■ 鮑偉光 王占彬 顧憲紅 郝 月 崔艷軍

（1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471003）

生物體在代謝過程中，會產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基通常不會導致組織細胞的損傷，機體自身依靠體內的抗氧化防御系統(tǒng)，主要包括抗氧化酶類和非酶類的抗氧化劑，可以保護機體組織和細胞，防止自由基造成的損傷[1-4]。當機體細胞內產(chǎn)生的自由基的水平高于細胞的抗氧化防御能力時，氧化還原狀態(tài)失衡，過量的自由基存在于組織或細胞內，即誘發(fā)氧化應激，并導致氧化損傷[5]。器官和組織對氧化應激的易感性依賴于它的抗氧化系統(tǒng)的狀態(tài)和氧化與抗氧化在細胞內的動態(tài)平衡。

腸道作為一個機體與外界相通的器官。不僅是體內重要的營養(yǎng)物質消化、吸收、免疫和內分泌器官，還可以阻止腸腔內的毒素、細菌、抗營養(yǎng)因子等有害物質進入體內對機體造成損傷，起到一個重要的屏障功能[6]。腸道時刻與外界相通，接觸外界微生物的次數(shù)也最多，因此也更容易產(chǎn)生氧化應激，造成氧化損傷。

硫辛酸（lipoic acid，LA）作為一種高效的抗氧化劑可以減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，減弱DNA的氧化損傷，抑制脂質過氧化，并能很大程度地改善體內抗氧化防御系統(tǒng)，對氧化應激引起的疾病有顯著的緩解作用[7]，在生物體內可以轉化為還原型的二氫硫辛酸，并能夠再生為內源性抗氧化劑，LA具有雙硫五元環(huán)結構，具有顯著的親電性和與自由基反應的能力。近幾年，國內外學者深入研究腸道氧化損傷的機制，根據(jù)氧化損傷理論開發(fā)有針對性的飼料添加劑已成為研究熱點之一。

1 自由基與氧化應激

20世紀30年代，氧自由基（oxygen derived free radicals，OFR）首先被Pauling發(fā)現(xiàn)并將其命名為超氧化物[8]。隨后，Mann等[9]從牛血液和肝臟純化出超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），命名為“erythrocuprein”，“hepatocuprein”或“cytocuprein”，并證明是未知功能的銅結合蛋白，純化物完全基于銅的含量。當時并不知道OFR能在動物機體中產(chǎn)生，并可能導致各種疾病。直到20世紀60年代末，OFR才逐漸被大家所認識，1968年McCord等[10-11]發(fā)現(xiàn)紅細胞SOD能夠清除“Pauling自由基”，并提出SOD存在于幾乎所有的哺乳動物細胞中，還發(fā)現(xiàn)超氧陰離子（O2·-）是動物機體正常的代謝產(chǎn)物。1973年Babior等[12]發(fā)現(xiàn)，一些與炎性反應過程相關的組織損傷可以歸因于嗜中性粒細胞產(chǎn)生的O2·-，并且證明SOD具有保護細胞損傷的作用。1981年Granger等[13]研究表明，缺血/再灌注貓的腸組織損傷是由過多的ROS產(chǎn)生引起的。隨著人們對自由基的不斷探索，氧化應激也逐漸被大家所重視。

1.1 OFR及ROS產(chǎn)生途徑

自由基是指單獨存在的，具有不配對價電子的離子、原子、分子基團。ROS是指氧的一些代謝產(chǎn)物和某些反應的含氧產(chǎn)物，其特點是含有氧元素，化學性質較氧分子活潑。ROS中的一些是自由基，其不配對的電子位于氧，稱為OFR；另一些則是非自由基的含氧物，非自由基ROS的特點是可以在自由基反應中產(chǎn)生，同時還可以直接或間接地觸發(fā)自由基反應。在生命活動的氧化代謝過程中會不斷地產(chǎn)生各種OFR，其中O2·-、羥自由基（·OH）和羧自由基（ROO·）是三種具有代表性的自由基。O2·-形成最早，而·OH作用最強。自由基的產(chǎn)生途徑如圖1所示。

