史娉娉(綜述)朱雨嵐(審校)

癲癇間是多種原因導致的腦部神經元高度同步化異常放電所致的臨床綜合征，癲癇間是一種慢性疾病，可遷延數年、數十年乃至整個生命過程，因而對患者身體、精神、婚姻以及社會經濟地位等造成嚴重的不良影響。據統(tǒng)計，我國目前約有900萬以上的癲癇間患者，每年新發(fā)的癲癇間患者65～70萬，其死亡率為1.3～3.6/10萬。目前針對癲癇間的發(fā)病機制仍不十分清楚，雖有一些新的癲癇間藥物的問世，但癲癇間的治療仍然很困難，相關研究一直是本領域的熱點，因此建立癲癇間模型并以此來研究癲癇的發(fā)病機制及篩選合適的藥物治療顯得尤為重要。癲癇間模型包括動物體內模型和離體模型。自從1883年Openchowski等人首次使用將腦部組織冷凍的方式建立癲癇間動物以來，目前已有數種動物模型應用于癲癇間的研究，絕大多數有關癲癇間發(fā)生的理論機制都是直接或間接地通過癲癇間動物模型來研究獲得。癲癇間的動物體內模型包括急性癲癇間模型、慢性癲癇間模型、遺傳性模型和癲癇間抵抗性模型。由于動物癲癇間發(fā)作的多樣性以及藥物療效的不穩(wěn)定性，越來越多的學者致力于研究離體模型。離體模型包括細胞模型和腦片模型，主要用于抗癲癇間藥物的篩選，還能有效地探討抗癲癇間藥物的作用機制及量效關系。

1 離體癲癇間模型的發(fā)展

1907年Harrison首次通過改良懸滴培養(yǎng)法進行神經細胞培養(yǎng)后，自此人們開始了體外培養(yǎng)技術對神經領域的探索。1991年Stoppini等首次使用Millicell-CM微孔膜對離體培養(yǎng)的海馬腦片進行神經電生理研究［1］，使器官型腦片的體外培養(yǎng)技術在神經基礎研究領域得以推廣。腦片是目前認為最適合用于研究癲癇間的模型。1995年Sombati等利用無鎂細胞外液處理培養(yǎng)的海馬神經元誘導產生反復自發(fā)性驚厥樣放電，該模型可作為臨床耐藥性癲癇間模型［2～3］。目前離體模型根據致癇間方法的不同，又可分為物理模型及化學模型，根據致癇間機制可分為去抑制模型和誘導模型。

2 離體模型的種類

2.1 按取材不同分類

2.1.1 細胞模型細胞模型一般選用出生24h內的乳鼠，使用其大腦皮層細胞和海馬神經元作為研究的基礎。比較成熟的癲癇間模型有谷氨酸興奮性模型等。

2.1.2 腦片模型

海馬腦片常用動物有豚鼠、大鼠及小鼠等。其模型有低鎂液模型、4-氨基吡啶興奮性模型等。有文獻報道用低鎂的人工腦脊液灌注海馬及內嗅區(qū)切片，興奮NMDA受體，引起鈣離子通道開放，形成興奮性突觸后電位，可顯示三種癲癇間樣放電:(1)海馬反復短時程放電;(2)內嗅區(qū)癲癇間樣放電;(3)內嗅區(qū)遲發(fā)性重復放電。而且這個用低鎂的人工腦脊液處理得到的癲癇間模型的異常放電能被臨床有效的抗癲癇間藥瑞替加濱(retigabine)所阻斷［4］。還有文獻報道海馬腦片在低鈣或高鉀的人工腦脊液中同樣可以出現(xiàn)類似癲癇間樣放電，這些癇間樣放電都可以被細胞間電極記錄下來，可以認為是研究癲癇間的很好體外模型。

