諶業(yè)帥 史冬泉 徐興全 蔣青

細胞片技術(shù)在肌腱再生組織工程學(xué)中的應(yīng)用進展

諶業(yè)帥 史冬泉 徐興全 蔣青

腱損傷；創(chuàng)傷和損傷；組織工程；綜述

全世界范圍內(nèi)每年有超過 3000 萬例的肌腱或者韌帶損傷，一旦肌腱受到損傷，人的運動能力甚至日常生活都會受到嚴重影響[1]。然而，肌腱的恢復(fù)并不是一個再生的過程，而是一個纖維化瘢痕形成的過程，這導(dǎo)致了它的功能障礙甚至喪失[2]。肌腱損傷傳統(tǒng)的治療方法包括自體移植物、同種異體移植物、異種移植物以及人工移植物。然而，這些方法都很難達到讓人滿意的效果[3]。自體移植物取腱處的功能影響、同種異體移植物來源的限制及異體移植物的免疫原性等缺陷，使得人們愈發(fā)迫切地想要研發(fā)出可在體外大量生產(chǎn)的與體內(nèi)肌腱結(jié)構(gòu)與功能類似的移植物。近年來，由于組織工程學(xué)的快速發(fā)展，為滿足這個愿望提供了一種潛在的方法。然而，傳統(tǒng)使用支架的肌腱組織工程學(xué)有著諸如較差的生物力學(xué)活性等缺陷，這催生了一種不使用支架的組織工程新技術(shù)——細胞片技術(shù)。在這篇綜述中，筆者將主要討論細胞片技術(shù)在肌腱再生組織工程學(xué)中的應(yīng)用進展。

一、細胞片的制作方法

組織工程細胞片是利用一些組織工程的方法使細胞連同細胞外基質(zhì)從培養(yǎng)皿表面分離下來的完整的片狀結(jié)構(gòu)[4]。目前用來構(gòu)建組織工程細胞片的方法主要有利用溫敏性培養(yǎng)皿和聚合纖維蛋白覆蓋的培養(yǎng)皿[5]及使用維生素C 誘導(dǎo)[6]等。

1. 溫敏性培養(yǎng)皿：溫敏性培養(yǎng)皿是將溫度反應(yīng)性的聚合物 ( 如聚 N- 異丙基丙烯酰胺 ) 共價嫁接到普通培養(yǎng)皿表面所形成的一類培養(yǎng)皿[7]。在 37 ℃ 時，聚合物表面表現(xiàn)出疏水性，細胞可以附著于培養(yǎng)皿表面，而當溫度降低至32 ℃ 以下時，聚合物表面則表現(xiàn)出親水性，迅速水合膨脹，使細胞從表面分離下來。收獲的細胞片保留有完整的細胞、細胞間連接以及細胞外基質(zhì)，當其移植入其它培養(yǎng)皿中或生物體內(nèi)時更易存活。并且由于保留的細胞外基質(zhì)的黏附性，其也可以用來堆疊形成更復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)。與使用酶消化相比，這種方式不會破壞細胞與細胞之間的連接，但是成本很高。

2. 聚合纖維蛋白覆蓋的培養(yǎng)皿：Ⅰtabashi 和他的團隊發(fā)明了一種使用薄層、可生物降解的聚合纖維蛋白覆蓋的培養(yǎng)皿來制作細胞片的簡單、新穎的方法，并獲得了一些學(xué)者的青睞[8-9]。培養(yǎng)皿用纖維蛋白原單體和凝血酶的混合物覆蓋，并儲存于 4 ℃ 的溫度中。細胞種植于纖維蛋白聚合物上 4 天，覆蓋的纖維蛋白聚合物會被細胞分泌的蛋白酶降解，此時，就可以通過細胞刮勺來收集組織工程細胞片。使用這種方法同樣可以用來制作多層復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，并降低了制作成本，但也增加了操作的復(fù)雜程度。

3. 維生素 C 誘導(dǎo)：Wei 等[6]發(fā)現(xiàn)維生素 C 可以通過誘導(dǎo)端粒酶的活性來提高細胞外基質(zhì)和干細胞標記物的表達，并因此促進細胞片的形成和組織再生。并得出20 μg / ml 是最適濃度。這是一種簡單、實用獲取組織工程細胞片的方法，與正常培養(yǎng)細胞相比成本幾乎沒有差別。但是由于收集細胞片時需要使用胰蛋白酶消化，如果時間把握不當，可能會破壞細胞之間的連接，這對操作者的技術(shù)和經(jīng)驗提出了更高的要求。但是由于以上兩種方法的成本較高，本方法依然有可能成為在臨床上大規(guī)模應(yīng)用細胞片時的首選方法。

