布圖雅， 孫勤暖， 廣布加甫·藏登， 烏日嘎

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古呼和浩特010059；3.新疆醫(yī)科大學(xué)校醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000）

蒙藥尼如哈優(yōu)化劑對潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)癌小鼠的一般情況和結(jié)腸組織病變的影響

布圖雅1， 孫勤暖2， 廣布加甫·藏登3， 烏日嘎1

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古呼和浩特010059；3.新疆醫(yī)科大學(xué)校醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000）

目的探討尼如哈優(yōu)化劑對潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)癌的防治作用。方法98只Balb/c小鼠隨機(jī)分空白組、模型組、優(yōu)化劑高、中、低劑量治療組，傳統(tǒng)劑治療組，柳氮磺吡啶治療組7組，每組10只；正常組除外，各組以AOM/DSS復(fù)合法復(fù)制模型，從第9周開始模型組予等劑量生理鹽水灌腸，治療各組分別予相應(yīng)的藥液進(jìn)行灌腸治療，共11周。實(shí)驗(yàn)第20周末將全部小鼠處死取全結(jié)腸，肉眼及光鏡下觀察其結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)改變及異常隱窩的變化。期間每周一次觀察小鼠一般情況。結(jié)果模型組小鼠結(jié)腸肉眼改變以散在、多發(fā)性息肉狀隆起性病變?yōu)橹鳌２±砀淖円缘图墑e上皮內(nèi)瘤變和/或高級別上皮內(nèi)瘤變?yōu)橹?；低、中劑量組肉眼改變均以單發(fā)或少數(shù)息肉狀隆起性病變?yōu)橹?。鏡下以增生性息肉改變?yōu)橹鳎桓邉┝拷M、柳氮磺吡啶組肉眼改變均以結(jié)腸黏膜充血、水腫為主。鏡下改變均以腺體增生為主，未見潰瘍及明顯的異常隱窩及上皮內(nèi)瘤變。與模型組比較有極顯著差異 （P＜0.01）?？瞻捉M小鼠情況良好，攝食量、大便正常；模型組小鼠體質(zhì)量逐漸減輕，倦怠拱背、有黏液血便，并出現(xiàn)脫肛；尼如哈治療各組小鼠體質(zhì)量和食量不同程度增加、血便次數(shù)明顯減少。結(jié)論蒙醫(yī)尼如哈優(yōu)化劑可用于防治潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)癌。

蒙醫(yī)；尼如哈優(yōu)化劑；結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌；上皮內(nèi)瘤變

結(jié)腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一。其中約1/4的患者其病因及發(fā)病機(jī)制與慢性炎癥相關(guān)［1］。研究表明，在結(jié)腸癌出現(xiàn)之前，至少要經(jīng)過數(shù)十年的癌前演變期［2］。而慢性潰瘍性結(jié)腸炎伴上皮內(nèi)瘤變是主要的結(jié)腸癌前病變。因此，探索結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的有效防治措施，防止結(jié)腸炎向結(jié)腸癌演變是一個重要的課題［3］。

蒙醫(yī)認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌 （CAC）屬大腸“血痞病”范疇，是由大腸 “寶如病”遷延不愈導(dǎo)致的一類 “痞病”。尼如哈優(yōu)化劑為筆者結(jié)合蒙醫(yī)理論和現(xiàn)代藥理學(xué)研究，整理、分析蒙醫(yī)治療大腸寶如病的尼如哈劑，進(jìn)行優(yōu)化而成。應(yīng)用于輕、中度潰瘍性結(jié)腸炎的治療取得了良好的臨床療效［4］?；诖?，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用AOM/DSS復(fù)制小鼠潰結(jié)相關(guān)癌變模型，期望通過觀察各組CAC小鼠一般情況及結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化，探討尼如哈優(yōu)化劑對其一般情況的改善及結(jié)腸組織的保護(hù)作用，進(jìn)而為臨床防治CAC提供可參考的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和安全有效的治療方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Balb/c雄性小鼠，清潔級，98只。購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0004。

1.2 主要試劑及儀器 氧化偶氮甲烷（AOM）（美國SIGMA公司，批號A5486-25MG）；葡聚糖硫酸鈉 （DSS分子質(zhì)量50 000）（美國AMERESCO公司，批號0918-10）；甲醛、無水乙醇購自天津國藥集團(tuán) （貨號 HX0174，HX0046）；蘇木素細(xì)胞染色液、伊紅染色液購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；組織切片石蠟塊購自上海華靈公司（GCHC0004）；YD-12G自動脫水機(jī)；YD-6D包埋機(jī)；RM2135 Leica切片機(jī)；HI1210Leica攤片機(jī)；烘片機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 尼如哈傳統(tǒng)劑：載于 《甘露四部》，由訶子、枇杷葉、茜草、秦艽花、藜蘆、大黃組成。購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬中蒙醫(yī)院。

尼如哈優(yōu)化劑：由訶子、石榴、蓽茇等為主的方劑。購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬中蒙醫(yī)院。

