王群，王擁軍

缺血性卒中由于病因、病程、阻塞部位、缺血程度及合并系統(tǒng)疾病的差異而導(dǎo)致臨床變異性很大，使得臨床研究需要較多的樣本量以避免混雜因素的影響，而這些可變量在動物模型中可以得到嚴(yán)格控制[1]。實(shí)驗(yàn)性腦缺血模型已經(jīng)被用來模擬人類卒中，它在認(rèn)識缺血性腦損傷的病理機(jī)制，發(fā)展新的治療策略方面發(fā)揮著重要作用[2]。缺血性卒中的治療策略可以分為兩個(gè)主要方面：溶栓和神經(jīng)保護(hù)。目前，重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）是唯一獲得美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的急性缺血性卒中的治療藥物，其溶栓療效首先在實(shí)驗(yàn)性動物模型中得到證實(shí)[3]。盡管在動物模型中，許多藥物顯示有神經(jīng)保護(hù)作用，但從動物到臨床的轉(zhuǎn)化研究中則未能顯示同樣的效果[4]，可能與動物模型不能真正代表疾病的狀態(tài)[5]或藥物在動物和患者身上的應(yīng)用差異有關(guān)[6]。

為了解決這一困惑，美國第一屆卒中治療學(xué)術(shù)工業(yè)圓桌會議（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR）規(guī)范了臨床前期實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對藥物治療的劑量、時(shí)間窗、動物選擇、模型選擇、生理指標(biāo)監(jiān)測和療效評定進(jìn)行了界定。臨床前研究應(yīng)首先在嚙齒類小型動物中進(jìn)行，而相關(guān)藥物研究還應(yīng)該考慮在多腦回的靈長類大動物中展開[7]。第六屆STAIR對此規(guī)范進(jìn)行了補(bǔ)充升級[8-9]：①消除在動物隨機(jī)化和療效評估中的偏見；②制訂動物入組和排除標(biāo)準(zhǔn)；③適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算動物樣本數(shù)；④公布潛在的利益沖突；⑤在年幼、健康和雄性動物完成起始實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)進(jìn)一步選擇雌性、老齡和伴隨高血壓、糖尿病和高血脂的動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[10]；⑥在動物研究中應(yīng)用與臨床相關(guān)的生物指標(biāo)。

一個(gè)可靠的缺血性卒中模型必須能夠誘導(dǎo)高度一致的腦損傷，避免其他因素影響結(jié)果判定，并能被廣泛利用。為此美國實(shí)驗(yàn)卒中協(xié)會于2009年為卒中的臨床前期實(shí)驗(yàn)公布了第一版卒中模型指南。在開始臨床前期卒中實(shí)驗(yàn)以前，要求遵守以下步驟[11]：①復(fù)習(xí)最近的STAIR標(biāo)準(zhǔn)以期達(dá)到最佳的研究設(shè)計(jì)；②選擇最適當(dāng)?shù)淖渲心Ｐ?；③確定卒中模型的參數(shù)，如預(yù)期的梗死灶大小和手術(shù)程序；④確定麻醉方法；⑤確定吸入氣體的成分；⑥確定插管和通氣的必要性和設(shè)置；⑦建立動脈血壓、血?dú)夂脱潜O(jiān)測；⑧建立體溫監(jiān)測和維持；⑨建立區(qū)域性腦血流監(jiān)測；⑩確定術(shù)后動物照料規(guī)程； 確定梗死灶體積測量的方法和時(shí)間； 確定功能缺失評估的實(shí)驗(yàn)方法和時(shí)間； 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整實(shí)驗(yàn)設(shè)置到最優(yōu)化； 以藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（good laboratory practice，GLP）評估實(shí)驗(yàn)的順應(yīng)性。

