孫 儀 段永娟 李 芳，2 呂軍強(qiáng) 白 潔 劉漢芝 胡 曉

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院 血液學(xué)研究所實驗血液學(xué)國家重點實驗室，天津 300020；2.山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗診斷中心，山東濟(jì)南 250013

真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）是一種起源于克隆性造血干細(xì)胞的骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）[1]， 其臨床表現(xiàn)除紅系增多外，通常也伴隨粒系和血小板異常升高。 臨床上將PV 分為增殖期（多血期）和消耗期（多血后期）。疾病進(jìn)展至消耗期的患者紅細(xì)胞生成逐漸減少，骨髓發(fā)生無效造血導(dǎo)致貧血，常伴隨骨髓纖維化。 少部分患者進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為預(yù)后不良的骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）或白血病[2]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone marrow stem cell，BMSC）是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分， 參與多種血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，在MDS及多種白血病中均存在BMSC 功能或細(xì)胞遺傳學(xué)的改變，這種改變對造血干細(xì)胞功能異常重要[3-4]。 對MPN 患者骨髓微環(huán)境的研究尚在起步階段[5-6]。 本研究分離初診PV 患者的BMSC 并對其造血支持功能進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究骨髓微環(huán)境在PV 疾病進(jìn)展過程中的作用提供一定依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011 年5 月～2012 年7 月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的9 例初診PV 患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO 規(guī)定的PV 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，其中男4 例，女5 例；年齡29～83 歲，中位年齡61 歲；其中7 例JAK2 V617F 突變陽性，2 例突變陰性；3 例與患者無血緣關(guān)系的健康志愿者。在患者及健康志愿者知情同意下獲得其樣本，實驗方案獲得我院倫理委員會審核通過。

1.2 BMSC 分離培養(yǎng)

各取PV 患者和健康志愿者骨髓5 mL， 肝素抗凝，用Ficoll 法分離單個核細(xì)胞，在含有2 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 （bFGF）、10 ng/mL 表皮生長因子（EGF）（均購自Peprotech 公司）、1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基（均購自GIBCO 公司）中培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h 后換液除去未貼壁細(xì)胞，此后每隔3 d 換液1 次。 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合時，按1∶2 傳代。 取第3 代至第6 代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞免疫表型鑒定

制備PV-BMSC 的單細(xì)胞懸液， 分別加入1 μL下 述 鼠 抗 人 熒 光 抗 體CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD49e、CD73、CD90、CD105 （均為PE 標(biāo)記）、CD14（APC 標(biāo)記）和相應(yīng)熒光素標(biāo)記的鼠同型對照抗體（均為eBioscience 公司產(chǎn)品），避光孵育30 min 后，離心洗滌未結(jié)合抗體，流式細(xì)胞儀檢測。 使用Diva 軟件（購自BD Biosciences 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 BMSC 的誘導(dǎo)分化

真性紅細(xì)胞增多癥患者來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （PV-BMSC） 和正常人來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（NM-BMSC）按1×104/cm2分別接種于6 孔板內(nèi)，融合度達(dá)80%時，將培養(yǎng)基更換為成脂或成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成骨和成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方及實驗方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.5 BMSC 的體外造血支持功能檢測

PV-BMSC 和NM-BMSC 按4×104/孔 接 種 于24孔板；在含2 ng/mL bFGF、10 ng/mL EGF、1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，按1×104/孔加入臍帶血來源的CD34+造血干祖細(xì)胞（HSPC）（CD34 陽性率大于90%），用無血清造血干細(xì)胞培養(yǎng)基StemspanTMSFEM（購自Stemcell Techologies 公司）培養(yǎng)7 d 后，收集懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)、 檢測CD34+細(xì)胞比例并計算共培養(yǎng)后總細(xì)胞及CD34+HSPC 的擴(kuò)增倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PV-BMSC 的細(xì)胞形態(tài)

從PV 患者和健康志愿者骨髓中分離的單個核細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后可見貼壁細(xì)胞。 培養(yǎng)3～4 d 后集落增大，2～3 周后細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%。 光鏡下觀察，貼壁細(xì)胞呈梭形或多角形；傳至第3 代后，細(xì)胞形態(tài)較為均一，成渦旋狀排列。PV-BMSC 和NM-BMSC的生長速度和細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。 見圖1。

圖1 PV-BMSC 和NM-BMSC 的形態(tài)比較

2.2 PV-BMSC 的細(xì)胞表面標(biāo)記

采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面標(biāo)記。 9 株P(guān)V-BMSC 細(xì)胞均高表達(dá)CD73、CD90、CD105 和CD44 等間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)分子 （＞90%）， 不表達(dá)CD14、CD31、CD34 和CD45 等造血和內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的分子（＜0.1%）。

表1 PV-BMSC 體外造血支持功能

2.3 PV-BMSC 的成骨和成脂分化潛能

對本研究中分離的9 株P(guān)V-BMSC 分別進(jìn)行成骨和成脂分化誘導(dǎo)實驗，以NM-BMSC 作為對照。 經(jīng)油紅O 和Von Kossa 染色法證明PV-BMSC 具有與NM-BMSC 相似的多向分化潛能（圖2，封三）。

