■麻艷群 黃 凱 戴曉玲 于 丹 陳 濤

（廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西南寧 530005）

巴丁魚（Pangasius sutchi）是我國新興的一種名貴淡水養(yǎng)殖品種，隸屬于鯰形目，科，圓腹屬，又稱暹羅河鲇、虎頭鯊、八珍魚或巴沙魚，主要分布在東南亞一帶，原產(chǎn)于泰國、馬來西亞等國[1]，我國近年來開始引種馴養(yǎng)。該魚無小骨刺，肉質(zhì)細(xì)嫩，口味鮮美。巴丁魚在生長過程中，腹腔內(nèi)會逐漸積累三塊較大的油脂肪，可達(dá)到體重的5%～8%，這一特征在其它魚類極為罕見。巴丁魚在越南等地也因此而被稱呼為“卡巴沙”——“三塊脂肪魚”。目前國內(nèi)外對巴丁魚營養(yǎng)生理方面的研究尚屬空白[2-4]。脂肪肝是一種在養(yǎng)殖魚類中較為常見的營養(yǎng)性疾病。營養(yǎng)不平衡的配合飼料，養(yǎng)殖密度過大，養(yǎng)殖模式不當(dāng)?shù)纫蛩囟加锌赡軐?dǎo)致養(yǎng)殖魚類營養(yǎng)代謝紊亂，造成肝臟脂肪代謝失調(diào)、沉積，脂肪含量升高，肝臟病變，脂肪肝發(fā)生。有研究表明，高等動物的肝臟和肌肉均能作為脂肪的貯存位點(diǎn)，體內(nèi)脂肪合成酶的活性也能很快適應(yīng)食物的變化，使脂肪代謝得以有效進(jìn)行[5]；但在魚類，脂肪的貯存位點(diǎn)主要在肝臟，體內(nèi)脂肪合成酶的活性需要2～3周方可適應(yīng)食物的變化[6]，因此，魚類比高等動物更容易發(fā)生脂肪肝問題。磷脂是指分子中含有磷酸的復(fù)合脂，在自然界里廣泛存在。有報(bào)道表明磷脂對脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要的作用，它參與脂肪酸代謝，有助于脂肪的溶解和吸收，降低血漿和肝臟中的脂肪含量[7-8]。本試驗(yàn)以不同水平磷脂飼料飼喂巴丁魚，研究各組巴丁魚肝臟脂肪沉積、脂肪合成相關(guān)酶活性及組織學(xué)變化情況，探討其脂肪代謝規(guī)律，以期通過營養(yǎng)調(diào)控方式預(yù)防魚類營養(yǎng)性脂肪肝發(fā)生，為磷脂在巴丁魚人工飼料中的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用，推廣養(yǎng)殖巴丁魚提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚

巴丁魚（Pangasius sutchi）由廣西水產(chǎn)引育種中心提供。馴養(yǎng)7 d后選擇規(guī)格基本一致、健康活力好的魚苗900尾[初始體重約(1.45±0.08)g/尾]，隨機(jī)分成5組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)60尾魚，每重復(fù)的魚放養(yǎng)于一個(gè)水泥池（規(guī)格為1.52 m×1 m×1 m）里。

1.1.2 飼料

以豆粕、生物E蛋白、白魚粉、α-淀粉、米糠等為基礎(chǔ)飼料，在該基礎(chǔ)上添加不同比例的大豆磷脂（磷脂含量65%），配制成5組飼料（見表1）。各組的磷脂水平分別為0%（PL0組）、1%（PL1組）、2%（PL2組）、3%（PL3組）和4%（PL4組）。

1.2 飼養(yǎng)管理

各組使用相應(yīng)的飼糧。每天9∶00和17∶00投喂，日投喂量一般為魚體重的3%，以每次投食在1 h內(nèi)吃完為宜。飼養(yǎng)周期為56 d。飼養(yǎng)期間于每日清晨投喂前用虹吸法吸出飼料殘?jiān)图S便，換水1/3，水源為曝氣后的自來水。試驗(yàn)期間平均水溫(27.5±1.0)℃，pH值6.9±0.5，溶解氧(7.10±0.34)mg/l，氨氮(0.03±0.01)mg/l。每日觀察記錄各池魚體活動及采食情況。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 魚體成分分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每重復(fù)取10尾魚，解剖取肝臟，按照AOAC（1984）法測定其粗脂肪含量。計(jì)算公式如下：

