CSVD發(fā)病率日益增加，約占腦卒中的25%。其臨床表現(xiàn)主要是卒中(深部小梗死、腦出血)，認(rèn)知和情感障礙，錐體外系癥狀、步態(tài)和排尿異常等，是導(dǎo)致VCI/VD的主要原因之一。為了研究高同型半胱氨酸[21]、Notch3基因突變[22]、M5R基因突變、糖尿病、腦淀粉樣血管病和老齡(如大鼠鼠齡≥12個(gè)月)等單一因素對(duì)腦血管結(jié)構(gòu)和功能的影響，以及在CSVD發(fā)病機(jī)制中的作用，研究者們復(fù)制了相應(yīng)的各類動(dòng)物模型，如高同型半胱氨酸血癥模型、CADASIL模型(Notch3轉(zhuǎn)基因鼠)、M5R-/-轉(zhuǎn)基因鼠、糖尿病大鼠和小鼠、腦淀粉樣血管病動(dòng)物模型和衰老動(dòng)物模型等，模擬了這些致病因素對(duì)人類疾病的影響。雖然沒有一種模型可以涵蓋人類CSVD的所有特征，但可以根據(jù)研究的內(nèi)容合理選擇有效的動(dòng)物模型，為深入研究CSVD提供了可行的方法。

總之，選擇合適的動(dòng)物模型是進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究的前提，由于臨床研究的種種限制，動(dòng)物模型已成為研究VD發(fā)病機(jī)制、病理學(xué)改變、認(rèn)知功能損害特點(diǎn)和防治措施等的有效工具。VCI概念的范疇包括了VCIND、VD和混合型癡呆，目前還沒有一種最適宜的VCI動(dòng)物模型。從前述內(nèi)容可見，制備方法不同的VD動(dòng)物模型，病理組織學(xué)改變和認(rèn)知功能損害程度也有所不同，研究者應(yīng)該針對(duì)VCI的亞型和研究目標(biāo)做出相應(yīng)的選擇。

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(本文編輯：鄒晨雙)

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.016

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12521255)

150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

張艷，Email：zhangyanhyd@hotmail.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)01-0067-04

2014-04-15)