■孫丹丹 周玉巖 溫黎俊 逯佩鳳 蘇志堅(jiān) 黃亞?wèn)|

（1.廣東海納川藥業(yè)股份有限公司，廣東佛山 511400；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510632）

奶牛乳腺炎是高發(fā)病率且傳播非常迅速的一種常見(jiàn)疾病，也是一直困擾奶牛業(yè)發(fā)展的主要難題。大多數(shù)國(guó)家牛乳腺炎的發(fā)病率約為40%，每頭牛平均減少奶量約為15%[1]。無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌是乳腺炎的最常見(jiàn)傳染性病原體[2]，常存在于乳牛的皮膚、乳頭及乳房?jī)?nèi)，通過(guò)擦洗乳房用的毛巾、水、擠奶員的手、擠奶杯等。傳染性致病菌的危害比較大，擠奶期治療可以控制致病菌，但不能立刻解決泌乳期牛乳中體細(xì)胞數(shù)過(guò)高問(wèn)題，從而會(huì)影響牛乳的銷售。目前奶牛乳腺炎通常使用青霉素、慶大霉素、氧氟沙星等抗生素進(jìn)行治療[3]。長(zhǎng)期使用抗生素類藥物會(huì)增加耐藥性，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致菌群失衡。特別是近年來(lái)“超級(jí)細(xì)菌”逐漸增多，使得在合理用藥的同時(shí)研發(fā)新一代安全高效的抗菌制劑顯得尤為迫切。本試驗(yàn)利用酵母系統(tǒng)重組表達(dá)了菌絲霉素，鑒定其抗菌譜，并灌注到奶牛乳腺中，評(píng)價(jià)對(duì)奶牛乳腺炎的治療效果，為奶牛乳腺炎的防治提供了一種新的手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌絲霉素NZ2114基因，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

載體pPicZα，由暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心惠贈(zèng)。

畢赤酵母GS115，由暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心惠贈(zèng)。

受試菌：金黃色葡萄球菌CMCC26003，ATCC25923，ATCC12600。

耐藥金黃色葡萄球菌4株，從奶牛中分離。無(wú)乳鏈球菌，購(gòu)自菌種保藏中心。

蛋白酶：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選用泌乳期的4～8歲青壯年黑白花奶牛，共15頭，急性乳腺感染引發(fā)炎癥，其癥狀為乳房腫脹，牛奶異常，有凝塊或者絮片，但無(wú)其它癥狀。

1.3 載體構(gòu)建及在酵母中的表達(dá)

菌絲霉素NZ2114蛋白序列如下：GFGCNGP?WNEDDLRCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。

按照蛋白編碼序列，設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的酵母偏好性密碼子，提交生物公司合成。將合成的NZ2114基因克隆到pUC57中，用 XhoI、AvrII雙酶切后，將NZ2114基因插入畢赤酵母表達(dá)載體pPicZα，位于α因子信號(hào)肽突變體序列的下游，得到重組質(zhì)粒 pPicZα-NZ2114，并對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切及測(cè)序鑒定。

將重組質(zhì)粒pPicZα-NZ2114經(jīng)PmeI酶切后，電轉(zhuǎn)移進(jìn)到畢赤酵母GS115，用含0.5～1 mg/ml Zeocin(博萊霉素)的 YPD培養(yǎng)基篩選，30℃培養(yǎng) 2～3 d，篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于含20 ml BMGY培養(yǎng)基中的試管中，30℃，220 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將20 ml菌體轉(zhuǎn)移至 200 ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加 200 μl 100%甲醇。共培養(yǎng)120 h。

1.4 菌絲霉素純化及鑒定

發(fā)酵液用12 000 r/min離心，棄沉淀菌體，收集上清。用飽和度40%～50%的硫酸銨沉淀總蛋白，用20 mM的PB緩沖液溶解沉淀物，使用分子篩層析柱G25脫鹽。

脫鹽后的樣品使用陽(yáng)離子交換色譜CM分離純化。用pH值5.0的20 mM PB緩沖液平衡柱子，再分別用0.3 M NaCl、0.5 M NaCl洗出洗脫峰。