圖2 PV-BMSC 和NM-BMSC 的成脂及成骨分化（見內(nèi)文第11 頁）

2.4 PV-BMSC 的體外造血支持功能

在無血清和外源造血細(xì)胞因子支持的條件下，將上述分離的9 株P(guān)V-BMSC 分別與人臍帶血來源的CD34+HSPC 用StemspanTMSFEM 共培養(yǎng)7 d，細(xì)胞計數(shù)，分析CD34+HSPC 細(xì)胞比例并計算總細(xì)胞及CD34+HSPC 細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，結(jié)果見表1。 按照細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果， 將9 株P(guān)V-BMSC 分為三組： 第一組5 株P(guān)V-BMSC 細(xì)胞（55%）總細(xì)胞和CD34+HSPC 擴(kuò)增均大于1.5 倍， 第二組PV-BMSC 細(xì)胞PV-1 和PV-9（22%）CD34+HSPC 擴(kuò)增小于1.5 倍， 第三組PVBMSC 細(xì)胞PV-3 和PV-9 （22%） 總細(xì)胞和CD34+HSPC 均未增加（小于1 倍）。

3 討論

PV 是攜帶JAK2 等基因突變的惡性造血干細(xì)胞的克隆性增殖引起的一類惡性血液病[9]，但靶向JAK2的抑制劑及其他骨髓抑制類藥物未能完全治愈該類疾病[10-11]。 造血微環(huán)境對造血干細(xì)胞的增殖和分化有重要的調(diào)節(jié)作用，BMSC 是造血微環(huán)境的重要組成細(xì)胞， 因此研究MPN 患者的骨髓微環(huán)境可能為疾病治療提供新方案。 本研究以初診PV 患者骨髓中分離的BMSC 作為研究對象，分析了患者BMSC 的造血支持功能，以期為PV 病程的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸提供更多的臨床預(yù)后標(biāo)志。

本研究分離培養(yǎng)了9 株P(guān)V-BMSC， 分離所得細(xì)胞在生長速度、細(xì)胞形態(tài)、免疫表型及成骨和成脂分化能力等方面均與NM-BMSC 沒有明顯差異。選取的PV 患者中7 例攜帶JAK2 V617 基因突變，其余2 例不攜帶該突變， 但RT-PCR 方法檢測后未發(fā)現(xiàn)PVBMSC 中存在JAK2 V617 基因突變（未發(fā)表數(shù)據(jù)），與田竑等[12]和段麗敏[13]早前的研究結(jié)果一致，提示JAK2基因突變僅存在于造血干祖細(xì)胞。

MSC 可以通過分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞間直接接觸發(fā)揮造血支持功能[14-15]。 2014 年，Schneider 等[5]發(fā)現(xiàn)PV-BMSC 培養(yǎng)上清對人HSPC 的體外造血集落（CFU）支持能力低于正常對照，提示PV-BMSC 的造血支持功能發(fā)生改變。 本研究發(fā)現(xiàn)， 初診PV 患者BMSC 的造血支持功能呈現(xiàn)出明顯的個體差異性。 只有半數(shù)左右患者（約占55%）的BMSC 仍具有支持HSPC 增殖的功能，大約有22%的患者（PV-3 和PV-9）的BMSC 發(fā)生HSPC 擴(kuò)增支持功能的顯著缺失。 利用造血集落形成實驗也驗證了造血支持功能低下的PV-BMSC 對造血集落及各系分化的影響與對細(xì)胞擴(kuò)增的結(jié)果一致 （未發(fā)表數(shù)據(jù)）。 通過對比病例資料發(fā)現(xiàn)，PV-BMSC 造血支持功能改變與患者的年齡、性別及JAK2 基因突變均無明確相關(guān)性。

Schneider 等[5]的工作僅比較了5 例JAK2 突變陽性的男性患者的BMSC 上清與正常BMSC 上清造血支持功能。 本研究則對比了4 例男性及5 例女性（其中7 例JAK2 V617 突變陽性和2 例陰性）PV 患者的BMSC 細(xì)胞共培養(yǎng)后的造血支持功能。

骨髓纖維化、MDS 或急性髓系白血病等幾類疾病的患者中均可檢測到BMSC 失去部分造血支持功能[16-17]。 初診PV 患者的BMSC 的造血支持功能改變是否與PV 疾病進(jìn)展有關(guān)尚未見相關(guān)報道。 本研究發(fā)現(xiàn)PV-BMSC 的造血支持功能具有顯著的個體差異性將為回答這一問題提供一定的實驗依據(jù)。 由于PV進(jìn)展的病程較長[18]以及BMSC 存在異質(zhì)性，下一步筆者將在條件許可的情況下擴(kuò)大研究的患者數(shù)，進(jìn)行列隊分析和長期追蹤。

MSC 可通過多種機(jī)制發(fā)揮造血支持功能。已有報道顯示，PV 患者的血清中，多種細(xì)胞因子水平（如白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-11、白血病抑制因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和干細(xì)胞因子等）異常[19-20]。在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，筆者將通過細(xì)胞因子芯片、二代測序等技術(shù)，進(jìn)一步發(fā)掘新的調(diào)控造血支持功能的細(xì)胞因子和基因，以期揭示影響個體PV 患者BMSC 造血支持功能的分子機(jī)制。

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