二、細胞片修復(fù)肌腱損傷的方式

近年來，隨著細胞片組織工程學(xué)的發(fā)展，組織工程細胞片已經(jīng)應(yīng)用于多種組織或器官的修復(fù)與再生，如心臟[10-12]、皮膚[13-15]等。在肌腱再生組織工程學(xué)中，細胞片的應(yīng)用也越來越多，不同的學(xué)者利用不同的種子細胞在體內(nèi)、體外對組織工程細胞片進行肌腱再生的可行性進行了研究，并獲得了令人肯定的成果 ( 表 1 )。

1. 細胞片技術(shù)＋支架：Ouyang 等[16]構(gòu)建了骨髓間充質(zhì)干細胞細胞片，并把其覆蓋于 PLGA 支架表面，再將兩者的混合體卷曲成圓柱狀，作為肌腱的組織工程學(xué)類似物。并通過對其進行宏觀形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、生物力學(xué)的評估，發(fā)現(xiàn)此類肌腱類似物可以轉(zhuǎn)變成肌腱類似物，并且與單純支架相比具有更好的生物力學(xué)性能。然而，這種體外肌腱類似物的制作方式仍然采用了支架，沒有避免傳統(tǒng)的使用支架所導(dǎo)致的免疫毒性等缺點，且浪費了細胞片不需要支架，可以單獨具有一定形態(tài)的優(yōu)勢。作者也并沒有進行體內(nèi)試驗，此方法在體內(nèi)的效果存疑，距離應(yīng)用于臨床仍有一定距離。

2. 細胞片技術(shù)＋機械刺激：機械刺激可以導(dǎo)致一系列的生物學(xué)進程，包括細胞增殖與分化，細胞因子與細胞外基質(zhì)的合成等，其可以增加 Ⅰ 型膠原、ⅠⅠⅠ 型膠原與肌腱特異性基因的合成，因此可以作為促進肌腱再生的一種可行方式[22-24]。此種方式不使用任何人工合成異物，可放心應(yīng)用于體內(nèi)。Ni 等[19]以大鼠肌腱來源的干細胞作為種子細胞，在體外構(gòu)建了組織工程學(xué)細胞片，并將其纏繞在間距為 1 cm 的 U 型彈簧上，給以機械刺激，形成肌腱類似物，并將其移植入大鼠髕腱損傷模型中，發(fā)現(xiàn)以這種方式在體外構(gòu)建的肌腱類似物可以顯著促進髕腱損傷的修復(fù)。作者通過體內(nèi)及體外試驗充分證明了細胞片技術(shù)＋機械刺激在促進肌腱修復(fù)上的有效性，只是動物模型距離人類本身仍有一定差距，須進一步在更大、更復(fù)雜的生物上進行試驗，方可慢慢地靠近臨床應(yīng)用。不可否認的是，利用機械刺激的方式構(gòu)建肌腱類似物，既避免使用了支架，亦無需昂貴的細胞因子誘導(dǎo)，最終的結(jié)果也令人滿意。

3. 細胞片技術(shù)＋自體肌腱移植：目前臨床上治療肌腱損傷大部分采取自體肌腱移植，然而這種方法可能會出現(xiàn)移植物的壞死，影響手術(shù)的效果，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能的下降[25-26]。因此，如何促進移植物更早的恢復(fù)是一個亟需解決的問題。Mifune 等[20]使用組織工程細胞片包裹自體肌腱移植物來進行前交叉韌帶的重建，并將其與肌腱移植物加細胞注射對比，發(fā)現(xiàn)細胞片包裹的移植物表面及骨隧道里含有更多的細胞，因此可以促進移植物早期的恢復(fù)及與骨隧道的結(jié)合。這種方式是在現(xiàn)有臨床基礎(chǔ)上的改進，因此更貼近臨床，并由于其較好的效果，亦更有可能應(yīng)用于臨床。雖然細胞片加自體肌腱移植的效果不容否認，但是依然使用了自體肌腱，這并沒有減少對患者的創(chuàng)傷，依然有可能會影響患者其它部位的功能，不符合組織工程學(xué)的初衷。

三、細胞片技術(shù)應(yīng)用的優(yōu)勢

使用傳統(tǒng)的種子細胞加支架方法進行肌腱再生具有介導(dǎo)細胞增殖與分化能力低、較差的生物力學(xué)活性及重塑潛能、細胞與支架結(jié)合的低效性等缺陷。而使用組織工程細胞片技術(shù)則可以很好地避免這些缺陷，并且使用細胞片技術(shù)，可以將細胞與支架合二為一，從而避免了使用支架所導(dǎo)致的免疫原性帶來的不良反應(yīng)，亦不存在支架降解速率與細胞增殖不相符的缺陷?，F(xiàn)階段，隨著研究的不斷深入，用來制作細胞片的種子細胞越來越多[27-28]，來源與取材已不再是一個難題，傳統(tǒng)組織工程學(xué)方法在種子細胞來源上的優(yōu)勢已不復(fù)存在，而組織工程細胞片技術(shù)結(jié)合性好等優(yōu)勢則是傳統(tǒng)細胞加支架組織工程學(xué)所無法比擬的。