圖1 ROS產(chǎn)生途徑

1.2 氧化應激的概念及危害

氧化應激是指機體或細胞內OFR的產(chǎn)生和消除的平衡被打破，或外源性氧化物質過量攝入，導致ROS在體內或細胞內過量蓄積，引起細胞毒性的病理過程，是心肌缺血/再灌注損傷的重要原因之一[14]。氧化應激通過其氧化過程調節(jié)生理過程和生化反應，同時也造成細胞、亞細胞結構、生物大分子的氧化損傷，因此同時涉及到廣泛的生理和病理過程。袁施彬[15]通過給仔豬飼喂氧化魚油和腹腔注射diquat都可誘導氧化應激，建立氧化應激的動物模型，其氧化應激效應表現(xiàn)為生產(chǎn)性能和養(yǎng)分利用率降低，組織抗氧化酶活力和總的抗氧化能力下降，血相也有相同的改變，組織細胞脂質、DNA過氧化損傷加劇，機體免疫能力下降。李麗娟[16]研究發(fā)現(xiàn)氧化應激引起腸黏膜損傷，使腸黏膜標志酶堿性磷酸酶、鈉鉀ATP酶、蔗糖酶活性極顯著下降，引起腸系膜BBMV和BLMV葡萄糖轉運能力極顯著下降。Deng等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激能夠顯著影響仔豬的免疫能力。氧化應激能夠破壞腸道屏障功能，引起仔豬腹瀉，同時造成仔豬消化吸收功能的下降。Tanida等[18]研究表明，自由基能夠攻擊腸黏膜蛋白，造成養(yǎng)分轉運載體、消化酶等一些重要的功能性蛋白活性降低甚至喪失。Kawauchiya等[19]發(fā)現(xiàn)氧化損傷導致腸上皮細胞緊密連接相關的蛋白質表達量下降。Circu等[20]利用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導腸道細胞發(fā)生調亡，造成腸道屏障功能降低，損傷腸道的消化吸收功能。

1.3 機體的抗氧化系統(tǒng)

機體處于正常狀態(tài)時，體內的氧化-抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，體內自由基的產(chǎn)生能夠得到及時的清除，所以其含量就會比較穩(wěn)定，反之則會異常。機體的抗氧化系統(tǒng)包括：抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）和非酶類抗氧化物質（維生素E、維生素C、有機硫化物等）。Ansaldo等[21]研究魚的消化腺體在不同劑量機油污染造成的氧化應激試驗中，測定抗氧化酶、氧化損傷和它們的適應能力，結果表明SOD、CAT和GST的活性隨機油劑量的增加而增加，GSH-Px活性增加極顯著。

2 氧化應激與腸道損傷

腸道黏膜完整性的維持主要由谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（GSH/GSSG）和半胱氨酸/胱氨酸（Cys/CySS）偶聯(lián)的氧化還原狀態(tài)調控，當它們處于正常狀態(tài)時，腸道才能保證營養(yǎng)物質的正常吸收、黏液層的正常流動和腸道微生物的多樣化。OFR導致消化道疾病的主要原因是：①OFR直接作用細胞的大分子；②OFR作為細胞內信息轉導信號誘發(fā)細胞漿內核轉錄因子（如NF-κB）激活，引起核內有關的基因轉錄增加，是很多急性、慢性炎癥、細胞凋亡及免疫失調等疾病發(fā)生發(fā)展的分子生物學基礎。

2.1 氧化應激對腸道氧化還原狀態(tài)的影響

在機體內環(huán)境中，脂質、蛋白質和核酸是OFR攻擊的主要目標。過氧化反應可以使脂質、蛋白質、核酸的功能喪失，從而影響細胞膜的完整性、酶的活性、受體、轉運蛋白等蛋白質和核酸的正常功能[22]，并可引起衰老、腸炎等一系列疾病。氧化還原信號的傳遞是具有特異性的，單個氧還原體系分別獨立存在于線粒體、細胞核、內質網(wǎng)和細胞質基質中。任何一個氧化還原體系被破壞就會導致腸道黏膜的氧化應激，進而導致腸道病變。陳群等[23]研究表明，小腸上皮細胞添加GSH后使得SOD和CAT的酶活性一定程度地提高，主要是GSH清除了部分自由基，使得自由基鈍化抗氧化酶能力減弱。Srigiridhar等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，鐵可以導致腸道MDA和蛋白質羰基含量顯著升高。Troost[25]、張志浩[26]也有類似研究。宋小珍等[27]在斷奶仔豬上的研究表明，氧化應激使豬腸道SOD、GSH-Px的含量顯著降低，而MDA的含量顯著上升。Zhang等[28]的研究結果表明，LPS引起的氧化應激可以導致肉雞GSH-Px、T-SOD活性降低和MDA含量增加。從這些文獻可以看出，氧化應激破壞了動物腸道氧化-抗氧化平衡狀態(tài)，使腸道氧化酶活性改變，因此檢測腸道中SOD、GSH-Px、T-SOD、MDA等的含量可以間接的評價動物腸道損傷的程度。

