■李 豐 郝燕娟 葉竹林 賴彩冰 彭志通

（廣州匯標檢測技術中心，廣東廣州 510300）

魚粉是全世界使用最廣泛、營養(yǎng)價值豐富的飼料蛋白原料，其含有動物生長所必需的氨基酸，且含量豐富、配比合理，在飼料、養(yǎng)殖業(yè)行業(yè)中起著不可代替的作用。隨著我國飼料行業(yè)的發(fā)展，魚粉需要量逐年增加，由于用量大、價格高，有些不法商家在魚粉中摻入水解羽毛粉、血粉、肉骨粉和皮革粉等低價位的高蛋白質弄虛作假、以次充好，使魚粉質量參差不齊。這種現(xiàn)象不但造成資源浪費，也為飼料企業(yè)和畜牧業(yè)帶來經(jīng)濟損失。僅用粗蛋白含量作為指標，并不能正確反映出魚粉的質量。因此，對魚粉中氨基酸含量的測定有助于魚粉質量的評價。據(jù)文獻報道，魚粉及飼料中氨基酸的測定方法主要有高效液相色譜法和氨基酸分析儀法，高效液相色譜法是采用鄰苯二甲醛（OPA）、異硫氰酸苯酯（PITC）等衍生化試劑柱前衍生紫外或熒光檢測，氨基酸分析儀法是采用茚三酮柱后衍生紫外檢測。采用不同方法同時測定魚粉中氨基酸含量，并對測定結果的相關性進行比較研究的文章未見發(fā)表。因此，本研究采用OPA、PITC柱前衍生HPLC分析和茚三酮柱后衍生氨基酸分析儀分析三種不同方法測定魚粉中16種氨基酸含量，并對三種方法的結果進行比較，以了解這三種檢測方法測定結果之間的相關性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與主要儀器

魚粉樣品為市售進口魚粉；16種氨基酸混標（Sigma）；鄰苯二甲醛（Sigma）、異硫氰酸苯酯（Sigma）、茚三酮（Sigma）；乙腈（Merck）、甲醇（Merck）；純凈水（實驗室自制）；其他試劑均為分析純。

日立L-8900氨基酸分析儀，EZChromtion工作站；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元泵、脫氣機、自動進樣器、紫外檢測器、柱溫箱、Agilent化學工作站；島津LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元泵、自動進樣器、SPD檢測器、柱溫箱、LC-solution工作站；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9030A，上海一恒）；天子天平（EL104，梅特勒）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

酸水解法：準確稱取0.1～0.2 g樣品，置于15 ml安瓿瓶中，加入10 ml 6 mol/l鹽酸溶液，振搖使樣品均勻分散在溶液中，充氮后立即用噴燈熔封，然后置于（110±1）℃烘箱中水解24 h，取出冷卻、過濾，取水溶液2 ml，置于雞心瓶中用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干，加入5 ml的0.02 mol/l稀鹽酸溶液溶解，用0.22 μm濾膜過濾后，取上清液備用。

1.2.2 氨基酸混合標準儲備液的制備

精密量取16種氨基酸混標（2.5 μmol/ml）適量，用0.02 mol/l鹽酸溶液配制成0.1 μmol/ml的混合標準儲備液。

1.2.3 衍生方法

鄰苯二甲醛衍生法：精密稱取鄰苯二甲醛15 mg，加0.4 mol/l硼酸緩沖液1 ml溶解，再加50 μl乙腈和15 μl巰代乙醇酸酯，渦旋混勻，然后采用Agilent 1100高效液相色譜儀自動進樣器的程序進樣完成柱前衍生。

異硫氰酸苯酯衍生法：準確量取水解后溶液和氨基酸標準工作液200 μl，分別置于1.5 ml離心管中，分別加入三乙胺乙腈溶液100 μl和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μl，搖勻室溫靜置衍生1 h。衍生結束后分別加入400 μl正己烷，振搖并靜置10 min，取下層溶液用0.45 μm濾膜過濾后備用。

1.2.4 AAA緩沖液和茚三酮反應液的配制

蛋白質水解系統(tǒng)緩沖液（pH-1、pH-2、pH-3、pH-4）、再生液（pH-RG）及茚三酮反應液的配制均參考日立L-8900氨基酸分析儀說明書配方。

1.2.5 色譜條件

鄰苯二甲醛衍生法（Agilent HPLC）色譜條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×150 mm柱；流動相A：0.04 mol/l磷酸二氫鈉溶液（pH值7.82）；流動相B：甲醇-乙腈-水（45-45-10）溶液，流動相洗脫梯度見表1；流速2.0 ml/min，柱溫40℃，波長338 nm。魚粉樣品的分離圖譜見圖1。

表1 梯度洗脫程序（OPA）

圖1 魚粉氨基酸的HPLC圖譜（Agilent HPLC）

異硫氰酸苯酯衍生法（島津HPLC）色譜條件：色譜柱為Sepax AAA 4.6 mm×250 mm柱；流動相A：0.1 mol/l醋酸鈉-乙腈（93-7）溶液（pH值6.5）；流動相B：乙腈-水（80-20）溶液，流動相洗脫梯度見表2；流速1.0 ml/min，柱溫36℃，波長254 nm。魚粉樣品的分離圖譜見圖2。

