孫飛史宏?duì)N

組織工程氣管替代治療的臨床轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

孫飛1，2史宏?duì)N1，3

氣管疾病可由多種病因引起并具有顯著臨床癥狀，治療包括外科手術(shù)治療乃至整個(gè)器官重建。組織工程主要通過(guò)細(xì)胞或組織修復(fù)，從而進(jìn)行組織再生或替代，有望成為氣管替代治療的新途徑。組織工程成功的關(guān)鍵因素包括天然或合成支架；自體或異體細(xì)胞；模擬（體內(nèi)或體外）生理環(huán)境的生物反應(yīng)器；通過(guò)分子生物或藥物干預(yù)進(jìn)行特定組織保護(hù)。該文旨在綜述組織工程氣管構(gòu)建的研究現(xiàn)狀及臨床替代治療的新進(jìn)展。

組織工程； 氣管； 臨床移植

氣管病損可因狹窄、感染、癌癥、先天畸形、創(chuàng)傷、異物吸入等引起。長(zhǎng)段氣管病損可威脅生命且難以治愈，仍然是氣管重建外科最具挑戰(zhàn)性的難題。半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，一直嘗試用不同移植物材料作為氣管代用品進(jìn)行氣管重建，如自體移植物、同種異體移植物、假體材料以及復(fù)合組織材料，然而僅有少數(shù)在臨床應(yīng)用中獲得成功［1］。這些移植物的臨床應(yīng)用因肉芽組織、再狹窄、感染、材料失效、需要終生免疫抑制治療、缺乏供體、缺乏生長(zhǎng)潛能（尤其對(duì)兒童而言）而受到限制［2］。

組織工程［3］有望通過(guò)將自體細(xì)胞結(jié)合3D生物支架再生成為新的組織結(jié)構(gòu)而進(jìn)行器官重建，被認(rèn)為是一種有效避免供體稀缺及終身服用免疫抑制劑等缺陷而創(chuàng)建功能氣管代用品的理想技術(shù)，而且組織工程氣管與宿主具有良好的生物相容性及體內(nèi)生長(zhǎng)潛能。構(gòu)建組織工程氣管需要三個(gè)要素：細(xì)胞、支架與培養(yǎng)環(huán)境。

一、細(xì)胞

1．上皮細(xì)胞：原生上皮細(xì)胞遷移到組織工程結(jié)構(gòu)內(nèi)腔，然后再上皮化及黏膜化需要很長(zhǎng)時(shí)間。如果沒(méi)有上皮細(xì)胞，支架將對(duì)細(xì)胞入侵十分敏感，且易形成肉芽組織甚至再狹窄［4］。呼吸道上皮細(xì)胞具有炎癥屏障功能，并具有加濕吸入氣體及清除氣道分泌物等重要生理作用［5］。原代上皮細(xì)胞難以培養(yǎng)，

2．軟骨細(xì)胞：主要來(lái)源于耳、鼻中隔、肋骨、關(guān)節(jié)軟骨、氣管軟骨。Komura等［10］將兔耳軟骨細(xì)胞種植于生物可降解支架材料行氣管缺損修補(bǔ)，在移植3個(gè)月后依然保持完整的氣管結(jié)構(gòu)。Tani等［11］使用兔耳軟骨制備軟骨細(xì)胞片，隨后貼附于硅膠管表面并體外培育，成功制備出組織工程軟骨。Weidenbecher等［12］將軟骨細(xì)胞片制備的支架成功用于兔模型氣管段的重建。Hong等［13］將兔關(guān)節(jié)軟骨與纖維蛋白和透明質(zhì)酸水凝膠于體外擴(kuò)張、培養(yǎng)，種植在多孔可降解聚乙烯［poly（L－lactic－co－glycolic acid），PLGA］氣管支架，體外培養(yǎng)4周后移植到兔氣管缺損部位，結(jié)果顯示重建氣管并未出現(xiàn)狹窄并具有正常氣管功能。Komura等［14］將人體氣管軟骨細(xì)胞作為組織工程氣管軟骨來(lái)源，結(jié)果顯示其與原生氣管軟骨沒(méi)有明顯差異。然而，軟骨細(xì)胞的取材困難且有創(chuàng)，因此在臨床應(yīng)用具有一定的局限性。最好的辦法是獲取少量供體軟骨細(xì)胞，隨后進(jìn)行體外培養(yǎng)或者直接在術(shù)中將細(xì)胞種植在支架，從而最大限度減少對(duì)供體的傷害。