肝臟脂肪含量(%)=100×肝臟脂肪量/肝重。

表1 各組飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）(%)

1.3.2 肝臟組織切片的制備

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每重復(fù)取3尾魚解剖，取出肝臟組織固定在Bouin's緩沖液中，做組織切片，HE染色，用以觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3 脂肪合成相關(guān)酶酶活測定

比色法測定與脂肪合成相關(guān)酶的蘋果酸脫氫酶（NADP-malate dehydrogenase，NADP-MDH）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydroge?nase,G-6-PDH）的活性。

1.3.3.1 酶液的調(diào)制

參照周長海的方法[9]進(jìn)行部分修改。每重復(fù)取魚10尾，用軟布擦干后迅速解剖取出肝臟，用電子天平稱取0.5 g左右肝臟樣品，倒進(jìn)勻漿器，加入兩倍體積(約1.0 ml)的預(yù)冷1 mmol/l EDTA-2Na溶液和0.25 mol/l蔗糖溶液(1∶1)，勻漿10 min。勻漿液于4℃9 800 r/min離心10 min，取上清液，4℃ 1 2 000 r/min再離心30 min。取上清液，將其分成兩份，一份以1 mmol/l EDTA-2Na溶液和0.25 mol/l蔗糖溶液稀釋3倍，用于測定NADP-MDH活性；另一份稀釋6倍，用于測定G-6-PDH活性。

酶液蛋白質(zhì)濃度采用南京建成生物工程研究所的總蛋白定量試劑盒（考馬斯亮藍(lán)法）進(jìn)行測定。

1.3.3.2 NADP-MDH活性測定

依據(jù)周長海的方法[9]進(jìn)行。試管中加入于25℃預(yù)溫過的0.25 M雙甘氨二肽1.2 ml（以2 mol/l NaOH調(diào)pH值為7.4）。依次加入0.05 M MnCl20.24 ml；675 μM β-NADP 0.8 ml；0.03 M L-malate(pH值為7.4)0.2 ml；0.25 M 蔗糖 0.51ml；1 mM EDTA-1Na 0.51 ml并混勻，隨后加入前期準(zhǔn)備好的0.05 ml酶液。震動混勻，測定吸光度（波長340 nm）。

1.3.3.3 G-6-PDH活性測定

依據(jù)周長海等(2004)的方法[9]進(jìn)行。試管中加入于25℃預(yù)溫過的50 mM三乙醇2.65 ml（以0.1 M NaOH調(diào)pH值為7.5）。依次加入酶液0.25 ml；30 mM的β-NADP 0.05 ml；混合后在分光光度儀中培養(yǎng)2 min；加入40 mM G-6-磷酸二鈉0.05 ml使反應(yīng)開始，在340 nm下測定吸光度?？瞻讓φ赵囼?yàn)都使用去離子水進(jìn)行。

1.3.3.4 兩種酶活計(jì)算公式

酶活=[V/(ε×D×P×v)]×[△e/△t]×1 000[nmol/(min×mg]。

式中：V——反應(yīng)溶液最終總量；

ε——測定時(shí)NADP的分子吸光度系數(shù)(一般默認(rèn)ε=6)；

D——光路長（1 cm）；

P——酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）；

v——酶液量（ml）；

△e/△t——單位時(shí)間內(nèi)的吸光度變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（X±SE）”表示。用SPSS11.5軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)合Dun?can's多重比較法，顯著水平采用＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼料磷脂對肝臟脂肪含量的影響（見表2）