尼如哈傳統(tǒng)劑及優(yōu)化劑的制備：稱定質(zhì)量、粉碎、梯度 （100～250目孔）過篩。用蒸餾水煮沸后靜置，取上清液備用。

柳氮磺吡啶腸溶片 （國藥準(zhǔn)字 H31020840，批號22120608），上海福達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 模型制備及分組處理 參照文獻(xiàn)［5］所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、優(yōu)化劑高、中、低劑量治療組、傳統(tǒng)劑治療組、柳氮磺吡啶治療組7組，每組10只。小鼠腹腔注射1次1 g/L質(zhì)量濃度的AOM（10 mg/kg），繼而飲用添加3%DSS飲用水1周，再飲用正常飲用水兩周為一個循環(huán)。正常組除外，其余各組重復(fù)上述循環(huán)3次。第9周開始模型組予等劑量生理鹽水，治療組按實(shí)驗(yàn)動物與人的劑量換算比率，分別予450 mg/mL、225mg/mL、112.5mg/mL優(yōu)化劑、450mg/mL傳統(tǒng)劑和30 m g/mL柳氮磺吡啶。每次灌腸藥量為0.1 mL/10 g［6］，每日一次灌腸，共治療11周。

2.2 標(biāo)本采集 全部小鼠于實(shí)驗(yàn)第20周末處死，取出全結(jié)腸，沿縱軸切開，用生理鹽水迅速沖凈后置于標(biāo)本體積10倍以上的10%中性福爾馬林溶液中固定，備測。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 結(jié)腸大體損傷的評分 將小鼠結(jié)腸向上平展于白色硬板，用精密電子秤秤取其凈質(zhì)量，用游標(biāo)卡尺測量其長度，隨即大頭針固定，用放大鏡觀察黏膜的損傷程度、炎癥、潰瘍以及腫瘤發(fā)生等變化并予以評分。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1［7］。

表1 結(jié)腸大體損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3.2 異常隱窩 用0.38% （體積分?jǐn)?shù)）美藍(lán)將結(jié)腸染色，解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)異常隱窩（aberrant crypt，AC）的個數(shù)，并取正面圖像。AC的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］： （1）異常隱窩所占面積約是周圍正常隱窩的2～3倍； （2）異常隱窩的表皮層增厚；（3）異常隱窩的開口往往輕度變長；（4）與正常隱窩之間的間隔區(qū)相比，異常隱窩與正常隱窩之間的間隔區(qū)增大。

2.3.3 結(jié)腸病理改變的觀察 將固定好的結(jié)腸流水沖洗24 h后放置生物脫水機(jī)進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片 （厚度4μm），行常規(guī)HE染色，封片。光鏡下觀察結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學(xué)改變情況。組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)見表2［9］。

表2 結(jié)腸病理組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3.4 上皮內(nèi)瘤變的評價標(biāo)準(zhǔn)［10］低級別上皮內(nèi)瘤變指結(jié)構(gòu)和細(xì)胞學(xué)異常限于上皮的下半部，相當(dāng)于輕度和中度異型增生；高級別上皮內(nèi)瘤變則指結(jié)構(gòu)和細(xì)胞學(xué)異常擴(kuò)展到上皮的上半部，乃至全層，相當(dāng)于重度異型增生和原位癌。

2.3.5 一般情況的觀察 自實(shí)驗(yàn)開始每周一次觀察各組小鼠的攝食攝水量、毛發(fā)、體質(zhì)量、便血及死亡等變化。

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察結(jié)腸黏膜損傷情況 正常小鼠組結(jié)腸黏膜光滑，未見充血，水腫及糜爛潰瘍改變；模型組、低劑量組小鼠結(jié)腸肉眼改變均以散在、多發(fā)性息肉狀隆起性病變?yōu)橹?，組間比較無顯著差異 （P＞0.05）；中劑量組以伴有單發(fā)或少數(shù)息肉狀隆起性病變?yōu)橹?，偶見潰瘍形成，中劑量組與模型組和低劑量組之間比較，有顯著差異 （P＜0.05）。高劑量組、柳氮磺吡啶組均以結(jié)腸黏膜充血、水腫為主，未見明顯潰瘍。與模型組比較有極顯著差異 （P＜0.01），組間比較無顯著差異 （P＞0.05），與中劑量組比較有差異 （P＜0.05），見表3。

3.2 小鼠結(jié)腸黏膜光鏡下病理變化 正常組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，未見充血水腫及糜爛潰瘍，腺體排列規(guī)則，含多量杯狀細(xì)胞；模型組、低劑量組小鼠均以腺體增生、杯狀細(xì)胞消失，異常隱窩呈不規(guī)則分支，以低和/或高級別上皮內(nèi)瘤變?yōu)橹?，組間無顯著差異 （P＞0.05）。中劑量組以增生性息肉改變?yōu)橹?，杯狀?xì)胞明顯減少，異常隱窩偶見。中劑量組與模型組和低劑量組之間比較，有顯著差異（P＜0.05）；高劑量組、柳氮磺吡啶組鏡下改變均以黏膜上皮脫落、杯狀細(xì)胞減少，腺體增生為主，未見糜爛潰瘍及明顯的異常隱窩和上皮內(nèi)瘤變，與模型組比較有極顯著差異 （P＜0.01），組間無顯著差異 （P＞0.05）、與中劑量組比較有差異 （P＜0.05）。見表3、圖1。