3．干細(xì)胞：最理想的細(xì)胞類型是來(lái)源單一且能分化為各種所需的細(xì)胞類型。目前應(yīng)用于在組織工程氣管干細(xì)胞有：間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）（可從多種組織中分離，包括骨髓［15］、脂肪［16］、臍帶［17］、羊水［18］等）、骨髓單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cell，MNCc）、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。MSCs不僅具有較強(qiáng)的自我更新能力，且具有較長(zhǎng)的存活能力，可分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉等不同細(xì)胞系，為組織工程氣管再生提供了有效的細(xì)胞來(lái)源［19］。Nakamura等［20］通過(guò)對(duì)氣管假體不同處理的比較證實(shí)，將自體BMSCs覆蓋在假體然后植入比格犬氣管缺損部位能夠促進(jìn)氣管黏膜再生。Jungebluth等［21］將動(dòng)物自體MNCc與上皮細(xì)胞種植于脫細(xì)胞氣管支架表面，隨后進(jìn)行體內(nèi)原位移植，并通過(guò)特異性因子誘導(dǎo)干細(xì)胞動(dòng)員促進(jìn)組織再生，具有良好的移植效果。Fecek等［22］研究發(fā)現(xiàn)將ESCs直接注射到小鼠體內(nèi)易產(chǎn)生畸胎瘤，而將ESCs衍生的分化細(xì)胞種植在支架上進(jìn)行移植并沒(méi)有畸胎瘤形成，說(shuō)明將ESCs種植在支架上對(duì)軟骨再生至關(guān)重要。最近研究顯示，iPSCs無(wú)須傳代，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞系產(chǎn)生穩(wěn)定均勻的透明軟骨樣組織［23］。

二、支架

1．天然衍生材料：多種天然材料已被證實(shí)具有為細(xì)胞黏附和培養(yǎng)提供合適基質(zhì)的潛能，如明膠、殼聚糖、透明質(zhì)酸、藻朊酸鹽、纖維蛋白膠和脫細(xì)胞組織［24］。通過(guò)脫細(xì)胞方法能夠獲得一種低（或無(wú)）免疫原性的氣管材料基質(zhì)，并能構(gòu)建組織支架。目前，脫細(xì)胞方法主要包括使用各種洗滌劑和溶液（如離子、非離子、堿性、酸性、兩性離子、溶劑、螯合和酶制劑）和物理技術(shù)［25］。由于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）對(duì)組織再生、細(xì)胞歸巢、分化具有極其重要的意義，當(dāng)選擇最合適的組織脫細(xì)胞化進(jìn)程中必須考慮到ECM的結(jié)構(gòu)變化。因此，必須慎重選擇合適的脫細(xì)胞化方法。在脫細(xì)胞后能夠完整保存支架ECM結(jié)構(gòu)，且滿足移植物的基本要求，即無(wú)免疫原性、無(wú)毒性、支持細(xì)胞移植，并能夠促進(jìn)組織重建、血管再生和細(xì)胞歸巢。Zang等［26］采用去污劑－聯(lián)合酶（detrgent－enzymatic method，DEM）法行氣管支架脫細(xì)胞處理，結(jié)果顯示通過(guò)恰當(dāng)?shù)拿摷?xì)胞處理，能夠完整去除氣管基質(zhì)相關(guān)抗原及細(xì)胞成分，同時(shí)保留有主要組織結(jié)構(gòu)及適當(dāng)?shù)纳锪W(xué)性能，且利于軟骨細(xì)胞和上皮細(xì)胞黏附生長(zhǎng)。

2．合成材料：自從進(jìn)行氣管替代開始，人工與合成材質(zhì)就被進(jìn)行研究與應(yīng)用。由于一些材料存在無(wú)血管化、完整性較差以及材料易遷移、僵硬、污染等不良特性，最終導(dǎo)致合成移植物的失敗。然而，由于合成材料也具有其重要的優(yōu)勢(shì)，如無(wú)須供體組織、可根據(jù)特殊患者的需求進(jìn)行修飾和定制、可被消毒等，使得各種合成材料在目前組織工程氣管研究中亦得到廣泛應(yīng)用［27］。目前，已用于組織工程氣管的合成支架包括聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）［28］、聚乳酸／聚乙醇酸（polyactic acid／polyglycolic acid，PLA／PGA）［29］、PLGA［30］、聚對(duì)苯二甲酸乙酯（polyethylene terephthalate，PET）［31］等。關(guān)注焦點(diǎn)主要在于生物相容性及免疫反應(yīng)。Luo等［29］研究發(fā)現(xiàn)，在兔體內(nèi)直接種植PLA／PGA支架材料發(fā)現(xiàn)有免疫應(yīng)答反應(yīng)，而在移植前2周將PLA／PGA結(jié)構(gòu)預(yù)先培養(yǎng)以便ECM形成及細(xì)胞生長(zhǎng)，能夠清除支架炎性酸性降解產(chǎn)物并使細(xì)胞開始在支架上生長(zhǎng)，從而阻止血細(xì)胞入侵而引起的免疫反應(yīng)。Tsao等［30］將軟骨細(xì)胞及骨髓干細(xì)胞種植在PLGA支架表面共培養(yǎng)，隨后植入兔腹壁帶蒂肌皮瓣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有軟骨形成、適合上皮細(xì)胞生長(zhǎng)并且具有較好的力學(xué)性能。