表2 飼料磷脂對巴丁魚肝臟脂肪含量的影響（%）

肝臟脂肪含量以PL0組的為最高，達(dá)（3.71±0.47）%，顯著高于PL2組（P＜0.05）（見表2）。

2.2 飼料磷脂對巴丁魚肝臟組織學(xué)的影響

各組肝臟組織切片觀察結(jié)果見圖1。由肝臟組織切片圖可以看出，肝臟中部分肝細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核發(fā)生偏移，細(xì)胞膜模糊，部分細(xì)胞核消失，肝細(xì)胞漿內(nèi)含有程度不同的脂肪油滴，出現(xiàn)脂肪空泡，嚴(yán)重程度依次為PL0組＞PL1組＞PL4組。PL2組和PL3組肝臟細(xì)胞形狀較規(guī)則，其整齊度、分布均勻度較之前述3組的情況要好，脂肪空泡也較少；PL2和PL3組間差異不明顯。

2.3 飼料磷脂對巴丁魚脂質(zhì)合成相關(guān)酶活性的影響（見表3）

由表3可以看出，試驗(yàn)中NADP-MDH活性呈現(xiàn)“U”型變化：對照組的NADP-MDH活性最高（P＜0.05），其次為PL1組，PL3組最低，之后隨著飼料磷脂添加水平的提高，PL4組的NADP-MDH活性又升高，但仍顯著低于對照組（P＜0.05）。

肝臟中的G-6-PDH活性也體現(xiàn)出類似于NADPMDH的“U型”變化：對照組的G-6-PDH活性顯著高于PL2、PL3、PL4組(P＜0.05)，PL1組、PL2組、PL3組隨著磷脂添加水平的提高逐步降低，到了PL4組，活性又升高。

3 討論

3.1 飼料磷脂對魚體脂肪含量的影響

魚類沒有像哺乳類的皮下脂肪層，其脂肪多數(shù)蓄積于肝臟、肌肉和腹脂等部位[10]，肌肉和腹脂是長期儲存部位，而肝臟卻是短期儲存部位，因此它比肌肉和腹脂更容易受到外源物質(zhì)的影響[11]。

Meyers[12]認(rèn)為，在飼料中添加磷脂，能增加載脂蛋白的脂肪運(yùn)輸能力，降低脂肪沉積，從而防治脂肪肝，保護(hù)肝臟。Fontagne等[13]通過觀察錦鯉（Cyprinus car?pio）仔魚組織發(fā)現(xiàn)飼料中若缺乏磷脂則會使仔魚腸部細(xì)胞的脂肪小滴聚積。曹俊明等[14]報(bào)道，飼料中添加5%的大豆磷脂，52 d后草魚（Ctenopharyngodon idellus）肝胰臟脂肪含量會大幅度降低。本試驗(yàn)結(jié)果與前人報(bào)道相一致，添加了磷脂的4個(gè)處理組魚體肝臟脂肪含量均比對照組有不同程度的降低，這表明飼料中適宜的磷脂水平會促進(jìn)脂肪代謝，能在一定程度上降低魚體肝臟中的脂肪沉積。

3.2 飼料磷脂對肝臟組織學(xué)的影響

圖1 巴丁魚肝臟組織學(xué)觀察

表3 飼料磷脂對巴丁魚脂質(zhì)合成相關(guān)酶活性的影響[nmol/(min·mg)]

有研究表明，磷脂對脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要的作用，有助于脂肪的溶解和吸收，降低肝臟脂肪含量。Izquierdo等(2000)發(fā)現(xiàn)，給金頭鯛（Sparus aurata）仔魚投喂低水平磷脂飼料，魚腸道黏膜和肝組織內(nèi)會有大量脂肪空泡存在，而在飼料中添加大豆磷脂則能顯著增加仔魚腸道脂蛋白的含量，增強(qiáng)脂肪運(yùn)輸能力[15]。Olsen等（2003）報(bào)道[16]，在飼料中補(bǔ)充大豆磷脂能使虹鱒（Oncorhynchus mykiss）魚腸上皮細(xì)胞形態(tài)正常，脂滴積累減少。本試驗(yàn)對肝臟組織學(xué)的觀察結(jié)果與前人的研究報(bào)道基本一致，未添加磷脂的對照組出現(xiàn)脂肪空泡的程度最嚴(yán)重，顯現(xiàn)輕度脂肪肝癥狀；其次較嚴(yán)重的是1%磷脂水平組，這可能是因?yàn)榱字芡ㄟ^直接或間接的作用影響到乳糜微粒脂蛋白的合成，增強(qiáng)脂類的運(yùn)輸能力，而當(dāng)飼料中缺乏磷脂或磷脂水平不足時(shí)，脂肪運(yùn)輸能力下降，脂肪難以從肝臟向肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)，從而脂肪沉積加重，肝臟組織切片圖顯示大量脂肪空泡積累。和2%、3%磷脂水平組相比，4%磷脂水平的肝臟也積累了較多的脂肪空泡，這或許是因?yàn)轱暳现刑砑?%的磷脂已超過了該階段巴丁魚機(jī)體的磷脂需要量，因而非但未能有效地提高脂肪運(yùn)輸能力，反而在實(shí)質(zhì)上增加了肝臟脂肪代謝的負(fù)擔(dān)，脂肪也逐漸堆積在肝細(xì)胞內(nèi)。