2.2 按誘導方式不同分類 離體低鎂/無鎂液致癇間模型、離體青霉素致癇間模型、離體高鉀癲癇間模型、4-AP癲癇間模型及低鈣癲癇間模型。

3 離體模型特點

3.1 離體模型的優(yōu)點 (1)無血腦屏障及麻醉影響，適用于探索抗癲癇間藥物機制。(2)可以模擬體內的生理環(huán)境，能在有效地監(jiān)控細胞周圍特定的微環(huán)境下施加實驗因素;(3)可對活細胞進行觀察;(4)可在同一時期或不同時期利用較小的動物提供大量的實驗標本;(5)研究樣本較均一，減少了個體差異的干擾;(6)易于觀察、檢測并方便記錄研究所需的數據;(7)經濟、耗材少。

其中離體腦片模型有其自身的特點和優(yōu)勢，包括(1)兼有在體的腦和離體細胞培養(yǎng)二者的某些特點;(2)腦片可保持整體腦中細胞之間的正常關系;(3)能獲得高質量長時間的細胞內記錄，常規(guī)記錄可超過lh;(4)腦片機械穩(wěn)定性好，不受體內各種因素的影響，從而突出實驗的要素，有利于實驗研究，有利于篩選抗癲癇間藥物。

3.2 離體模型的缺點:(1)所需培養(yǎng)的環(huán)境嚴格，細胞及腦片易死亡;(2)對常規(guī)濃度的抗癲癇間藥物不敏感，只是以溶度依賴性抑制波幅;(3)培養(yǎng)時所需試劑的量不易掌控，其操作過程復雜。

其中離體腦片模型的缺點:(1)腦片的制作和操作過程比較復雜，腦片沒有正常的傳人和傳出通路，看不到機能或行為的結果;(2)組織的興奮性水平主要取決于灌流液中的離子濃度以及在制備過程中有損傷等。

4 離體模型的取材

離體模型一般取用鼠的海馬組織，海馬是癲癇間好發(fā)部位，海馬神經元是腦內癲癇間樣放電興奮性閾值較低的區(qū)域，是癲癇間研究最多的區(qū)域。首先，海馬組織在取材時相對于其他腦組織結構邊界清楚，不容易損傷;其次，海馬的內源性及外源性纖維及錐體細胞和顆粒細胞的胞體均按照“層狀”面排列，纖維走行均與海馬縱軸大致成直角，如刀切的方向合適，可制備出含相當高比例的各種投射纖維和突觸聯(lián)系的腦片，海馬還具備特殊的解剖特點，即不僅纖維成層排列，可區(qū)別不同纖維束的部位，而且纖維與錐體細胞或顆粒細胞的樹突構成突觸的部位與胞體有一定的距離，在腦片上很易確定。另外，可以根據研究的需要選擇海馬的不同層面。

5 各型離體模型的誘發(fā)及應用

5.1 離體低鎂/無鎂液癲癇間模型

低鎂的模型發(fā)展史:其的發(fā)展歷史已有幾十年，已廣泛用于抗癲癇間藥物的測定(1986年Walther等人，1993年Coulter和Lee等人，1995年Sombati和Delorenzo等人，2008年Albus等人應用)［2，5～7］。這種模型可以增加癲癇間發(fā)作的易感性(1934年Greenberg和Tufts發(fā)現(xiàn))，甚至可以導致人類癇間性發(fā)作(1983年ArnoldJD等人，1991年Nuytten等人發(fā)現(xiàn))［8～9］。無鎂誘發(fā)的海馬神經元反復自發(fā)癇間性放電與人類癲癇間的電生理表現(xiàn)累似。

離體無鎂液模型(包括細胞模型及腦片模型):就是將腦片或或神經元放入無鎂液或低鎂液中培養(yǎng)，通過膜片鉗或微電極可以測得類似于癲癇間樣放電。低鎂/無鎂模型的機制主要因為低鎂/無鎂降低了對N-甲基-D-天門冬氨酸(Nmethyl-D-aspartate，NMDA)受體的阻斷作用，從而使神經元的興奮性增加出現(xiàn)放電［10］。

