李 蕓， 胡昌江， 侯桃霞， 馬貝紅， 孫政華， 劉峰林

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

正交實驗優(yōu)選高烏頭解毒的炮制工藝研究

李 蕓1，2， 胡昌江1*， 侯桃霞2， 馬貝紅2， 孫政華2， 劉峰林2

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

目的探討毒性中藥高烏頭炮制解毒的最佳工藝，為高烏頭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供科學(xué)依據(jù)。方法采用L9（34）正交設(shè)計法，以總生物堿和高烏甲素的量為考察指標(biāo)，選擇輔料種類、加熱方式及加熱時間3個因素 （每因素3水平），優(yōu)選最佳炮制工藝。結(jié)果最佳炮制工藝為加入10%甘草汁，127℃0.15 MPa加壓蒸5 h。結(jié)論優(yōu)選的高烏頭最佳炮制工藝穩(wěn)定，合理。

高烏頭；單因素；正交設(shè)計；炮制工藝

高烏頭是毛莨科烏頭屬植物高烏頭Aconitum sinomontanum Nakai的干燥根，又名九連環(huán)、麻布七，分布于我國甘肅、青海、陜西、四川等地，為我國中西部地區(qū)的民間草藥，主要用于風(fēng)寒濕痹、脘腹冷痛、跌打損傷，外用殺滅寄生蟲等［1-4］，現(xiàn)收載于 《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009年版）。高烏頭生品有毒，己被多部文獻記載［1-4］。高烏頭雖與烏頭同科同屬，但其毒性成分不同于烏頭，高烏頭基本不含極毒的烏頭堿［5］，從迄今分離的27種化學(xué)成分中也未得到烏頭堿［6-7］。高烏甲素 （也叫刺烏頭堿，拉帕烏頭堿）是高烏頭抗炎鎮(zhèn)痛的主要有效成分，也是其毒性成分［8-10］。

我國自古就認(rèn)為高烏頭 “辛熱有大毒”，其臨床應(yīng)用受限，須炮制以解毒，才能保證臨床安全有效。目前，高烏頭炮制解毒尚未見報道。本課題以總生物堿和高烏甲素的量為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計法，探討高烏頭炮制解毒過程，優(yōu)選高烏頭炮制解毒的最佳炮制工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters-2695型高效液相儀、2998二極管陣列檢測器 （PAD）；UV-3300型紫外可見分光光度計 （上海美譜達儀器有限公司）；BT 125D電子天平 （賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；LDZX-30FA立式壓力蒸汽滅菌器（上海中安醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥 高烏頭購自甘肅省天祝藏族自治縣，由中藥鑒定教研室楊撫德教授鑒定為高烏頭Aconitum sinomontanum Nakai的根，別名麻布七。氫溴酸高烏甲素對照品購自甘肅神龍藥業(yè)股份有限公司，批號20001001，純度97.50%。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。0.1%溴甲酚綠的制備：精密稱取溴甲酚綠0.500 0 g，用0.05 mol/L NaOH溶液8.75mL研磨，加蒸餾水溶解到500 mL（pH= 6.0±0.2），過濾，以三氯甲烷除去脂溶性雜質(zhì)。醋 （鎮(zhèn)江香醋pH為4～5，鎮(zhèn)江市恒康調(diào)味品廠）。甘草汁的制備［11］：取甘草180 g，加12倍量水，煎煮1 h，過濾，藥渣再用10倍量水煎煮1 h，過濾，合并兩次濾液，濃縮至甘草汁體積與甘草質(zhì)量比為3：1，即得。

2 炮制工藝評價方法的建立

2.1 總生物堿測定方法的建立

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 對照品貯備液的制備 精密稱取氫溴酸高烏甲素11.10 mg，置于50 mL量瓶中，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋至刻度，作為對照品溶液，備用。

2.1.1.2 供試品溶液的制備 取高烏頭粉末0.2 g，精密稱定，加入乙醚-三氯甲烷 （3：1）20 mL、氨試液1 mL，搖勻放置過夜，過濾，藥渣用乙醚-三氯甲烷 （3：1）洗滌3次，合并濾液，減壓回收溶劑，水浴60℃蒸干，殘渣用三氯甲烷定容至25 m L。