高效液相色譜HPLC（安捷倫2010C）。洗脫液為乙腈和水，流速1 ml/min，檢測(cè)器波長(zhǎng)254 nm，CM純化后的樣品過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)樣10 μl。60 min，從8%～80%乙腈洗脫，乙腈中添加0.1%TFA。

HPLC后，使用ABI 4700質(zhì)譜儀鑒定純化蛋白的分子量。

1.5 菌絲霉素的穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.5.1 熱穩(wěn)定性

純化蛋白1 μg/μl在40、60、80、100 ℃條件下處理5、15、30 min，將處理后的樣品取20 μl加到以金黃色葡萄球菌CMCC26003為測(cè)試菌的平板的孔中，置于37℃，培養(yǎng)12 h。以未處理樣品、水和氨芐青霉素Amp作為對(duì)照。

1.5.2 pH值穩(wěn)定性

設(shè)定8個(gè)pH值2、3、4、5、6、7、8、9梯度，純化蛋白1 μg/μl在37℃ 時(shí)在上述pH值緩沖液中作用2 h。pH值2、3、4、5 用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，pH值5、6 用磷酸緩沖液，pH值8、9用Tris-HCl緩沖液。

將處理后的樣品取20 μl加到以金黃色葡萄球菌CMCC26003為測(cè)試菌的平板的孔中，置于37℃，培養(yǎng)12 h。以未處理樣品、水和氨芐青霉素Amp作為對(duì)照。

1.6 菌絲霉素的抑菌譜鑒定

將受試菌在平板劃線，再轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用生理鹽水調(diào)節(jié)受試菌液，使之在625 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸收為0.090～0.10，然后按1∶100稀釋，搖勻。

純化后濃度為1 μg/μl菌絲霉素蛋白用微孔濾膜過(guò)濾，加入受試菌中，并使終濃度為1 000、500、100、50、10、1、0.5 μg/ml。然后置于37 ℃條件下，培養(yǎng)12 h。陽(yáng)性對(duì)照為氨芐青霉素。

1.7 菌絲霉素對(duì)牛乳腺炎的防治試驗(yàn)

選擇泌乳期的4～8歲青壯年黑白花奶牛，共15頭，隨機(jī)分為3組，每組5頭。第1組為空白對(duì)照組，不給予藥物；第2組為菌絲霉素治療組，按0.05%的劑量給予乳房灌注，每天給藥2次，每次給藥20 ml；第3組為陽(yáng)性藥物組，按青霉素G鉀10萬(wàn)單位，每天給藥2次，進(jìn)行乳房?jī)?nèi)注射給藥。連續(xù)給藥7 d。

觀察指標(biāo)為痊愈和有效：痊愈指臨床乳腺炎的癥狀全部消失，乳房組織柔軟，牛奶中沒(méi)有凝塊，牛奶顏色較白。有效指臨床乳腺炎的癥狀減輕，或者不再惡化，牛奶正常，但乳房腫脹沒(méi)有完全消失。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建及在酵母中的表達(dá)

圖1 PCR鑒定重組子電泳

NZ2114基因位于α-factor突變體基因下游，二者總共約500 bp，PCR鑒定，擴(kuò)增出大小為500 bp左右的片段，與預(yù)測(cè)一致。

圖2 畢赤酵母重組表達(dá)菌絲霉素的SDS-PAGE電泳

2.2 菌絲霉素純化及鑒定

經(jīng)過(guò)G25、CM和RP-HPLC后，得到純度為90%以上的菌絲霉素蛋白。

圖3 菌絲霉素的RP-HPLC純化

質(zhì)譜在4 412.69處有最高峰。菌絲霉素理論分子量為4 413.92。與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明畢赤酵母GS115菌株表達(dá)的物質(zhì)是菌絲霉素NZ2114。

圖4 菌絲霉素的質(zhì)譜分析

2.3 菌絲霉素的穩(wěn)定性

2.3.1 熱穩(wěn)定性

在40、60、80、100 ℃條件下處理5、15、30 min后，菌絲霉素對(duì)金葡CMCC26003仍有抑菌活性，抑菌圈未見(jiàn)減小，說(shuō)明菌絲霉素對(duì)熱的穩(wěn)定性良好，見(jiàn)圖5。