2.2 氧化應激對腸道完整性的影響

腸道屏障的完整性通常用腸道通透性和細菌移位來表示。腸道通透性是指某些分子物質通過簡單擴散方式穿過腸道黏膜上皮的難易程度。當腸道屏障受到損傷尤其是緊密連接受到損傷時，腸道的通透性就會立刻升高。細菌移位是指腸道內的細菌從腸道黏膜轉移到血液和免疫淋巴結的過程，一般用單位腸系膜和脾臟勻漿后培養(yǎng)細菌的菌落數(shù)來表示。常用以下方法來評價腸道的完整性：①觀察腸道組織切片，檢測腸道絨毛高度、隱窩深度；②檢測血漿中LPS和D-乳酸水平；③檢測緊密連接蛋白（occludin）和胞質蛋白（ZO-1）表達量。

動物腸道絨毛是機體消化吸收養(yǎng)分的主要部位，絨毛結構的改變將直接影響營養(yǎng)物質的消化和吸收。趙立柯等[29]研究表明，氧化應激引起腸道絨毛高度降低，隱窩深度加深，從而導致腸道消化吸收能力的下降。Bollengier等[30]的研究指出，氧化應激使幼齡母雞的空腸絨毛高度、絨毛表面積和絨毛體積顯著降低，從而影響腸道的功能；寧章永等[31]也有類似發(fā)現(xiàn)，試驗結果表明氧化應激導致肉雞的腸道發(fā)生了病理學變化，腸道的形態(tài)學結構受到了嚴重破壞，絨毛出現(xiàn)斷裂、充血、缺失等現(xiàn)象。因此，通過觀測腸道切片可以直接評價腸道的完整性。除此之外，檢測血漿中LPS和D-乳酸水平也能間接的評價腸道的完整性[32]。

緊密連接是腸上皮細胞間的主要連接方式，在維持腸上皮細胞極性和調節(jié)腸黏膜屏障的通透性中發(fā)揮著重要的作用。Furuse等[33]認為occludin是集中在腸道緊密連接上的跨膜蛋白，并在細胞膜的外側與ZO相連，形成occludin-ZO蛋白結合體，從而發(fā)揮其生理功能。段云等[34]研究表明，高原缺氧對腸黏膜屏障有損害作用，降低了occludin的蛋白表達量；于瑋等[35]研究指出氧化應激狀態(tài)下雞腸道occludin蛋白表達量顯著下降；Han等[36]研究指出低氧狀態(tài)下激活TLR4/NF-κB信號通路，構成緊密連接復合體主要成分occludin蛋白表達量下調。咼于明等[32]也有類似的研究結果。通常情況下，occludin的蛋白表達量作為評價腸道通透性的重要指標。

2.3 氧化應激激活TLR4/NF-κB信號通路引起腸道細胞凋亡的研究

Toll受體4（toll-like receptor 4，TLR4）作為腸道固有免疫的重要組成部分，連同腸絨毛構成了腸道對細菌識別的第一道屏障，它既是細胞表面免疫識別受體，又是胞內跨膜信號傳導分子。在氧化應激引起的腸源性敗血癥發(fā)展過程中，LPS是腸道上皮細胞TLR4的強效激動劑，當TLR4與特異性配體LPS結合后，可通過MyD88依賴和TRIF依賴的兩條途徑，激活IRAKs、TRAFs、TAK1等細胞內信號分子并最終激活通路下游的核因子κB（NF-κB）從基因水平調控TNF-α、caspase-3、IL-1β、IL-2、IL-8等多種炎癥介質的表達[37-39]，在局部可引起腸黏膜上皮細胞凋亡，參與腸道組織器官的損傷，同時又可以作用于遠隔器官，引起更大范圍的全身炎癥反應。

Fukata等[40]研究發(fā)現(xiàn)TLR4可以促進上皮細胞增殖并抑制腸道細菌的移位，但同時實驗證明[41-42]，TLR4缺陷小鼠與野生型小鼠相比，結腸炎所致的腸道上皮損傷程度減輕，細胞因子及巨噬細胞、中性粒細胞浸潤減少。Soares等[43]研究表明，TLR4可能在腸道損傷后細菌移位引發(fā)的炎癥反應中起到至關重要的作用。La Serre等[44]報道指出，肥胖易感的SD大鼠在高脂飲食喂養(yǎng)后腸道TLR4表達上調，并伴隨著occludin在細胞層面上的重新分布，免疫組化顯示occludin從胞膜轉移到胞質致使增加，進而引起屏障功能的損傷。由此可見，研究氧化應激激活TLR4/NF-κB信號通路引起的腸道屏障功能損傷和細菌移位以及腸道細胞凋亡具有重要的意義。

