董 坤 常 靜 祖可佳 王欣欣 劉 暉 馮驥良 呂福東

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院病理科，北京 100069

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在男性癌癥中排名第5 位（523 000 例/年，所有癌癥中占7.9%），在女性癌癥中排名第7 位（226 000 例/年，所有癌癥中占6.5%）[1]。 臨床初篩HCC 首選肝臟超聲及血清甲胎蛋白（AFP）檢測(cè)，有肝硬化的患者血清AFP＞200 ng/mL時(shí)強(qiáng)烈提示HCC 可能， 但并不是所有HCC 患者的AFP 水平都會(huì)升高，而且AFP 升高并不單純出現(xiàn)在HCC中[2]。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，無論血清中還是組織中AFP的敏感性及特異性均不高[3]。 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）是近年來比較熱門的一種用于肝細(xì)胞癌診斷的標(biāo)志物，因其敏感性好，特異性高，被認(rèn)為可能是一種新型癌胚因子[4]。 GPC3 在胚胎肝臟中表達(dá)豐富，但是在成人正常肝臟中無表達(dá)[5]。 有研究發(fā)現(xiàn)GPC3 在HCC 中表達(dá)的敏感性為68%～72%，特異性為92%[1]。但是GPC3 在不同分化程度的HCC 中敏感性差異的研究較少。 ki67 作為腫瘤細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，常用于即時(shí)反映腫瘤增殖細(xì)胞的數(shù)量，判斷腫瘤的惡性程度及預(yù)后[6]。 本研究的目的是通過對(duì)不同分化程度的肝細(xì)胞癌組織中GPC3 和ki67 表達(dá)的情況進(jìn)行分析，研究GPC3 在不同分化程度的HCC 中表達(dá)的強(qiáng)度，同時(shí)研究不同分化程度的HCC 中GPC3 和ki67 的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集2010 年7 月～2014 年7 月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院病理科的HCC 部分肝切除標(biāo)本共90 例，其中高分化30 例，中分化30 例，低分化30 例。

1.2 材料和試劑

GPC3， ki67 抗體及二抗PV6000 均購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

所有標(biāo)本先經(jīng)過10%的甲醛固定后，取材，按脫水、透明、浸蠟、包埋程序處理，4 μm 連續(xù)切片，之后進(jìn)行HE 染色，肝癌病理診斷經(jīng)2 名副主任以上醫(yī)師復(fù)診。 HCC 的鏡下分級(jí)采用WHO 推薦HCC 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]。1.3.1 染色方法 采用EnVision 兩步法，上述切片經(jīng)烤片、脫蠟，梯度乙醇由高至低入水，入3%過氧化氫5 min，PBS 緩沖液浸透3 次，每次5 min，放入pH 6.0 檸檬酸緩沖液中高溫高壓修復(fù)：高壓鍋噴氣后，加熱2 min，變中火2 min，關(guān)火后燜10 min，放入冷水中冷卻至37℃，之后入PBS 緩沖液洗3 次，加GPC3 一抗（鼠抗人單克隆抗體），4℃冰箱過夜，PBS 緩沖液浸3 次，每次5 min，加二抗PV6000（通用型抗體）37℃10 min，PBS 緩沖液浸3 次，DAB 顯色，PBS 液終止染色，甲醛逐級(jí)由低至高濃度脫水至入二甲苯，封片。 ki67 染色步驟同GPC3。

1.3.2 判斷方法 ki67 染色位于細(xì)胞核，免疫組化診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色為陽性；每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野（400×），每個(gè)視野數(shù)100 個(gè)細(xì)胞， 按陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：診斷分級(jí)為≤5%，＞5%～30%，＞30%～50%，＞50%。GPC3 染色位于胞漿及細(xì)胞膜。 免疫組化診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色為陽性；每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野（400×），每個(gè)視野數(shù)100 個(gè)細(xì)胞， 按陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：“-”：＜5%的腫瘤細(xì)胞著色；“1”：5%～25%的腫瘤細(xì)胞著色；“2”：＞25%～50%的腫瘤細(xì)胞著色；“3”：＞50%～75%的腫瘤細(xì)胞著色；“4”：＞75%的腫瘤細(xì)胞著色；其次染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色為0 分；淡黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分。最后將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分乘積作為每例染色的綜合評(píng)分，0 分為（-），1～2 分為（+），3～5 分為（++），6～9 分為（+++），≥10 分為（++++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 90 例患者一般資料情況