四、細胞片技術(shù)應(yīng)用的缺陷及解決方法

由于在組織工程細胞片中沒有血管，使細胞片很難堆疊很多層來獲得足夠的體積與張力，這限制了細胞片在組織工程學(xué)中的應(yīng)用。從現(xiàn)有研究亦不難看出，目前使用細胞片進行體內(nèi)試驗，應(yīng)用最多的仍是大鼠模型，大鼠的肌腱，無論從體積上還是從張力上，都與人類相去甚遠。為了解決這個問題，不同的學(xué)者采取了不同的方法。有學(xué)者將組織工程細胞片技術(shù)與支架結(jié)合來獲得適合的體積與張力[16,29]，但這種方法浪費了細胞片不需要支架的優(yōu)勢，筆者認為其不是組織工程細胞片技術(shù)的發(fā)展趨勢。Kamata 等[30]將細胞片移植與內(nèi)皮祖細胞注射結(jié)合起來，共同作用于組織損傷部位，取得了良好的效果。Sekine等[31]將心肌細胞與內(nèi)皮細胞在溫敏性培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)制作細胞片，內(nèi)皮細胞在心肌細胞間亦形成了細胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且體外觀察發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)細胞片中的血管生成因子明顯增加；作者再通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，含有內(nèi)皮細胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多層細胞片組織相較于不含內(nèi)皮網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多層細胞片組織，可以更好地與宿主的血管連接，并促進壞死組織的修復(fù)和功能的恢復(fù)。Ren 等[32]則將人臍靜脈內(nèi)皮細胞種植于人骨髓間充質(zhì)干細胞所形成的細胞片上來形成內(nèi)皮細胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并通過體內(nèi)和體外實驗證明了這種組織具有非凡的血管生成能力。然而，無論是內(nèi)皮細胞注射，或是共培養(yǎng)，抑或是內(nèi)皮細胞種植，目前的研究都處于起步階段，仍需要大量的實驗來繼續(xù)論證。但是，通過現(xiàn)有的研究，有理由相信，隨著細胞片組織工程學(xué)的發(fā)展，細胞片血管化將不再成為限制組織工程細胞片技術(shù)發(fā)展應(yīng)用的難題，細胞片應(yīng)用于臨床亦將逐漸成為現(xiàn)實。

五、回顧

近年來，細胞片技術(shù)已經(jīng)成為肌腱再生組織工程學(xué)中的研究熱點，其擁有良好的重塑潛能、細胞支架合二為一的高效性等優(yōu)勢，贏得了研究者的青睞。有理由相信，隨著細胞片組織工程學(xué)的進展，尤其是在細胞片血管化方面的研究，其在肌腱損傷的修復(fù)與再生中的應(yīng)用前景令人看好。

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( 本文編輯：李貴存 )

Progress of cell sheet in tendon tissue engineering

SHEN Ye-shuai, SHI Dong-quan, XU Xing-quan, JIANG Qing.
Bone and Joint Disease Center, Drum Tower Clinical Medical Faculty Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing, Jiangsu, 210008, PRC Corresponding author: JⅠANG Qing, Email: jiangqing112@hotmail.com

Tendon injuries are common diseases which could induce substantial pain and loss of functions. Current clinical therapy of tendon injury has some disadvantages, such like the limitation of the graft which have fueled the search for tissue-engineered substitutes. Many achievements have been made during past several years. Many kinds of cells nowadays have been used in an attempt to enhance the healing of tendons: fibroblast cell lines, mesenchymal stem cells ( MSCs ), embryonic stem cells ( ESCs ) and induced pluripotent stem cells ( iPSCs ). And a large number of scaffold materials also have been explored for tendon tissue engineering including natural substances ( silk, collagen ) and synthetic biodegradable materials ( poly lactic-co-glycolic acid ). Beside gene-related approaches, the approach of tendon tissue engineering also involve some physical methods like mechanical stimulation. However, the traditional tissue engineering with scaffolds has some disadvantages. Naturally derived polymers generally show good biocompatibility but low ductility whereas the synthetic polymers exhibit a high tunability but may cause negative immune response from the body, and the scaffolds can’t fully simulate the environment between cells. To avoid this, cell sheet engineering has been developed as a unique, scaffold-free method of cell processing. Ⅰn this review, some methods for making cell sheet and its application in tendon tissue engineering are described.

Tendon injuries; Wounds and injuries; Tissue engineering; Review

sn.2095-252X.2015.10.019

R686

國家杰出青年科學(xué)基金 ( 81125013 )

210008 江蘇，南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院關(guān)節(jié)疾病診治中心

蔣青，Email: jiangqing112@hotmail.com

2014-10-21 )