有文獻報道將海馬神經元經無鎂液［無鎂液(mmol·L):NaCl145，KCl2.5，CaCl22，HEPES10，Glucose10，Glycine0.002，用NaOH調pH至7.3［11］］培養(yǎng)3h后可通過膜片鉗測得高幅度的類似癲癇間樣自發(fā)性放電［12］。當正常細胞外液換成低鎂/無鎂細胞外液作用0.5h后所有的海馬神經元出現(xiàn)自發(fā)的放電，開始時波幅和頻率均低，作用3h后神經元放電趨于穩(wěn)定，波幅和頻率都很規(guī)則［13］。但腦片模型跟細胞模型不同的是，細胞模型在恢復了鎂離子的濃度后其癇間樣放電停止［11］。

模型優(yōu)點及應用:(1)離體低鎂/無鎂液細胞模型可以作為癇間性發(fā)作模型或癲癇間發(fā)生機制模型;(2)離體低鎂/無鎂細胞模型因為恢復了鎂離子的溶度，其放電現(xiàn)象仍能持續(xù)較長時間，這種模型包括了癇間性發(fā)作的發(fā)生、發(fā)展及停止，是研究癲癇間治療不同的階段的良好工具，且可作為癲癇間持續(xù)狀態(tài)的模型來研究;(3)此種模型制備簡單，無致癇間藥物的影響;(4)由于無鎂液誘導的癲癇間模型對大多數常用抗癲癇間藥的敏感性卻是相似的，除可用于興奮性氨基酸受體拮抗劑的篩選外，尚可用于廣譜抗癲癇間藥的篩選。

5.2 離體青霉素癲癇間模型

青霉素模型發(fā)展史:雖其發(fā)展歷史也有幾十年，但青霉素模型多數還是用于體內模型，許多學者將青霉素腹腔注射或在腦皮質表面應用，成功建立了類似于人類皮質的癲癇間模型。1977年Philip，Schwartzkroin，andDavidAP通過選用青霉素作為致癇間劑用于灌注的豚鼠的海馬組織薄片中，在體外記錄到神經元的去極化，出現(xiàn)了類似于癲癇間樣放電，同時表明了樹突參與了癲癇間樣放電［14］。

有文獻記載致癇間劑青霉素的作用機制是通過“鎖閉”GABA能神經元，解除錐體細胞的回返抑制，使其它神經元興奮性增強，發(fā)生陣發(fā)性去極化飄移、同步放電和癇間樣發(fā)作［15］;而有些學者認為其機制是青霉素能使海馬錐體神經元里的鈣離子增加，而引發(fā)癲癇間樣放電［16］。

國內已有學者成功建立了離體的青霉素模型，青霉素有致海馬腦片癲癇間樣放電作用，且與濃度有關，在濃度2000 IU/mL下群峰電位的個數大于3～5個，幅度大于3～5mV，有明顯的癲癇間樣放電，并成功地在此癲癇間的基礎上測定了抗癲癇間藥苯巴比妥和苯妥英鈉藥物量效關系，實驗結果和臨床結果表現(xiàn)為基本一致［17］。

模型優(yōu)點及應用:(1)離體青霉素腦片模型具有實驗手段簡單，方法靈活;(2)易于建立藥物量效關系等優(yōu)點，可用于抗癲癇間藥物篩選和研究。

5.3 離體高鉀癲癇間模型

高鉀腦片模型(以海馬切片為主)是一個傳統(tǒng)的癲癇間模型，其致癇間作用主要是通過增加神經元的放電頻率，并激活部分閾值高的神經元也參與同步化的放電，從而引起類似發(fā)作間期癇間性放電的簇樣放電［18］。

在體外海馬腦片研究顯示增加細胞外鉀離子濃度可以引起較為可靠地模擬癲癇間樣放電［19～20］。離體實驗中當ACSF中細胞外鉀離子濃度從3～3.5mmol/L升高至8.5 mmol/L時，即可誘發(fā)腦片癇間樣放電［19］，癇間樣放電可長達3h［20］。這種由于增加胞外鉀離子濃度誘發(fā)的癲癇間發(fā)作活動，能被標準的抗驚厥藥所抑制。在體實驗中當細胞外K+濃度提高至11mmol/L而同時降低Ca2+濃度時，能誘發(fā)大鼠齒狀回癲癇間的發(fā)作［21］。