2.1.2 線性關(guān)系考察［12］精密量取對照品貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 m L分別置分液漏斗中，分別加醋酸-醋酸鈉緩沖液至10 mL，另取醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL置于分液漏斗中作為空白對照。在上述分液漏斗中分別加入10 mL溴甲酚綠溶液，振搖5 min，靜置10 min，用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷提取液，用干燥濾紙濾過于50 mL量瓶中，并用三氯甲烷稀釋至刻度，在413 nm處測定吸光度，以吸光度 （A）對質(zhì)量濃度（C）進行線性回歸，氫溴酸高烏甲素在 4.44～17.76 μg/mL線性關(guān)系良好，回歸方程為A=41.977C-0.100 4，r=0.995 2。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液2 mL，連續(xù)測定6次，吸光值的RSD為0.3%。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法進行操作，分別在1、10、20、30、60、90、120、180、240、360 min測定吸光度，結(jié)果RSD為1.4%，供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取同一藥材樣品，平行6份，依法測定，結(jié)果平均含有量為3.4%，RSD為2.6%。

2.1.6 加樣回收率試驗 取已知含有量的高烏頭藥材0.1 g，精密稱定，精密加入氫溴酸高烏甲素對照品溶液（0.315 2mg/mL）7mL，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，依線性關(guān)系考察項下的方法進行測定吸光度，結(jié)果平均回收率為91.8%，RSD為2.5%。

2.2 氫溴酸高烏甲素測定方法的建立

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 醋陰性對照溶液的制備 取醋0.2 mL（制備樣品時醋的用量），揮干，按供試品溶液的制備方法依法制備。

2.2.1.2 甘草汁陰性對照溶液的制備 取甘草汁0.1 mL，揮干，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取氫溴酸高烏甲素對照品7.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.4 供試品溶液的制備 取高烏頭樣品 （過50目篩）約0.5 g，精密稱定，置三角瓶中，加甲醇15 mL，超聲15 min，濾過，濾渣再加10 m L甲醇，超聲15 min，濾液合并于25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

2.2.2 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5μm）；以甲醇-0.05 mol/L NaH2PO4溶液（45：55）為流動相；體積流量為1.0 mL/min；進樣量10μL；檢測波長252 nm；柱溫為30℃。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別取對照品溶液、樣品溶液及陰性對照溶液，照上述色譜條件，各進樣10μL，結(jié)果見圖1，氫溴酸高烏甲素的保留時間為12.234 min。結(jié)果表明各陰性對照溶液色譜在與對照品色譜相應(yīng)位置上無干擾。理論塔板數(shù)按氫溴酸高烏甲素計算不低于5 000。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.5、1、5、10、15、20、25μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積 （Y）對進樣量 （X）進行線性回歸，氫溴酸高烏甲素在0.15～7.5μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程Y=237 512 X-53 646，r=0.999 9。

2.2.5 精密度試驗

2.2.5.1 日內(nèi)精密度 精密吸取對照品溶液10μL連續(xù)進樣5次，其峰面積的RSD為0.5% （n=5）。

2.2.5.2 日間精密度 取同一樣品溶液 （生品飲片），在相同條件下連續(xù)3日進樣，其峰面積的RSD為1.6%。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取5份樣品 （生品飲片）各0.5 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備溶液，依法測定，結(jié)果氫溴酸高烏甲素的平均含有量為0.595%，RSD為2.8% （n=5）。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的樣品 （生品飲片）5份各0.25 g，精密加入對照品溶液5 mL（質(zhì)量濃度0.3mg/mL），按供試品溶液的制備方法制備，依法測定，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

3 炮制工藝研究

3.1 單因素試驗 高烏頭的炮制解毒工藝參數(shù)與是否加入輔料及所加輔料用量，采用何種加熱方式，以及加熱時間長短都密切相關(guān)，因此，本實驗首先確定一定的影響因素及水平范圍（如藥材軟化方式，水煮制時間，甘草汁及米醋用量，其中，水煮制時間的確定也意味著甘草汁和米醋煮制時間的確定，在確定的時間內(nèi)再選擇甘草汁和米醋的用量），再采用正交設(shè)計優(yōu)選炮制工藝的最佳組合。

3.1.1 軟化方式的選擇 稱取高烏頭藥材3份，每份150 g（下同），搶水法洗凈，分別采用泡、漂、潤3種方法軟化，透心后，切碎段（約5 mm），陰干，結(jié)果3種軟化方法總生物堿的量均有不同程度的損失，但潤法損失最少，故選擇潤法作為最佳軟化方法。