3.3 飼料磷脂對脂肪代謝酶活性的影響

NADP-MDH是生物體三羧酸循環(huán)中最后一個(gè)氧化還原酶，可以將氧化型輔酶Ⅱ（NADP）還原成還原型輔酶Ⅱ（NADPH）[17]；G-6-PDH是戊糖磷酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能催化G-6-Pi脫氫產(chǎn)生5-磷酸戊糖和NADPH，不管是NADP-MDH還是G-6-PDH，它們催化反應(yīng)的產(chǎn)物都有NADPH，而NADPH是動物體內(nèi)脂肪酸合成以及碳鏈延長的重要輔酶，為脂肪酸合成提供氫原子[18]，NADPH在體內(nèi)的供應(yīng)狀況會直接影響到脂質(zhì)的合成代謝，因此NADP-MDH與G-6-PDH在肝臟內(nèi)的活性大小和NADPH的生成量直接相關(guān)，進(jìn)而影響肝臟內(nèi)脂質(zhì)的合成代謝[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高膽固醇日糧的小鼠，其肝臟內(nèi)脂肪酸合成有關(guān)的酶活性升高，肝臟因聚積了太多的脂肪而受損[20]；在飲食誘導(dǎo)肥胖的小鼠脂肪組織里G-6-PDH活性顯著升高[21]。豬背膘中的NADPH生成酶的活性與其胴體脂肪率、背膘厚呈正相關(guān)，與瘦肉率呈負(fù)相關(guān)，因此也有研究人員指出，豬背和膝外層脂肪中NADPMDH和G-6-PDH活性可作為肉用性狀早期選種的遺傳標(biāo)記，早期選育瘦肉型豬時(shí)，以NADPH生成酶活性為標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)于以背膘厚度為標(biāo)準(zhǔn)[22-23]。

本試驗(yàn)結(jié)果中，NADP-MDH和G-6-PDH活性隨著飼料磷脂水平的添加均呈現(xiàn)“U”型變化，這有可能是因?yàn)樵陲暳先狈α字蛄字讲蛔銜r(shí)，脂肪在肝臟沉積加重，機(jī)體需要增強(qiáng)脂質(zhì)代謝酶活性去適應(yīng)脂肪代謝的需要；而當(dāng)飼料中添加的磷脂含量超過了該階段機(jī)體的需要量，肝臟脂肪代謝負(fù)擔(dān)增加時(shí)，肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝酶活性也會相應(yīng)增加。

結(jié)合肝臟組織切片圖，我們發(fā)現(xiàn)，盡管對照組、PL1組的魚體已增強(qiáng)了脂質(zhì)合成酶的活性，但其肝臟組織內(nèi)仍存有較多的脂肪油滴，肝臟脂肪含量大，這或許說明了魚體對相應(yīng)飼料日糧做出的主動代償性增強(qiáng)并不足以真正滿足機(jī)體脂質(zhì)代謝的需要，因此在生產(chǎn)養(yǎng)殖中，要預(yù)防“營養(yǎng)性脂肪肝”的發(fā)生，合理配制人工飼料尤為重要。

4 結(jié)論

①在巴丁魚幼魚飼料中添加適宜的磷脂（3%），能有效降低魚體肝臟中的脂肪沉積。

②當(dāng)飼料缺乏磷脂或磷脂過量時(shí)，肝臟脂肪沉積增多，脂肪合成相關(guān)酶的活性補(bǔ)償性升高。