楊敏， 李林瑞， 黃建寶， 孟燕妮， 陳艷萍

臨床論著

支氣管肺泡灌洗液中β-聯(lián)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β1、Clara細胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡細胞表面抗原6在支氣管肺發(fā)育不良中的表達及意義

楊敏， 李林瑞， 黃建寶， 孟燕妮， 陳艷萍

目的 探討β-聯(lián)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Clara細胞分泌蛋白16(cc16)、Ⅱ型肺泡細胞表面抗原6(KL-6)在支氣管肺發(fā)育不良(BPD)患兒支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的表達及其意義。方法 機械通氣早產(chǎn)兒70例，其中40例診斷為BPD的患兒作為觀察組，30例非BPD患兒作為對照組。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測兩組患兒機械通氣1、24、48、72 h BALF中β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平。結(jié)果 觀察組平均胎齡及出生體質(zhì)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，吸氧時間及機械通氣時間顯著長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨機械通氣時間的延長，觀察組cc16水平呈逐漸降低趨勢，而β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐漸升高趨勢，且48、72 h時均與1 h時各指標(biāo)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。對照組TGF-β1、cc16于機械通氣72 h時與1 h時水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而β-聯(lián)蛋白、KL-6水平在各時間點的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。觀察組機械通氣各時間點β-聯(lián)蛋白、TGF-β1水平均顯著高于對照組各相應(yīng)時間點指標(biāo)水平,cc16顯著低于對照組水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而KL-6在機械通氣48、72 h時高于對照組相應(yīng)時間點，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，余時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各時間點比較，BPD中重度組β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、KL-6水平均顯著高于輕度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而cc16水平顯著低于輕度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。多元逐步回歸分析結(jié)果顯示，機械通氣時間、吸氧時間的延長及低cc16水平是BPD發(fā)生的危險因素(P<0.01)。結(jié)論 機械通氣早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生與機械通氣、吸氧時間的延長及低cc16水平密切相關(guān)，通過監(jiān)測早產(chǎn)兒初始機械通氣BALF中β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16水平可對早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生提供預(yù)測依據(jù)。

支氣管肺發(fā)育不良； β-聯(lián)蛋白； 轉(zhuǎn)化生長因子β1； Clara細胞分泌蛋白16； Ⅱ型肺泡細胞表面抗原6； 嬰兒，新生

早產(chǎn)兒多因急性呼吸窘迫需進行機械通氣和氧療，而隨著機械通氣和氧療時間的延長往往易導(dǎo)致患兒肺損傷和支氣管肺發(fā)育不良(bronchial pulmonary dysplasia，BPD)[1-2]。目前，BPD的病因及發(fā)病機制尚未闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-聯(lián)蛋白信號通路、Ⅱ型肺泡細胞表面抗原6(Krebs Von den Lungen-6,KL-6)、Clara細胞分泌蛋白16(Clara cell secretory protein16, cc16)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)可能參與了肺組織損傷再修復(fù)、上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程[3]。因此，本研究動態(tài)監(jiān)測機械通氣BPD患兒支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平，并與非BPD患兒比較，旨在探討其動態(tài)變化在BPD中的作用,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012-01/2013-12在湖南省兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)二科住院行機械通氣的早產(chǎn)兒70例，經(jīng)陰道分娩24例，剖宮產(chǎn)46例。所有病例在產(chǎn)前均應(yīng)用能量合劑、地塞米松治療，促進胎兒生長及胎肺成熟。新生兒出生時由新生兒科和麻醉科醫(yī)師在場，即刻進行Apger評分，胎齡評分及氣管插管等急救措施。其中40例診斷為BPD的患兒作為觀察組，其中男27例，女13例；經(jīng)陰道分娩13例，剖宮產(chǎn)27例；肺透明膜病者19例，反復(fù)呼吸暫停者10例，新生兒肺炎者7例，窒息者4例；40例BPD患兒中輕度23例，中重度17例。另外30例非BPD患兒作為對照組，其中男21例，女9例；經(jīng)陰道分娩11例，剖宮產(chǎn)19例；肺透明膜病者9例，反復(fù)呼吸暫停者9例，反復(fù)肺部感染者6例，窒息者6例。兩組患兒在性別、分娩方式、疾病類型、窒息情況、感染情況方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) BPD患兒均符合2001年美國國家兒童保健及人類發(fā)展研究院(NICHD)和心臟、肺及血液研究院(NHLBI)及罕見病委員會聯(lián)合發(fā)布的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。輕度BPD指出生后28 d需要氧療，但糾正胎齡36周(或出生后56 d)不需要氧療；中重度BPD指出生后28 d需要氧療，糾正胎齡36周(或出生后56 d)仍然需要氧療。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)進行機械通氣的早產(chǎn)兒；(2)患兒家長同意并簽署知情同意書，并通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 因嚴重肺部感染、窒息等搶救無效死亡者。