5.4 4-AP癲癇間模型

4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)是一種瞬時鉀離子電流阻滯劑，能在不同物種上誘發(fā)癇間樣放電，包括人類。

低濃度(100μmol/l)的4-AP能影響瞬時鉀電流，引發(fā)癲癇間樣活動(seizure-likeevents，SLE)以及發(fā)作間期癲癇間樣放電(interictalepileptiformdischarges，IED)［4］。在大鼠海馬旁的結構中如內嗅皮質、海馬下托、顳葉新皮層以及杏仁核4-AP都能引出癲癇間發(fā)作活動。記錄到50mmol/L或100 mmol/L4-AP作用腦片40min后癲癇間發(fā)作活動開始出現(xiàn)［21］。這些癲癇間發(fā)作活動對所有的標準性抗驚厥藥有反應如瑞替加濱(retigabine)。荷苞牡丹堿(Bicuculline)結合4-AP的應用能夠將4-AP引起發(fā)的SLE及IED轉變?yōu)閺桶l(fā)性癇間樣放電(recurrentepileptiformdischarges，RED)［4］。

模型的優(yōu)點及應用:(1)該模型可模擬腦內不同部位的癲癇間模型;(2)適用于多種抗癲癇間藥物的篩選。

5.5 低鈣癲癇間模型

低鈣癲癇間模型是將腦片放置于低鈣的溶液中，當鈣離子濃度低于0.2mmol/L時，產生類似于癲癇間樣放電［24］。

有文獻報道，細胞外低鈣離子濃度可以誘發(fā)規(guī)則的癲癇間發(fā)作樣活動，持續(xù)時間大約為30s，并且能規(guī)律性地重復發(fā)生［23］。浸浴在低鈣液中的海馬腦片CA1區(qū)可出現(xiàn)類似癲癇間樣的活動，且可持續(xù)數分鐘［22］，但其作用機制與鈣激活鉀電流、突觸抑制、阻滯表面電荷的通過等機制有關。

6 結束語

目前研究癲癇間的發(fā)病機理及藥物治療仍主要依靠體內模型，因為體內癲癇間模型與人類癲癇間發(fā)作存在相似性，其機理也接近人類發(fā)作時的病理生理狀態(tài)，而離體模型排除了體內癲癇間模型的個體的差異性、藥物療效的不穩(wěn)定性、癲癇間發(fā)作的多樣性以及體內血腦屏障和調節(jié)系統(tǒng)影響，以至于近年來有些學者開始致力于研究癲癇間離體模型，大量實驗證明建立離體癲癇間模型方法靈活，易于建立藥物量效關系等優(yōu)點。由于體內模型及離體模型各有各的優(yōu)點，研究癲癇間的發(fā)病機制以及藥物治療應該從體內及體外兩個方向同時進行。但不管是體內模型還是離體模型，對于抗癲癇間藥物的作用結果只能提供選擇的機會，但真正證實抗癲癇間作用的效果，應在患者身上得以證實。

1 Christianson MG，Lo DC. Development of a low-pressure microtargeting biolistic device for transfection of retinal explants. Mol Vis，2011，17: 2927-2955.

2 Sombati S，Debrenzo KJ. Recurrent spontaneous seizure activity in hippocampal neuronal networks in culture. J Neurophysiol，1995，73 ( 4) : 1706-1711.

3 Gibbs JW，Sombati S，Delorenzo RJ， et al. Physiological and pharmacological alterations in postsynatic GABA A receptor function in a hippocampal culture model of chronic spontaneous seizures. J Neurophysiol，1997， 77( 4) : 2139-2152 .

4 Armand V，Rundfeldt C，Heinemann U. Effects of retigabine ( D -23129) on different patterns of epileptiform activity induced by low magnesium in rat cortex hippocampal slices. Epilepsia， 2000， 41( 1) : 28-33.

5 Walther H，Lambet JD， Jones RS，Heinemann U，Hamo B. Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus，subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium. Neurosci Lett，1986， 69( 2) : 156-161.