在可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭泻螘r(shí)開始評價(jià)，如何評價(jià)治療策略，針對這個(gè)問題，以往大多數(shù)的局灶性腦缺血損傷是在急性期即在缺血24 h檢查組織病理結(jié)果。然而由于遲發(fā)性腦損傷及神經(jīng)再生的發(fā)展，STAIR建議神經(jīng)保護(hù)劑的結(jié)果評價(jià)應(yīng)該包括急性期（1～3 d）和長時(shí)程（1～4周）評估[7]。評價(jià)缺血性神經(jīng)損傷的方法很多，STAIR建議至少應(yīng)該考慮兩種評價(jià)方法，即組織病理改變和功能反應(yīng)[7，12]。現(xiàn)對常用的評價(jià)方法做一介紹。

1 區(qū)域腦血流監(jiān)測

激光多普勒血流分析儀，可將激光探頭固定于顱骨上，只要保證激光探頭在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無位置移動及轉(zhuǎn)動，即可準(zhǔn)確地測定該部位的血流量[13-14]。應(yīng)用激光多普勒監(jiān)測局灶和全腦缺血的腦血流量，只有當(dāng)區(qū)域腦血流監(jiān)測平均降低70%～80%時(shí)才能符合模型成功標(biāo)準(zhǔn)[14-15]。

2 腦電圖記錄

腦電圖較神經(jīng)影像對腦缺血更敏感，反應(yīng)更早[16-17]。分別在動物顱骨的左右兩側(cè)對稱地放置腦電極，電極尖端穿過顱骨接觸硬腦膜，用牙科黏合劑固定，參考電極安置在鼻骨正中?？梢苑从匙钄鄠?cè)大腦中動脈供血區(qū)、非供血區(qū)以及對側(cè)相應(yīng)部位的腦電變化。若應(yīng)用腦電圖儀，可放置更多的電極，能更準(zhǔn)確地反映腦缺血的范圍以及程度。缺血區(qū)腦電圖出現(xiàn)波幅降低，頻率減慢。記錄并測量栓塞前、栓塞后和復(fù)灌后的腦電圖的波幅。通常將腦電圖變化依其幅度下降程度分為Ⅳ級。Ⅰ級：無改變，原水平的75%以上；Ⅱ級：輕度抑制，原水平的50%～75%；Ⅲ級：中度抑制，原水平的25%～50%；Ⅳ級：嚴(yán)重抑制，原水平的25%至等電位。

3 行為學(xué)評價(jià)

功能恢復(fù)是臨床藥物研究的最終目標(biāo)[18-19]，因此選取何種指標(biāo)評價(jià)腦缺血的程度及藥物的療效尤為重要。為了減少主觀偏見，采用盲法評估功能反應(yīng)很有必要[11]。必要時(shí)行為學(xué)測試應(yīng)該安排在腦缺血1個(gè)月后進(jìn)行[7]。

3.1 神經(jīng)功能缺損評估 模型制備成功后會出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀與體征，這些癥狀與體征反映了腦損傷與恢復(fù)的程度，可作為模型成功的標(biāo)志。神經(jīng)功能分級通常用來量化神經(jīng)功能缺失評估。其分級必須能夠檢查腦缺血誘導(dǎo)的運(yùn)動、感覺、運(yùn)動協(xié)調(diào)、自發(fā)性活動、反射、意識和警覺變化。一般采用Zea Longa[20]、Bederson[21]、Rogers[22]分?jǐn)?shù)量表法按受損程度分級。如Zea Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)為[20]：0分，無神經(jīng)損害的癥狀；1分，不能伸展對側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒：4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

3.2 大鼠記憶定位功能評價(jià) 動物腦中參與學(xué)習(xí)和記憶的部位不僅限于海馬，皮質(zhì)尤其是頂葉皮質(zhì)在動物的學(xué)習(xí)和記憶過程中起到非常重要的作用，術(shù)后頂葉皮質(zhì)的損傷會導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低。對此常用的檢測方法為水迷宮試驗(yàn)[23]。