3 LA對動物腸道氧化損傷的干預作用

LA又名二氫硫辛酸，系統(tǒng)命名為1，2-二硫戊環(huán)-3-戊酸，分子式為C8H14O2S2，相對分子質量為206.33；通常為白色晶體，略有異味；分子中只有一個手性碳，具有旋光性。LA具有雙硫五元環(huán)結構，具有顯著的親電性和與自由基反應的能力。其結構如圖2所示。

圖2 LA結構式

3.1 與金屬離子絡合

Cu2+、Hg2+等過渡金屬離子及砷等元素在機體的氧化反應過程中起催化作用，如果過量攝入容易導致組織損傷[45]。LA及二氫硫辛酸可以與這些金屬離子絡合，阻斷其催化作用，降低機體的氧化作用，抑制自由基的形成。研究表明[46]，當LA與砷的摩爾比為8∶1時，可以完全防止小鼠砷中毒。

3.2 修復受損細胞

LA不僅對長時間的氧化損傷有較強抵抗作用，而且對VC和VE不能修復的、較嚴重的細胞氧化損傷也可進行有效修復[47]。并且由于LA具有脂溶性，二氫硫辛酸具有水溶性，二者結合可以深入到細胞中的各個部位而起作用，而只具有脂溶性或水溶性的抗氧化劑卻沒有這一功能。

3.3 影響基因表達

NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ鏈基因的增強子κB序列特異性結合的核蛋白因子，LA和二氫硫辛酸能夠調節(jié)NF-κB的激活。并且LA能夠阻止HIV復制，影響C-fos類原癌基因的表達，對自由基代謝過程中的中間產(chǎn)物H2O2造成的細胞DNA氧化損傷具有明顯的保護作用[48]。

3.4 LA修復動物腸道氧化損傷

Guven等[49]報道，LA可以通過清除ROS和RNS對大鼠小腸缺血性再灌注損傷進行修復。李軍華等[50]報道，LA通過抗氧化作用對UC大鼠具有保護作用。王艷艷等[51]指出，高脂日糧引起的小鼠氧化應激及消化系統(tǒng)功能障礙可以通過LA進行緩解。王嘯春等[52]報道，LA能夠修復OFR引起的大鼠小腸上皮細胞損傷。李武等[53]研究表明，LA通過直接清除自由基以及提高抗氧化通路相關功能基因的表達水平解除氧化應激而有助于防治高脂引發(fā)的腸道功能損傷。在氧化應激誘導的細胞損傷的通路中，細胞膜電位下降，Caspase-3激活、CytC釋放、Bax和Bcl-2等的表達引起廣泛關注。Powell等[54]報道，小腸細胞系DLD-1高糖損傷組的GSH濃度與對照組相比明顯降低，添加LA后細胞中GSH含量恢復正常；同時發(fā)現(xiàn)高糖損傷組iNOS啟動子基因表達上調，而LA損傷修復組顯著降低了iNOS啟動子表達上調量，在轉錄水平證明了LA對小腸細胞氧化損傷的修復作用。

LA可以通過減輕免疫抑制力，調整氧化應激下腸道菌群來減少腸道氧化損傷。張蓉等[55]研究指出，小鼠消化道氧化應激引起腸道微生物區(qū)系的紊亂，LA可以通過調整腸道氧化還原狀態(tài)使微生物區(qū)系恢復正常。Cui等[56]進一步從腸道免疫細胞受體基因表達量驗證LA的抗氧化作用，高脂飼糧能引起慢性氧化損傷，抑制腸道相關淋巴細胞的信號轉導，導致了對黏膜免疫力的抑制，而LA能夠通過從轉錄水平修復相關基因，腸道氧化損傷和免疫抑制反應。這些結果表明具有脂水兩親特性和高效抗氧化能力的LA，為LA作為飼料添加劑的進一步開發(fā)提供了自由基生物學方面的根據(jù)，已成為腸道氧化損傷干預機理研究較為成熟的一種抗氧化劑。

4 小結

近年來，動物的健康和福利受到了越來越多的關注，科學家們?yōu)榇颂岢隽搜芯繎さ男履Ｐ?。氧化應激作為動物胃腸道疾病的誘因也備受人們的關注，研究氧化應激對動物胃腸道損傷的機制機理已成為當今的熱門課題，同時，進一步開發(fā)實用的飼料添加劑以有效地緩解氧化應激顯得尤為重要。