三、組織工程氣管培養(yǎng)

1．生長(zhǎng)因子：是組織工程氣管研究中細(xì)胞與支架培養(yǎng)的重要成分，通過(guò)恰當(dāng)藥物干預(yù)能夠促進(jìn)、活化局部或系統(tǒng)的自我再生能力，從而支撐移植物的完整性。一些研究將生長(zhǎng)因子添加到支架材料中使用，一種方法是將含有生長(zhǎng)因子的明膠微粒［32］或明膠海綿［33］覆蓋在氣管支架上；另一種方法是直接將生長(zhǎng)因子灌注到支架內(nèi)［34］。將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）直接灌注到支架材料中，能夠增強(qiáng)組織內(nèi)生性，并促進(jìn)其在絨毛膜尿囊膜內(nèi)的毛細(xì)血管形成［35］。在這些研究中應(yīng)用VEGF主要作用是為了增強(qiáng)血管生成。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，軟骨細(xì)胞是保持氣管力學(xué)性能的必須元素。軟骨細(xì)胞分化不同于軟骨基質(zhì)沉積，膠原Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ及聚集蛋白聚糖是軟骨細(xì)胞相關(guān)成分。這些軟骨特異性蛋白需要早期標(biāo)記SOX－9的表達(dá)。軟骨發(fā)育相關(guān)的一些生長(zhǎng)因子能夠有效促進(jìn)軟骨形成，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）［32］、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2（transforming growth factor－β，TGF－β2）［36］、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP－2）［33］等。

2．體外培養(yǎng)與體內(nèi)移植：在靜態(tài)或動(dòng)態(tài)條件下將細(xì)胞種植到支架表面，隨后在移植前將支架置于體外或體內(nèi)條件下培養(yǎng)。有研究顯示生物反應(yīng)器與靜態(tài)培養(yǎng)對(duì)脫細(xì)胞支架糖胺聚糖含量及軟骨細(xì)胞的生物力學(xué)性能無(wú)明顯影響［37］。

生物反應(yīng)器通過(guò)為細(xì)胞提供生物化學(xué)及物理調(diào)控信號(hào)而促進(jìn)組織工程基質(zhì)在體外發(fā)育、生長(zhǎng)、增殖、分化為適于體內(nèi)移植的細(xì)胞外基質(zhì)。與靜態(tài)相比，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)具有重要優(yōu)勢(shì)性：細(xì)胞在支架分布更加均勻，流體流動(dòng)有助于物質(zhì)傳遞、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)及廢物排泄，流體動(dòng)力學(xué)增強(qiáng)細(xì)胞新陳代謝與適當(dāng)分化，對(duì)組織生長(zhǎng)具有積極作用。Lin等［38］研究表明：用氣—液生物反應(yīng)器提供基本力學(xué)刺激對(duì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)分泌具有重要意義。Weidenbecher等［12］用定制的生物反應(yīng)器在體內(nèi)仿造兔子近端氣管獲得成功。然而，這種生物反應(yīng)器只適用于短小氣管移植物（1～2cm），且僅適用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)而無(wú)上皮細(xì)胞種植。Tan等［34］認(rèn)為將移植支架在生物反應(yīng)器預(yù)先培養(yǎng)，即在體外將移植物、種子細(xì)胞、培養(yǎng)基有機(jī)結(jié)合，培育成熟后進(jìn)行體內(nèi)移植，從而能夠提高術(shù)后早期存活率。