6 Coulter DA，Lee CJ. Thalamocortical rhythm generation in vitro: extraand intracellular recordings in mouse thalamocortical slices perfused with low Mg2 + medium. Brain Res， 1993， 631( 1) : 137-142.

7 Albus K，Wahab A，Heinemann U. Standard antiepileptic drugs fail to block epileptiform activity in rat organotypic hippocampal slice cultures.Br J Pharmacol， 2008，154( 3) : 709-724.

8 Arnold JD，RK，Pollard AC，Silink M. Primary hypomagnesaemia: case report. Aust Paediatr J，1983，19( 1) : 45-46.

9 Nuytten D，Van Hees J，Meulemans A，Carton H. Magnesium deficiency as a cause of acute intractable seizures. J Neurol，1991，238 ( 5) : 262-264.

10 TraubRD， Jefferys JG，WhittingtonMA. EnhancedNMDAconductancecanaccount for epileptiform activity induced by low Mg2+in the rat hippocampal slice. JPhysiol，1994，478( Pt 3) : 379-393.

11 Deshpande LS，Nagarkatti N，Ziobro JM， et al. Carisbamate prevents the development and expression of spontaneous recurrent epileptiform discharges and is neuroprotective in cultured hippocampal neurons.Epilepsia，2008，49( 10) : 1795-1802.

12 Deshpande LS，Nagarkatti N，Sombati S，et al. The novel antiepileptic drug carisbamate ( RWJ 333369) is effective in inhibiting spontaneous recurrent seizure discharges and blocking sustained repetitive firing in cultured hippocampal neurons. Epilepsy Res，2008，79 ( 2-3) : 158-165.

13 DeLorenzo RJ，Pal S，Sombati S. Prolonged activation of the Nmethyl-D-aspartate receptor-Ca2 + transduction pathway causes spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal neurons in culture. Proc Natl Acad Sci USA，1998， 95( 24) : 14482-14487.

14 Schwartzkroin PA，Prince DA. Penicillin-induced epileptiform activity in the hippocampal in vitro prcpararion. Ann Neurol， 1977，1( 5) :46-469.

15 Andersen P.In:Nistico G，etal.eds，Epilepsy:An Update on Research and Theraphy.New York:ALan R Liss，1983.3-13.

16鄒曉毅，趙曉梅，章 為，等.致癇劑青霉素對新生大鼠錐體神經元細胞內游離鈣離子濃度的影響.中國神經免疫學和神經病學雜志，2001，8(4):252.

17馮武威，周小琛，白海波，等.海馬腦片抗癲癇間藥物研究的離體模型Chin J Appl Physiol，2001，17(3):302-304.

18 Cohen I，Miles R. Contributions of intrinsic and synaptic activities to the generation of neuronal discharges in in vitro hippocampus. J Physiol，2000，524( Pt 2) : 485-502.

19 Dzhala VI，Staley KJ. Transition from interictal to ictal activity in limbic networks in vitro. Neurosci，2003， 23( 21) : 7873-7880.

20 Traynelis SF，Dingledine R. Potassium-induced spontaneous electrographic seizures in the rat hippocampal slice. Neurophysiol，1988，59( 1) : 259-276.

21 Woodruff TM，Thundyil J，Tang SC， et al. Pathophysiology， treatment，and animal and cellular models of human ischemic stroke. Mol Neurodegener，2011，6( 1) : 11.

22 Huang KP，Huang FL. Calcium-sensitive translocation calmodulin and neurogranin between soma and dendrites of mouse hippocampal CAI Neurons. ACS Chem Neurosci，2011，2( 4) : 233-230.

23 Wu JY，Huang XY，Zhang C. Propagating waves of activity in the neocortex: what they are，what they do. Neuroscientist，2008，14( 5) :487-502.

24 RAHUL S，MAROM BIKSON，AND DOMINIQUE M. Effects of applied electric fields on low-calcium epileptiform Activity in the CA1 region of rat hippocampal slices. Neurophysiol，84( 1) : 274-280.