AAA測定條件：離子交換樹脂EZChrom Elite 4.6 mm×60 mm柱，時間51 min，緩沖液流速0.4 ml/min，茚三酮流速0.35 ml/min，緩沖液泵壓8～12 MPa，茚三酮泵壓1.5～3.5 MPa，緩沖液改變次數(shù)3，分離柱溫57℃、衍生柱溫135℃，檢測波長為440 nm和570 nm。魚粉樣品的分離圖譜見圖3。

表2 梯度洗脫程序（PITC）

2 實驗結果和討論

2.1 方法學驗證

本研究對三種方法進行的完整的方法學研究，結果見表3。AAA法、OPA法和PITC法的標準曲線范圍分別是5～500、10～500 μmol/l和10～500 μmol/l，相關系數(shù)r均大于0.999；AAA法多數(shù)目標物的檢出限低于OPA法，而OPA法的檢出限又優(yōu)于PITC法，主要原因是AAA法的進樣體積為20 μl、大于HPLC的5 μl，另PITC法用的是島津HPLC的SPD檢測器，靈敏度比紫外檢測器要低一點；在回收率、精密度驗證方面，三種方法的結果都比較相近。

圖2 魚粉氨基酸的HPLC圖譜（島津HPLC）

圖3 魚粉氨基酸的AAA圖譜

2.2 測試結果的比較

本研究用三種不同方法對同一個魚粉樣品進行分析，將測得結果進行統(tǒng)計學分析，結果見表4。三種方法的三列測定結果兩兩配對進行線性回歸，得到三個回歸方程y=0.003 8x+1.004 7，相關系數(shù)r=0.997 3；y=10.073 4x+1.007 61，相關系數(shù)r=0.995 3；y=10.094 0x+1.036 1，相關系數(shù)r=0.998 0。三個回歸方程的相關系數(shù)r都是大于0的，在統(tǒng)計學上看三者具有一定的相關性。對16種氨基酸測定結果采用F檢驗，得出的F值見表 4，F(xiàn) 值都小于 F0.95（5，6）4.39，說明三種方法的測定結果不具有顯著性差異（其中Pro是兩種方法的比較）。三種方法測定結果的平均相對標準偏差為3.10%，最大的為6.61%（Pro），最小的為0.91%（Thr），其中國家標準魚粉兩個重要氨基酸指標蛋氨酸、賴氨酸的相對標準偏差分別為2.11%和2.17%。

表3 方法學比較

表4 樣品實測值比較

2.3 三種方法的比較分析

本研究采用的OPA法（Agilent HPLC）和PITC法（島津HPLC）是相應儀器供應商根據(jù)各自儀器的特點推薦的柱前衍生方法。OPA衍生步驟簡單、反應速度快，只需設置儀器程序進樣就能完成柱前衍生步驟，OPA能和一級氨基酸發(fā)生衍生反應，不能和二級氨基酸直接反應，所以本研究中OPA法沒有測定脯氨酸含量。有文獻報道，可以采用OPA和氯甲酸芴甲酯（FMOC）兩種衍生試劑結合衍生、FMOC與二級氨基酸衍生的辦法解決OPA法的缺陷，不過這種方法可能會使反應條件的選擇難度增大，同時也會對后續(xù)的分離帶來更大的困難。PITC與一級、二級氨基酸均能反應，只是PITC法具有衍生反應條件嚴格、步驟相對復雜、毒性大、會降低分析柱壽命等缺陷。AAA法采用的是茚三酮在線柱后衍生，衍生反應迅速、穩(wěn)定。

本研究采用了三種不同儀器，運用常規(guī)前處理酸水解法測定了魚粉中16種氨基酸（OPA法測定15種）的含量。色氨酸在酸中分解，如采用酸水解法無法準確測定色氨酸的含量，必須采用堿水解法。半胱氨酸中的巰基會同OPA法中的2-巰基乙醇發(fā)生競爭性反應，所以OPA法無法測定半胱氨酸含量。針對這兩種情況，本研究未檢測魚粉中色氨酸和半胱氨酸含量，在后續(xù)工作中將對這兩種氨基酸的含量測定進一步研究。

有國家標準規(guī)定飼料中氨基酸的檢測要使用氨基酸分析儀，不過氨基酸分析儀在價格上比高效液相色譜儀貴，對于需要出具公證數(shù)據(jù)、仲裁服務的檢測機構可能會采用氨基酸分析儀測定氨基酸，其他企業(yè)實驗室、研究機構等針對價格和多用性可能會考慮高效液相色譜儀測定氨基酸。使用者可根據(jù)不同需求選擇合適的檢測儀器和衍生方法。

3 結論

從本研究結果可看出，AAA法檢出限最低，回收率、精密度三種方法都比較相近。三種方法都可以測定魚粉中氨基酸的含量，其測定結果具有相關性，且結果不具有顯著性差異，但存在一定的偏差。

（參考文獻若干篇，刊略，需者可函索）