2.3.2 pH值穩(wěn)定性

不同pH值處理后的菌絲霉素對(duì)金黃色葡萄球菌CMCC26003都有抑菌活性，但當(dāng)pH值2～3時(shí)和pH值8～9時(shí)，抑菌圈與對(duì)照相比變小，說(shuō)明活性有所下降。見(jiàn)圖6。

2.4 菌絲霉素抑菌譜

菌絲霉素抑菌譜見(jiàn)表1。

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)及指標(biāo)測(cè)定（見(jiàn)表2）

從表2可以看出，菌絲霉素抗感染的痊愈率和有效率略高于抗生素組。細(xì)菌學(xué)檢測(cè)證明菌絲霉素治療前后，牛乳腺感染區(qū)的金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌的數(shù)目顯著下降，對(duì)耐藥金葡萄球菌也有很好的抑制作用，尤其是耐藥金葡萄球菌，效果好于青霉素G。

3 討論

防御素是一類具有廣譜抗微生物活性的陽(yáng)離子小肽，具有抗菌、抗病毒、趨化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，具有藥用價(jià)值，在預(yù)防和治療疾病方面有良好的應(yīng)用，也為替代傳統(tǒng)抗生素提供了新途徑。

圖5 菌絲霉素的熱穩(wěn)定性分析

圖6 菌絲霉素的pH值穩(wěn)定性分析

表1 菌絲霉素對(duì)不同細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)

表2 菌絲霉素對(duì)乳區(qū)急性感染的治療效果

菌絲霉素是2005年由丹麥諾維信公司從腐生子囊菌假黑盤(pán)菌（Pseudoplectania nigrella）中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)真菌防御素，具有典型的CSαβ結(jié)構(gòu)，體外可以抑制多種革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)[4]。利用基因重組技術(shù)，菌絲霉素在大腸桿菌和畢赤酵母中都得到了成功的表達(dá)[5-6]。

本研究利用酵母表達(dá)系統(tǒng)，在α-factor信號(hào)肽后連接菌絲霉素基因，成功建立了分泌型表達(dá)的載體。畢赤酵母屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，安全高效，表達(dá)水平高，培養(yǎng)基廉價(jià)，發(fā)酵工藝成熟，易放大。通過(guò)此系統(tǒng)，菌絲霉素蛋白可大量表達(dá)，分離純化簡(jiǎn)便。此方法的建立，為后續(xù)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

飼料行業(yè)中應(yīng)用防御素，以天蠶素研究最早，主要針對(duì)革蘭氏陰性菌有抑制作用，能提高母豬產(chǎn)仔率、解決仔豬腹瀉等問(wèn)題。防御素應(yīng)用于治療和預(yù)防牛乳腺炎，是近十幾年新興的研究熱點(diǎn)，如Marcus發(fā)現(xiàn)兩種活性多肽A70和A53，可抑制從牛乳腺炎中分離到的金葡和鏈球菌，有治療牛乳腺炎的應(yīng)用前景[7]。我們發(fā)現(xiàn)菌絲霉素在體外有對(duì)預(yù)防和治療牛乳腺炎的作用，屬于首次報(bào)道。

4 小結(jié)

通過(guò)畢赤酵母表達(dá)的真菌防御素——菌絲霉素在體外對(duì)金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有很好的抑制作用，對(duì)溫度、酸堿都比較穩(wěn)定，在牛體內(nèi)灌注后能夠預(yù)防和治療牛的急性乳腺炎，也可作為外用殺菌劑噴灑到環(huán)境、擠奶用品上，是新一代安全高效的抗菌制劑，有良好的應(yīng)用前景。本研究為菌絲霉素的制備提供了方法，為預(yù)防和治療牛乳腺炎提供了初步試驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)過(guò)后續(xù)不斷地深入研究，菌絲霉素可望發(fā)展為一類新獸藥。