3.3 運(yùn)動協(xié)調(diào)能力評價(jià) 運(yùn)動的調(diào)控是在運(yùn)動系統(tǒng)分級調(diào)控的基礎(chǔ)上通過反饋機(jī)制調(diào)整緩慢的運(yùn)動或姿勢的維持，通過前饋控制來控制快速的動作。常用的方法有攀繩實(shí)驗(yàn)[24]和肢體對稱試驗(yàn)[25]等。

4 腦表面血管的觀察

印度墨汁-明膠溶液心內(nèi)注射后隨腦血流入腦循環(huán)。在顯微鏡下可清晰顯示腦表面的血管結(jié)構(gòu)、大小及走向。結(jié)合激光多普勒監(jiān)測腦血流，可以剔除具有后交通動脈的動物，從而提高結(jié)果的一致性[15，26]。

5 梗死灶大小測量

動物斷頭取腦，冠狀位切片，迅速將腦片置于2，4，5-三苯基四氮唑染液中，37℃避光溫孵30 min，取出后置于10%甲醛溶液中避光保存24 h，經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫瑰紅色，梗死區(qū)為白色。可以對腦片進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析，觀察計(jì)算大鼠腦梗死灶的范圍[27]。

6 白細(xì)胞、血小板與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附反應(yīng)

腦微循環(huán)研究的進(jìn)展依賴于尖端技術(shù)的進(jìn)步?，F(xiàn)在通過高性能的熒光顯微鏡和高靈敏度的錄像和快速圖像處理系統(tǒng)（Intravital Fluorescence Microscopy and Video Analysis），已能對腦微循環(huán)內(nèi)循環(huán)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的作用進(jìn)行直接動態(tài)活體觀察、測量和分析[28-29]。一般先通過靜脈注射熒光物質(zhì)標(biāo)記白細(xì)胞或血小板，然后應(yīng)用該系統(tǒng)并結(jié)合顱骨窗技術(shù)，對軟腦膜微循環(huán)中白細(xì)胞或血小板的滾動（rolling）、黏附（adhesion）和其與內(nèi)皮細(xì)胞的接觸時(shí)間（adhesive contact time）進(jìn)行研究[30]，旨在了解神經(jīng)保護(hù)劑對腦缺血再灌注引起的腦微循環(huán)障礙的影響。

7 血腦屏障通透性

動物尾靜脈注射偶氮藍(lán)溶液，制作腦缺血模型后斷頭取腦。然后將腦放入盛有甲酸胺溶液的試管中浸泡。取出后用分光光度計(jì)進(jìn)行浸出液比色，測定光密度。再以標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，繼而計(jì)算出單位腦重的偶氮藍(lán)含量，以此評價(jià)血腦屏障通透性[31]。

8 腦水腫測量[32]

通過腦水腫的測量觀察腦缺血損傷后腦組織水腫情況。一般在缺血模型復(fù)制后24 h，快速剝出鼠腦，將左右大腦半球分別稱重，然后置烤箱內(nèi)烤干至恒重（5 d后兩次檢查）。分別稱量大腦半球干重，按以下公式計(jì)算大腦半球的含水量。含水量（%）=（濕重－干重）／濕重×100%。

9 組織病理改變

蘇木精伊紅染色（hematoxylin-eosin，HE）和甲酚紫（Cresyle violet）染色是傳統(tǒng)的組織病理檢查方法，可以精確可靠地區(qū)別梗死組織和正常組織，損傷神經(jīng)元和正常神經(jīng)元，是鑒別梗死灶和損傷神經(jīng)元的金標(biāo)準(zhǔn)[15，33-34]?？刹捎霉鈱W(xué)顯微鏡或電子顯微鏡研究鏡下的組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。Flouro-Jade B組織熒光染色陽性說明神經(jīng)元變性損傷。原位末端標(biāo)記（Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end Labeling assay，TUNEL）組織染色是確定神經(jīng)元程序性死亡（凋亡）的金標(biāo)準(zhǔn)[35]。微管相關(guān)蛋白-2免疫組織化學(xué)染色可以觀察神經(jīng)元突起的損傷狀況[36]。另外，利用雙光子顯微技術(shù)（2-photon microscopy）也可以在活體卒中動物模型中檢測到精細(xì)的突觸動態(tài)結(jié)構(gòu)變化[37]。