90 例患者，年齡38～84 歲，平均（53.7±0.1）歲；男68 例，女22 例；HBsAg 陽性66 例，陰性24 例；腫瘤直徑≤5 cm 者46 例，＞5 cm 者44 例；腫瘤單發(fā)者74 例，多發(fā)者16 例；伴腫瘤壞死者30 例，無腫瘤壞死者60 例；伴脈管內(nèi)癌栓者18 例，無脈管內(nèi)癌栓者72 例；有肝硬化背景者56 例，無肝硬化背景者34 例。 GPC3的表達(dá)強(qiáng)度與患者的年齡、性別、HBsAg 陽性與否、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤壞死、脈管內(nèi)癌栓及肝硬化無關(guān)（P ＞0.05）。 見表1。

2.2 不同分化程度的HCC HE 組織染色

高分化HCC 顯示細(xì)胞輕度異型，肝板結(jié)構(gòu)紊亂，可見腫瘤細(xì)胞假腺樣排列（圖1A，封三）；中分化HCC顯示腫瘤細(xì)胞中度異型，核漿比增加，腫瘤細(xì)胞呈假腺樣或細(xì)梁狀排列（圖1B，封三）；低分化HCC 顯示腫瘤細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核大，核膜不規(guī)則，可見核仁，腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)巢狀或?qū)嵭云瑺钆帕校▓D1C，封三）。

圖1 不同分化程度的HCC 組織HE 染色（見內(nèi)文第24頁）

2.3 GPC3 在高、中、低分化HCC 組織中的表達(dá)

GPC3 在HCC 中的著色在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，大部分肝細(xì)胞癌是混合著色，HCC 分化越低，GPC3 著色越強(qiáng)（圖2，封三）。 不同分化的HCC 組織中GPC3 表達(dá)的強(qiáng)度及陽性率性況具體見表2。 高分化的HCC中GPC3 陽性率為50.00%，其中“+～++”陽性率為43.33%，“+++～++++”陽性率為6.67%；中分化的HCC中陽性率均為83.33%，其中“+～++”陽性率為60.00%，“+++～+++++”陽性率為23.33%；低分化的HCC 中陽性率為90.00%，其中“+～++”陽性率為23.30%，“+++～++++”陽性率為66.67%。 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：GPC3在低分化的HCC 中的陽性率明顯高于中分化及高分化，并且中分化高于高分化，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 低分化組中GPC3 的強(qiáng)陽性（+++～++++）率明顯高于中分化及高分化，并且中分化明顯高于高分化，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 說明GPC3的表達(dá)與HCC 的分化程度有關(guān)。

圖2 GPC3 免疫組化（SP 法）結(jié)果（見內(nèi)文第24頁）

表1 GPC3 表達(dá)強(qiáng)度與一般資料的關(guān)系（例）

表2 不同分化組中GPC3 表達(dá)的強(qiáng)度及陽性率情況（例）

2.4 Ki67 在高、中、低分化肝細(xì)胞癌中的表達(dá)

ki67 為細(xì)胞核著色，在HCC 組織中的陽性率為90%（81/90），在周圍肝組織內(nèi)未見表達(dá)（圖3，封三）。不同化為的HCC 組織中ki67 的表達(dá)情況具體見表3，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示： 低分化組中ki67 的表達(dá)明顯高于中分化及高分化組， 并且中分化組高于高分化組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），說明ki67 的表達(dá)與HCC 的分化程度有關(guān)。

圖3 ki67 免疫組化（SP 法）結(jié)果（見內(nèi)文第25 頁）

表3 不同分化HCC 中ki67 的表達(dá)情況（例）

2.5 不同分化組中GPC3 的表達(dá)與ki67 增殖指數(shù)之間的關(guān)系

Spearman 相關(guān)分析顯示：GPC3 的表達(dá)與ki67 表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.551，P = 0.000），即HCC 中GPC3表達(dá)越強(qiáng)，ki67 表達(dá)越強(qiáng)。