然而，上述方法體外細(xì)胞培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，需要大量藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（good manufacturing practice，GMP）認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、特殊操作技術(shù)以及高昂的費(fèi)用，且具有細(xì)菌及其他污染以及分化不穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)。Baiguera等［1］提出組織工程新觀念：原位體內(nèi)組織工程方法。這種觀念基于避免移植物任何體外操作，而將支架直接替代身體病損部位，并用受體自身充當(dāng)體內(nèi)生物反應(yīng)器，進(jìn)行體內(nèi)組織再生，從而避開體外細(xì)胞培養(yǎng)［39］。Jungebluth等［21］實(shí)驗(yàn)以豬自體作為生物反應(yīng)器，在術(shù)中將種子細(xì)胞及分化因子種植在支架表面進(jìn)行體內(nèi)原位移植，術(shù)后給予生物活性分子促進(jìn)外周細(xì)胞動(dòng)員及干細(xì)胞分化，有效減少移植物及細(xì)胞培養(yǎng)污染的風(fēng)險(xiǎn)，縮減處理時(shí)間，并具有良好的移植效果。

3．血管再生：組織工程失敗最常見的原因是植入組織污染或壞死。單一或復(fù)合組織未能持續(xù)存活，是由于缺乏有效的再血管化和由此造成的細(xì)胞移行受損所引起的壞死。Luo等［40］將人工合成組織工程氣管植入鄰近氣管部位的肌肉皮瓣4周，促進(jìn)體內(nèi)軟骨發(fā)育及移植物血管生成，隨后連同帶蒂肌瓣進(jìn)行原位移植，為移植物提供了穩(wěn)定血供，從而實(shí)現(xiàn)節(jié)段氣管缺損的長(zhǎng)期功能重建。

Schanz等［41］通過(guò)保留脫細(xì)胞小腸移植物的血管蒂，并從血管蒂灌注內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)血管新生。Kim等［42］在PLGA－膠原／聚丙烯假體覆蓋網(wǎng)膜（高度血管化組織），隨后植入圓周氣管缺損的犬體內(nèi)，在1個(gè)月后便形成適當(dāng)?shù)膬?nèi)徑及穩(wěn)定的表面。Baiguera等［43］研究發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞人類氣管基質(zhì)保留有部分血管再生因子bFGF，并行雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)顯示脫細(xì)胞基質(zhì)材料具有強(qiáng)烈的血管生成反應(yīng)。Sun等［44］研究也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。

四、氣管移植臨床研究

初期實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用為組織工程氣管臨床移植提供了可靠參考，證實(shí)了將組織工程氣管進(jìn)行臨床移植治療的可行性。Macchiarini等［45］利用脫細(xì)胞氣管基質(zhì)材料種植自體MSCs衍生的軟骨細(xì)胞和呼吸上皮細(xì)胞，置于特制生物反應(yīng)器預(yù)先增殖、分化，隨后植入一例支氣管軟化晚期患者體內(nèi)，成功完成世界首例組織工程氣管人體移植。Gonfiotti等［46］對(duì)此例患者進(jìn)行了5年動(dòng)態(tài)隨訪，結(jié)果顯示在未使用免疫抑制治療的情況下，該受體患者既沒(méi)有免疫學(xué)排斥反應(yīng)，也沒(méi)有血清學(xué)排異反應(yīng)指證。自體干細(xì)胞在生物反應(yīng)器種植及體內(nèi)分化過(guò)程中，并未出現(xiàn)致癌等風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞學(xué)分析顯示，移植氣管表面逐漸出現(xiàn)自體細(xì)胞生長(zhǎng)，未受殘余細(xì)胞明顯影響。

為促進(jìn)移植物血管再生，Delaere等［47］將一段長(zhǎng)8cm的捐獻(xiàn)氣管段預(yù)植入受體左前臂皮下，用筋膜和皮下組織包裹，隨后采用免疫抑制治療。皮下移植4個(gè)月后，氣管移植物內(nèi)側(cè)形成完整黏膜，隨后將4．5cm長(zhǎng)的氣管移植物進(jìn)行原位替代治療。結(jié)果顯示移植物具有良好的再血管化，并具有良好的移植效果。