1.5 治療方法 兩組患兒均給予氣管插管，并給予美國Infant Star 950型呼吸機進行機械通氣。機械通氣指征包括：存在呼吸窘迫綜合征Ⅲ～Ⅳ級，或經(jīng)吸氧治療不能糾正的Ⅰ型或Ⅱ型呼吸衰竭，反復(fù)呼吸暫停等情況。根據(jù)患兒動脈血氣情況動態(tài)調(diào)整呼吸機參數(shù)，維持目標(biāo)：血氧飽和度≥0.85，pH值7.30～7.45，動脈血氧分壓≥6.67 kPa，3.6 kPa≤動脈血二氧化碳分壓≤5.5 kPa。若患兒原發(fā)疾病治愈或基本控制，全身情況良好，吸氣峰壓<0.196 kPa，通氣頻率降至10次/分，吸入氧濃度不超過40%，血氣分析顯示正常則可撤機。

1.6 指標(biāo)檢測 (1)BALF的收集：分別于通氣后1、24、48、72 h將生理鹽水溫?zé)岷笱鼗純簹夤懿骞艿稳?，每次約1 mL/kg，同時給予呼吸機給氧3～5次，迅速插入吸痰管直至碰到阻力，采用<6 kPa的負壓吸引，在吸引同時退出吸痰管，整個操作需迅速完成，共進行2次操作，混合2次吸引的BALF，并記錄體積，紗布濾過黏液后4 ℃離心15 min，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。整個操作均需嚴格無菌操作，并保持回路通暢，灌洗液溫度適宜且操作精準(zhǔn)。(2)相關(guān)指標(biāo)檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測兩組患兒1、24、48、72 h不同時段BALF中β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒一般資料比較 觀察組平均胎齡及出生體質(zhì)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；觀察組患兒吸氧時間及機械通氣時間顯著長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

注：與對照組比較，at=2.54，2.33，P<0.05；bt=11.20，13.46，P<0.01。

2.2 兩組患兒相關(guān)指標(biāo)比較 見表2。

注：與對照組相同時間點相比較，at=2.53，2.67，7.20，13.52,2.96，3.17，9.54，15.61,2.63，2.76，3.99，12.52,9.56，13.67，P<0.05；與本組1 h比較，bt=9.22,P<0.05，ct=5.12，11.22，7.86，13.22，2.76，5.83，17.64,P<0.01。

表2結(jié)果表明，隨機械通氣時間的延長，觀察組cc16水平呈逐漸降低趨勢，而β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐漸升高趨勢，且48、72 h時均與1 h時各指標(biāo)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。對照組TGF-β1、cc16于機械通氣72 h時與1 h時水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而β-聯(lián)蛋白、KL-6水平在各時間點間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。觀察組機械通氣各時間點β-聯(lián)蛋白、TGF-β1水平均顯著高于對照組各相應(yīng)時間點指標(biāo)水平,cc16顯著低于對照組(P<0.05)，而KL-6在機械通氣48、72 h時高于對照組相應(yīng)時間點(P<0.05)，余時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 輕度、中重度BPD患兒機械通氣后不同時間點β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平的比較 見表3。

注：與輕度組相同時間點相比較，at=2.61，2.93，5.29，11.63，2.76，5.28，7.19，13.58，2.71，2.96，5.17，9.83，5.93，7.28，9.15，12.8,P<0.05。

表3結(jié)果表明，隨機械通氣時間的延長，輕度組及中重度組cc16水平均呈逐漸降低趨勢，β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐漸升高趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.61、23.52、21.63、21.67，P<0.01)。各時間點比較，中重度組β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、KL-6水平均顯著高于輕度組，而cc16水平顯著低于輕度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 BPD發(fā)生的多元回歸分析 將患兒的胎齡、出生體質(zhì)量、機械通氣時間、吸氧時間及機械通氣1 h時β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平進行多元逐步回歸分析，結(jié)果顯示，機械通氣時間、吸氧時間的延長及低cc16水平是BPD發(fā)生的危險因素(P<0.01)。見表3。