圖1 對照品（C）、陰性對照（A、B）及樣品（D、E）的HPLC色譜圖

3.1.2 水煮制時間的選擇 取軟化切制后的生品飲片4份，分別加水煎煮2、4、6、8 h，煮至藥透水干，取出，干燥，測定總生物堿量，見圖2，結(jié)果，煮4 h總生物堿損失較少，這為后續(xù)甘草汁和米醋煮制所采用時間提供依據(jù)，也為正交設(shè)計加熱時間的范圍提供參考。

3.1.3 甘草汁用量的考察 取軟化切制后的干燥飲片5份，分別加入5%、10%、15%、20%、25%的甘草汁，攪拌均勻，加水沒過藥面，先武火后文火，煮制4 h，藥透汁盡，取出，干燥，依法測定含量（除去甘草的干擾），見圖3，結(jié)果：加入10%甘草汁時，炮制效果理想，因此，正交設(shè)計可選用10%甘草汁炮制。

圖2 煎煮時間考察

3.1.4 米醋用量的考察 取軟化切制后的干燥飲片4份，分別加入5%、10%、20%、30%的醋，攪拌均勻，煮制4 h，至

圖3 甘草汁用量考察

藥透水干，取出，干燥，測定（去除米醋的干擾），見圖4，結(jié)果說明：加入20%醋時，總生物堿量最高，故輔料醋的用量為20%時炮制效果最佳。

圖4 米醋用量考察

3.2 正交設(shè)計試驗 在文獻調(diào)研及單因素考察的基礎(chǔ)上，以輔料類型、加熱方式和加熱時間為考察因素，以總生物堿和高烏甲素的量為指標(biāo)，進行正交設(shè)計安排實驗，因素水平見表2。

表2 因素水平

3.2.1 正交設(shè)計試驗安排與結(jié)果 采用L9（34）表安排試驗，計算總生物堿 （折干）和高烏甲素 （折干）的百分含有量，實驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 L9（34）正交試驗結(jié)果

3.2.2 方差分析 利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果表明：按α=0.05，A因素 （輔料類型）對總生物堿量 （P=0.016）具有顯著性影響；輔料、加熱方式和加熱時間三因素對高烏甲素含量均無顯著性影響。對總生物堿：A、B、C三因素對其影響順序為A＞B＞C，選擇最高的水平，其最優(yōu)組合為A2B3C3；對高烏甲素：A、B、C三因素對其影響順序為C＞B＞A，選擇 “適中”的水平，其最優(yōu)組合為A2B3C2。

綜合兩個考察指標(biāo)的方差分析結(jié)果，又考慮到該實驗是選擇高烏頭炮制解毒增效的炮制工藝，總生物堿是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，高烏甲素既是鎮(zhèn)痛抗炎的藥效成分又是毒性成分，故應(yīng)該選擇總生物堿量高而高烏甲素量 “適中”的參數(shù)為其最佳炮制工藝，最佳組合為A2B3C3，即高烏頭生品飲片加入10%甘草汁，127℃0.15 MPa加壓蒸5 h。

3.2.3 驗證試驗 為考察該工藝的合理性、穩(wěn)定性，按照正交試驗優(yōu)選的工藝條件驗證3批，分別測定總生物堿及高烏甲素的量，結(jié)果總生物堿量分別為7.78%、7.76%、7.71%；高烏甲素的量分別為 0.601%、0.599%、0.589%。3次測定結(jié)果均優(yōu)于正交試驗各工藝結(jié)果，說明該高烏頭的炮制工藝合理可行。

4 討論

4.1 解毒輔料及加熱方式的選擇 高烏頭的炮制，文獻《中華本草》記載： “揀去雜質(zhì)，洗凈，稍悶，切片，曬干，本品有毒，使用慎用”，但炮制如何解毒未能明確，為此，筆者參照烏頭的炮制方法，分別采用清水煮和加輔料（甘草汁和米醋）煮、常壓蒸和加壓蒸等方法，選用正交設(shè)計實驗，能夠更全面地考察其炮制工藝，保證工藝的可靠性和穩(wěn)定性。