2010年，Laurance等［48］報(bào)道了一例患先天性氣管狹窄的10歲男性患兒，急診情況下接受了組織工程氣管替代治療，在DEM脫細(xì)胞支架表面注入患者上皮細(xì)胞、骨髓MSC以及生長(zhǎng)因子，隨后以自體充當(dāng)生物反應(yīng)器，進(jìn)行體內(nèi)原位移植，術(shù)后局部應(yīng)用重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）刺激血管生成、應(yīng)用TGF－β促進(jìn)軟骨形成，并連續(xù)靜脈輸注rhEPO。Elliott等［49］對(duì)其進(jìn)行了2年動(dòng)態(tài)隨訪，結(jié)果顯示術(shù)后1周移植物觀察到血管再生，術(shù)后8周局部有強(qiáng)烈的中性粒細(xì)胞表達(dá)，術(shù)后12個(gè)月上皮細(xì)胞明顯恢復(fù)，術(shù)后18個(gè)月移植物具有較強(qiáng)的生物力學(xué)強(qiáng)度，此后無(wú)須任何藥物干預(yù)，2年后完全恢復(fù)正常。Berg等［50］對(duì)一例76歲喉中下部及氣管狹窄患者進(jìn)行了脫細(xì)胞組織工程氣管替代治療，移植后能夠有效提供氣道開放，術(shù)后1周氣管出現(xiàn)明顯的真菌感染，需要予以抗真菌藥物治療，術(shù)后第23天患者不幸去世。尸檢病理結(jié)果顯示，氣管移植物表面具有上皮生長(zhǎng)、血管新生及軟骨細(xì)胞與肌細(xì)胞表達(dá)。

Jungebluth等［51］采用人工生物納米復(fù)合材料氣管支氣管作為支架材料，與自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞一同在生物反應(yīng)器內(nèi)種植36h，隨后進(jìn)行原位移植，術(shù)后給予粒細(xì)胞集落刺激因子非格司亭（10μg／kg）和紅細(xì)胞生成素β（40 000IU）治療。結(jié)果顯示，患者術(shù)后未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥，在移植后5個(gè)月內(nèi)無(wú)異常癥狀和腫瘤生長(zhǎng)，并且部分移植物被基本健康的上皮覆蓋。以上研究結(jié)果提示間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞表型能夠增加外周細(xì)胞動(dòng)員，并上調(diào)rhEPO受體、抗細(xì)胞凋亡基因、miR－34和miR－449生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，從而促進(jìn)干細(xì)胞歸巢和細(xì)胞介導(dǎo)的創(chuàng)面修復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑及植入物的新生血管化。

通過(guò)將自體細(xì)胞種植在根據(jù)患者特異性解剖需求的仿生組織工程支架材料表面，隨后置于生物反應(yīng)器培育成熟或直接進(jìn)行體內(nèi)原位移植，并輔以生長(zhǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞動(dòng)員、分化、增殖，能夠有效進(jìn)行病損氣管替代治療，從而極大提高患者的生存質(zhì)量。

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（本文編輯：周珠鳳）

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Research progress of clinical translating tissue－engineered tracheal replacement

Sun Fei，Shi Hongcan．1Department of General Thoracic Surgery，Yangzhou University，Yangzhou 225001，China；2Taizhou Peoples Hospital，Taizhou 225300，China；3Jiangsu Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases，Yangzhou 225001，China

Shi Hongcan，Email：shihongcan＠hotmail．com

Objective There are a variety of trachea diseases with different clinical settings，which may extend from a surgical approach to total organ replacement．Tissue engineering involves modifying cells or tissues in order to repair，regenerate，or replace tissues in the body，which seems to be a promising approach for tracheareplacement．It has now become evident that the key factors for successful clinical tissue engineering include a scaffold or matrix of natural or synthetic origin，autologous or allogeneic cells，a bioreactor to mimic the physiologic environment（in vitro or in vivo），as well as sitespecific tissue protection by means of biomolecule／pharmacologic intervention．This review elaborates on the essential components of the tissue－engineering approach，and discusses the progress of the revolutionary trachea clinical transplantation．

Tissue engineering； Trachea； Clinical transplantation

10．3877／cma．j．issn．2095－8773．2015．02．003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81370118、81170014）；揚(yáng)州大學(xué)“高端人才支持計(jì)劃”資助項(xiàng)目（201431）

225001 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院胸外科1，泰州市人民醫(yī)院2，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3

史宏?duì)N，E－mail：shihongcan＠hotmail．com且上皮細(xì)胞分化傳代較快。將氣管上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，能夠促進(jìn)具有一定形態(tài)和功能的上皮再生［6］。Okano等［7］將僅覆蓋有成纖維細(xì)胞的生物工程支架植入兔氣管缺損部位后，能夠有效促進(jìn)氣管上皮再生。Mohd－Heikal等［8］將鼻上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，可促進(jìn)氣管呼吸上皮的生成，從而有效治療氣管缺損。Kin等［9］利用皮膚上皮細(xì)胞作為細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行氣管缺損重建，結(jié)果證實(shí)皮膚上皮細(xì)胞能夠在氣管表面保持活性達(dá)數(shù)月之久，并可有效分化為氣管上皮細(xì)胞。

2015－03－12）