3 討論

KL-6屬Cluster 9的MUC-1類糖蛋白，主要由增殖或受損的AT-Ⅱ分泌，可以成為間接判斷肺上皮損傷程度及再生的指標(biāo)[5]。Clara水平細胞分布于終末細支氣管和呼吸性細支氣管上皮的非纖毛細胞，因此肺上皮襯液、BALF、血漿中cc16可作為反映Clara細胞及肺泡毛細血管膜完整性早期改變的敏感性指標(biāo)[6]。有研究稱在機械通氣造成的炎性反應(yīng)性肺損傷時，β-聯(lián)蛋白過度表達，可進一步促進細胞周期蛋白D1轉(zhuǎn)錄，有助于創(chuàng)面的修復(fù)。而TGF-β1可促進細胞外基質(zhì)形成，抑制酶解作用，促進新生血管的形成，趨化成纖維細胞，最終起到促纖維化的作用。研究發(fā)現(xiàn)，肺發(fā)育不良患者TGF-β1可發(fā)生過度表達，其可能通過直接抑制支氣管上皮細胞的分化過程及影響肺表面活性蛋白的表達，導(dǎo)致肺囊泡數(shù)目形成減少而發(fā)揮作用[7]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路活化在整個鼠胚胎的發(fā)育過程發(fā)揮重要作用，β-聯(lián)蛋白可表達于未分化的原始上皮、分化的肺泡上皮及相鄰間質(zhì)細胞等多種細胞的細胞質(zhì)和細胞核，在肺發(fā)育過程中至關(guān)重要[6]。同時，低cc16水平也被認為是評估早產(chǎn)兒肺發(fā)育不良的重要標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，觀察組BPD患兒機械通氣后1 h BALF中β-聯(lián)蛋白、TGF-β1明顯高于對照組，cc16水平明顯低于對照組，說明上述因子可能在BPD的發(fā)生及肺的發(fā)育成熟中起重要作用。因此通過監(jiān)測早產(chǎn)兒初始機械通氣BALF中β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16水平可對早產(chǎn)兒的肺發(fā)育程度及BPD的發(fā)生風(fēng)險提供評估依據(jù)。

本研究結(jié)果還顯示，觀察組的吸氧時間及機械通氣時間顯著長于對照組，說明早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生可能與吸氧及機械通氣時間的延長有關(guān)。進一步回歸分析示，機械通氣時間、吸氧時間的延長及低cc16水平是BPD發(fā)生的危險因素。說明機械通氣及吸氧本身可作為肺功能障礙的治療措施，同時又是早產(chǎn)兒BPD發(fā)生的危險因素。由于早產(chǎn)兒肺發(fā)育尚未成熟，持續(xù)的機械通氣可導(dǎo)致和增加肺部感染的概率及氣道黏膜炎癥，導(dǎo)致氣道阻力及呼吸負荷增加，從而影響肺的發(fā)育，出現(xiàn)呼吸機依賴或撤機時間延長，最終導(dǎo)致早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生。同時在機械通氣狀態(tài)下，肺組織可持續(xù)處于高氧狀態(tài)，導(dǎo)致大量超氧化物和過氧化氫的產(chǎn)生，導(dǎo)致機體產(chǎn)生嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但機體的抗氧化系統(tǒng)一般在妊娠最后3個月發(fā)育成熟，早產(chǎn)兒的抗氧化系統(tǒng)尚未成熟，極易受到自由基的損傷，因此在持續(xù)機械通氣下出現(xiàn)氣道上皮細胞大量死亡，肺泡數(shù)目減少，結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)纖維化，最終發(fā)生BPD。

本研究結(jié)果顯示，隨時間延長，觀察組cc16水平呈逐漸降低趨勢，而β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐漸升高趨勢，提示觀察組患兒在機械通氣48 h后即可能開始出現(xiàn)肺損傷，而對照組在72 h后可能出現(xiàn)輕微的肺損傷。因此機械通氣是導(dǎo)致KL-6、β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16水平變化及BPD發(fā)生的重要因素。進一步比較不同BPD分級各指標(biāo)水平，結(jié)果顯示在各時間點比較，中重度組β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、KL-6水平均顯著高于輕度組，而cc16水平顯著低于輕度組。說明各指標(biāo)水平的變化可在一定程度上反映BPD分級。因此通過動態(tài)監(jiān)測機械通氣患兒BALF中KL-6、β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16水平可對肺損傷的發(fā)生及程度進行預(yù)測及評估，盡早采取保護措施，盡可能減少BPD的發(fā)生。