10 神經(jīng)生化測定

取腦組織稱重后制成勻漿，取離心后上清液采用相應(yīng)的方法，檢測各項(xiàng)指標(biāo)腦組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)、血管活性物質(zhì)及其他生物活性物質(zhì)[31，36]。亦可活體收集微透析液，與高效液相色譜或毛細(xì)血管電泳儀連用，觀測腦組織神經(jīng)遞質(zhì)等神經(jīng)活性物質(zhì)的動態(tài)變化[38]。

11 蛋白和基因表達(dá)的檢測

應(yīng)用免疫組化、蛋白印跡或蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測腦內(nèi)重要功能蛋白的含量[39-40]。采用原位聚合酶鏈反應(yīng)、原位雜交或其他雜交方法及基因組學(xué)方法，可觀察基因的表達(dá)[41-43]。不僅有利于對腦缺血病理生理機(jī)制的深入探討，而且有利于對神經(jīng)保護(hù)劑確切療效的評價(jià)。

12 神經(jīng)影像

國外研究[44]已將磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）彌散加權(quán)像（diffusion weighted imaging，DWI）和T1、T2加權(quán)像用于大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型研究。DWI在缺血損害的早期階段，就能區(qū)分缺血組織與正常組織，從而早期進(jìn)行模型評價(jià)[45]。MRI灌注加權(quán)像（perfusion weighted imaging，PWI）可檢測局部腦血容量、局部腦血流量等生理和血流動力學(xué)資料。DWI及PWI能在腦缺血早期顯示病灶大小和部位，DWI反映的是腦細(xì)胞損傷的病理狀態(tài)，PWI反映了血流動力學(xué)的變化[46]。且MRI具備無創(chuàng)傷性的特點(diǎn)，可以動態(tài)觀測大鼠腦缺血損害的時(shí)間變化趨勢以及梗死灶的大小。近年來，分子圖像廣泛應(yīng)用于嚙齒類動物腦缺血研究。采用MRI分子圖像技術(shù)成功在小鼠MCAO模型中檢測到血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表達(dá)，腦的預(yù)適應(yīng)保護(hù)減少了腦缺血再灌注誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)，改善了行為異常[47]。提示分子MRI技術(shù)可用于病情評估及治療監(jiān)測。最近，微小計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-computed tomography，micro-CT）被應(yīng)用于嚙齒類動物腦缺血研究[48]，其圖像的空間和對照分辨率及用于梗死灶體積測量的精確性與MRI相當(dāng)[49]。

鑒于缺血性腦血管疾病發(fā)病率高且是現(xiàn)今醫(yī)藥研究課題的重點(diǎn)、熱點(diǎn)，我們在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究以及評價(jià)各類藥物、化合物的藥理作用，分析其作用機(jī)理的研究中，難免會經(jīng)常使用各種缺血性腦血管疾病動物模型和不同評價(jià)缺血性神經(jīng)損傷的方法。模型選擇必須按照課題研究的要求，選定與人類腦缺血性疾病發(fā)病機(jī)制等接近的動物模型，確定對臨床研究或藥效藥理研究有明確指導(dǎo)意義的評價(jià)缺血性神經(jīng)損傷的指標(biāo)，以達(dá)到研究目的。全面考慮各種因素對模型的影響，建立重復(fù)性好，生理指標(biāo)控制嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ筒⑦x用急性期和長時(shí)程評價(jià)指標(biāo)，是研究缺血性腦損傷及腦保護(hù)必不可少的工具。

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