4.2 輔料米醋和甘草汁的作用 使用輔料解毒，是炮制毒性中藥的重要手段。實驗中使用米醋，主要起解毒［14］作用，同時醋具有酸性，能與藥物中所含的游離生物堿結(jié)合成鹽，而使有效成分易于煎出；甘草汁主要起解毒作用。甘草的解毒早在 《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，歷代炮制有毒藥物如半夏、川烏等都用甘草水煮。甘草的解毒主要是甘草甜素水解后釋放出葡萄糖醛酸與含有羥基或羧基的毒物結(jié)合而解毒。此外，甘草苷是表面活性劑，能增加其他不溶于水物質(zhì)的溶解度，起一定的增溶作用。

4.3 考察指標(biāo)的選擇 毒性中藥的炮制必須兼顧去毒和存效兩個方面，因此考察指標(biāo)的選擇也必須反映這兩方面。實驗曾選擇總生物堿和酯型生物堿的含有量分別代表藥效和毒性指標(biāo)，但在采用改良鹽酸羥胺-高氯酸鐵比色法測定酯型生物堿時，可能由于空間位阻等因素導(dǎo)致該顯色反應(yīng)不能定量進行，無法定量測定酯型生物堿。但考慮到高烏甲素既是鎮(zhèn)痛抗炎的有效成分，又具有一定的毒性，可作為毒性指標(biāo)，在選擇最佳炮制工藝時，盡量選擇總生物堿含有量高而高烏甲素含有量又不能太低 （適中）的因素水平作為最適宜的炮制解毒工藝。本實驗從保證療效和降低毒性兩個方面優(yōu)選炮制工藝，更具有合理性，但這僅是化學(xué)評價指標(biāo)，而通過炮制是否確實達到 “減毒存效”的目的，有待藥理實驗進一步證明。因此，高烏頭 “適中”的炮制工藝還應(yīng)結(jié)合毒性和藥效學(xué)指標(biāo)進行綜合評價。

［1］甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)［S］. 2009：117-118.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下冊［M］.上海：上?？萍汲霭?，1993：2225-2226.

［3］國家中醫(yī)藥管理局，中華本草編委會.中華本草：第七卷［M］.上?？萍汲霭嫔?，1999：1746-1747.

［4］楊倉良.毒藥本草［M］.中國中醫(yī)藥出版社，1993：473.

［5］賀江萍，王 彤，董偉林.高效液相色譜法測定高烏頭和霧靈烏頭中烏頭堿的含量［J］.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998，（3）：261-262.

［6］謝海輝，韋璧瑜.高烏頭的化學(xué)成分及其藥理作用研究進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（B08）：232-235，154.

［7］Yuan C L，Wang X L.Isolation of active substances and bioactivity of Aconitum sinomontanum Nakai［J］.Nat Pro Res，2012，26（22）：2099–2102.

［8］陳麗娟，唐希燦，王美瑛，等.刺烏頭堿的毒性和致畸作用研究［J］.上海實驗動物科學(xué)，1989，9（1）：5-7.

［9］魏華波，范艾玲，秦爭平.注射用氫溴酸高烏甲素致耳毒性不良反應(yīng)2例［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（17）：1413-1414.

［10］任媛媛，王 鵬，詹 妮.二萜生物堿生物活性和毒性的研究概況［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（11）：210-213.

［11］毛淑杰，李先端，顧雪竹，等.中藥炮制輔料-醋的規(guī)范化示范性研究［J］.中國中藥雜志，2006，31（22）：1916-1918.

［12］吳延吉.甘肅高烏頭有效部位的研究［D］.天津：天津大學(xué)，2007.

［13］李 飛，張世臣，楊 蕾，等.正交設(shè)計法優(yōu)選烏頭炮制工藝［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1998，21（1）：38-39.

［14］張姍姍，孫立立，石典花，等.不同炮制方法對甘遂急性毒性影響的研究［J］.中成藥，2012，34（11）：2178-2180.

R283

B

1001-1528（2015）04-0905-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.050

2014-08-07

甘肅省自然科學(xué)基金項目 （1107RJZA242）；甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年基金項目 （ZQ2011-8）

李 蕓（1973—），女，博士生，主要從事中藥炮制學(xué)的教學(xué)和科研工作。E-mail：liyunherb@163.com

*通信作者：胡昌江（1952—），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制學(xué)的教學(xué)和科研工作。E-mail：hhccjj@hotmail.com