綜上所述，β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16在早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生機制中有重要作用，而KL-6可反映肺上皮的損傷程度。通過監(jiān)測早產(chǎn)兒初始機械通氣BALF中β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16水平可對早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生提供預(yù)測依據(jù)。然而本文未對β-聯(lián)蛋白、TGF-β1、cc16水平與BPD分度的關(guān)系進行探討，有待進一步研究。

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(本文編輯：劉穎)

The expression and significance of β-Catenin，transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1), Clara cell secretory protein 16(cc16) and surface antigen 6 of alveolar epithelial cell Ⅱ(KL-6) in bronchialveolar lavage fluid(BALF) of children with bronchial pulmonary dysplasia(BPD)

YANGMin，LILinrui，HUANGJianbao，MENGYanni，CHENYanping.

TheSecondDepartmentofRespirationofHunanProvinceChildren'sHospital，Changsha410011，China.

Objective To investigate the expression of β-Catenin，transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1), Clara cell secretory protein 16 (cc16), and surface antigen 6 of alveolar epithelial cell Ⅱ(KL-6) in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of children with bronchial pulmonary dysplasia(BPD) and its significance.Method Of 70 cases of premature infants with mechanical ventilation, 40 cases diagnosed with BPD were included in observation group, 30 cases of non-BPD patients were as control group. Detect the levels of β-Catenin, TGF-beta 1, cc16 and KL-6 in BALF of two groups of children respectively after 1, 24, 48 and 72 h of mechanical ventilation using enzyme-linked immunosorbent assay method. Result Average gestational age and birth body mass of observation group were significantly lower than those of the control group, the difference being statistically significant (P<0.05).The time of mechanical ventilation and oxygen therapy were significantly longer than the control group, the difference being statistically significant(P<0.01). With longer duration of mechanical ventilation, the levels of cc16 of observation group showed a downward trend, and β-Catenin, TGF-beta 1 and KL-6 levels showed an upward trend, and the level difference of each index in time point of 48 and 72 h was statistically significant compared with that of 1 h(P<0.01). The difference of the level of TGF-beta 1 and cc16 of control group at time point 1 h and 72 h of mechanical ventilation was statistically significant (P<0.01), but the differences of level of beta protein and KL-6 at various time points had no statistical significance (P>0.05). Index levels of β-Catenin and TGF-beta 1 of observation group with mechanical ventilation at each time point were significantly higher than control group in the corresponding time point, but cc16 was significantly lower than the control group, the difference being statistically significant (P<0.05), while the KL-6 of observation group was higher than the control group in the corresponding time point of 48 and 72 h, the difference being statistically significant(P<0.05).There was no statistically significant difference at other time points(P>0.05). Comparing each time point,β-catenin, TGF-β1and KL-6 levels in the moderate and severe BPD group were significantly higher than mild group (P<0.05), but cc16 level was significantly lower than mild group (P<0.05). Multiple stepwise regression analysis results showed that the longer duration of mechanical ventilation time and oxygen and the low cc16 levels are a risk factor for the occurrence of BPD(P<0.01).Conclusion The occurrence of premature BPD is closely related to longer duration of mechanical ventilation and oxygen and low cc16 levels. Monitoring the level of β-Catenin, TGF-beta 1 and cc16 of BALF of premature infants in initial mechanical ventilation can provide the basis for predicting the occurrence of premature BPD and its classification.

bronchial pulmonary dysplasia； β-Catenin； transforming growth factor beta 1； Clara cell secretory protein 16； Krebs Von den Lungen-6； infant，newborn

湖南省科技計劃項目(2012SK3256)

410011 長沙，湖南省兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)二科

楊敏(1982-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。研究方向：小兒呼吸系統(tǒng)疾病的臨床診治。

陳艷萍，410011 長沙，湖南省兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)二科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.03.008

R563.1+2

A

1674-3865(2015)03-0219-05

2015-04-10)