3 討論

GPC3 編碼的蛋白屬于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，通過糖基磷脂肽肌錨蛋白錨定在細(xì)胞表面。 GPC3 在細(xì)胞的生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用，該基因突變可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡失衡，且在多種腫瘤和細(xì)胞株中常常發(fā)生甲基化[9]。 在HCC 組織中GPC3 表達(dá)增多，并且在HCC 形成過程中分泌入血[10]。 有的研究提示在肝細(xì)胞癌的特異性表達(dá)率為52.5%～85%， 而在肝臟良性病變包括：肝硬化（cirrhosis）、肝細(xì)胞腺瘤（hepatocellular adenoma，HCA）及局灶結(jié)節(jié)狀增生（focal nodular hyperplasia，F(xiàn)NH）中的表達(dá)率為0[5]；而且GPC3 的特異性及敏感性均高于AFP，血清中GPC3 mRNA 的表達(dá)明顯高于AFP（71.7% 比51.3%），尤其是當(dāng)腫瘤直徑小于3 cm 時(shí)GPC3 的表達(dá)更是高于AFP 的表達(dá)（77%比43%）[4，11-12]。 由此分析GPC3 可以作為一個(gè)特異性免疫標(biāo)志物來鑒別肝細(xì)胞癌和肝外腫瘤及肝臟良性病變。 研究結(jié)果顯示GPC3 的著色強(qiáng)度與腫瘤的分化程度有關(guān)，GPC3 在HCC 中的陽性率為74.4%，分化越低表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)，分化越高表達(dá)強(qiáng)度越低，總體陽性率也隨分化程度的降低而升高。 盡管現(xiàn)在關(guān)于GPC3 的表達(dá)與HCC 生存率的研究較少[9]，但是諸多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的分化程度與預(yù)后相關(guān)，分化越差預(yù)后越差，GPC3 在HCC中的表達(dá)與分化程度呈負(fù)相關(guān)[13-14]，即分化越差表達(dá)越強(qiáng)。 以上的研究提示GPC3 的表達(dá)與HCC 的預(yù)后相關(guān)，GPC3 的表達(dá)強(qiáng)度對(duì)HCC 的預(yù)后可能有提示作用。 有學(xué)者對(duì)5 組關(guān)于HCC 的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行Meta 分析，發(fā)現(xiàn)GPC3 的高表達(dá)與患者的總體生存率（OS）及無病生存率（DFS）相關(guān)，HCC 組織中高表達(dá)GPC3 預(yù)示手術(shù)后DFS 較差[9]。 又有研究發(fā)現(xiàn)低水平表達(dá)GPC3 可以增加手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[15]。

ki67 基因定位于第10 號(hào)染色體，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核， 由相對(duì)分子量為345 000 和395 000 兩條肽鏈組成，其在G1后期開始出現(xiàn)，在S 期和G2期逐漸升高，M 期達(dá)高峰， 有絲分裂結(jié)束后降解消失，G0期無表達(dá)[16-17]。因此，ki67 表達(dá)的高低對(duì)評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖活性，研究腫瘤的生物學(xué)行為和預(yù)后有重要意義。 本研究中，HCC 組織中ki67 陽性表達(dá)率為90%，在周圍肝組織內(nèi)未見表達(dá)，說明HCC 的增殖活性明顯大于非腫瘤的肝細(xì)胞；HCC 分化越差，ki67 增殖指數(shù)越高，這與HCC 的浸潤性生長、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等生物學(xué)行為密切相關(guān)。

目前，GPC3 的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)之間的關(guān)系目前研究尚少。 有研究發(fā)現(xiàn)GPC3 可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，作為致癌基因GPC3 可以使c-Myc 原癌基因活化，從而激活多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，目前研究較多的是Wnt 及IGF 途徑[9]。 本研究在不同分化程度的HCC 中GPC3 與ki67 提示的細(xì)胞增殖指數(shù)呈正相關(guān)，即GPC3 表達(dá)強(qiáng)度越高，ki67增值指數(shù)越高，說明GPC3 對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為有一定的提示作用， 即GPC3 表達(dá)越強(qiáng)，HCC 的增殖活性越高，腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的概率越高，患者的預(yù)后越差。

HCC 對(duì)化療藥物不敏感，除了手術(shù)切除，目前尚無有效的系統(tǒng)的治療手段。GPC3 特異性的表達(dá)于HCC中，或許它可以成為HCC 靶向治療的分子靶點(diǎn)[18-19]，目前Ⅰ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行[20]。 本研究對(duì)不同分化程度的HCC 表達(dá)GPC3 的敏感性的研究， 可能會(huì)為將來分子靶向治療提供篩選條件。

綜上所述， 聯(lián)合檢測(cè)HCC 組織中GPC3 和ki67增殖指數(shù)的表達(dá)有著重要的臨床意義，不但有利于揭示HCC 發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，更重要的是能夠?qū)颊哳A(yù)后的評(píng)價(jià)提供重要幫助。對(duì)GPC3 在不同分化程度HCC 中敏感性的研究也為HCC 的靶向治療提供參考依據(jù)，從而幫助提高療效，延長患者的生存期。

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