表3 小鼠結(jié)腸黏膜肉眼及光鏡下?lián)p傷評分 （）

表3 小鼠結(jié)腸黏膜肉眼及光鏡下?lián)p傷評分 （）

注：與模型對照組比較，*P＜0.01

只 肉眼損傷評分 光鏡損傷評分正常對照組組別 小鼠/ 8 0 0模型對照組 8 9.00±0.75 8.25±1.03尼如哈優(yōu)化劑高劑量組 8 3.00±1.75 3.13±0.53*尼如哈優(yōu)化劑中劑量組 8 2.50±1.75 5.75±0.46*尼如哈優(yōu)化劑低劑量組 8 2.50±1.00 5.18±1.19*柳氮磺吡啶組 8 2.50±1.75 5.13±0.75*尼如哈傳統(tǒng)劑量組 8 3.00±0.73 5.12±0.64*

圖1 尼如哈優(yōu)化劑對結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌小鼠結(jié)腸黏膜癌變的影響

3.3 形態(tài)學(xué)改變及異常隱窩變化 （ACF）結(jié)果 正常組小鼠結(jié)腸未見異常隱窩。模型組可見隱窩開口呈三角、長橢圓等形狀并擴(kuò)大；其大小不等，多數(shù)含3個以上的AC；隱窩間脊增寬，異常隱窩與周圍正常隱窩界限分明。隱窩上皮細(xì)胞胞核核分裂多、排列擁擠、增大擴(kuò)展至腸腺的腔面，胞漿深染（圖2），治療組形成形態(tài)學(xué)改變及異常隱窩的平均數(shù)量均少于模型組，且多為異型性小形態(tài)學(xué)改變及異常隱窩。高劑量組，柳氮磺吡啶組偶見增生性隱窩，異常隱窩數(shù)明顯減少，高劑量組、柳氮磺吡啶組與模型組比較有極顯著差異 （P＜0.01）見表4、圖2。

表4 各組小鼠結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變及異常隱窩形成情況（）

表4 各組小鼠結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變及異常隱窩形成情況（）

注：與模型對照組比較，*P＜0.01

組別 小鼠/只 每鼠平均ACF/個正常對照組80模型對照組 8 17.75±2.23尼如哈優(yōu)化劑高劑量組 8 5.53±2.50*尼如哈優(yōu)化劑中劑量組 8 6.45±1.56*尼如哈優(yōu)化劑低劑量組 8 5.55±1.75*柳氮磺吡啶組 8 5.53±2.55*尼如哈傳統(tǒng)劑量組4.52±1.75 8

3.4 小鼠一般情況 正常組小鼠情況良好，攝食量多，大便正常；模型組小鼠體質(zhì)量逐漸減輕，倦怠拱背、精神萎靡、體毛黯淡無光，有黏液血便，并出現(xiàn)脫肛，尼如哈治療組的小鼠體質(zhì)量和食量不同程度增加，體毛較有光澤，血便次數(shù)明顯減少。

4 討論

4.1 潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟演變的模式。研究顯示，潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸上皮高級別或低級別內(nèi)瘤變是發(fā)生在進(jìn)展期結(jié)腸癌前，被認(rèn)為是癌前病變［11］。在病程長，病變累及全結(jié)腸的潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸上皮癌變的危險性增加［12］。對高風(fēng)險的患者使用療效好且毒副作用較小的天然合成藥物進(jìn)行干預(yù)，可達(dá)到逆轉(zhuǎn)癌前病變、降低腫瘤的發(fā)生率并能避免手術(shù)治療后的復(fù)發(fā)率［3］。

4.2 蒙醫(yī)認(rèn)為，該病是由大腸 “寶如”病遷延不愈而引發(fā)的大腸 “血痞”病。而 “寶如”為熱邪積于大腸而引起的聚會性慢性?。?3］，久病致痞。應(yīng)用內(nèi)服藥和腸療-尼如哈療法防治該病，取得了良好療效，積累了寶貴的治療經(jīng)驗(yàn)［14-15］。

圖2 尼如哈優(yōu)化劑對結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌小鼠形態(tài)學(xué)改變及異常隱窩形成的影響

4.3 尼如哈優(yōu)化劑是筆者通過前期工作，基于對大腸寶如病的病因病機(jī)的重新認(rèn)識，結(jié)合蒙醫(yī)理論與現(xiàn)代藥理學(xué)研究，對包括原方在內(nèi)的治療大腸寶如病的尼如哈劑進(jìn)行了優(yōu)化，得出的以訶子、石榴、蓽茇、枇杷葉、茜草、藜蘆、秦艽花、大黃等組成的方劑。方中訶子為蒙藥藥中之王［16］。研究證明，其提取物具有抗菌、抗病毒等多種藥理活性［17］。藜蘆、大黃、秦艽花［18］以及茜草、枇杷葉［19］也具抗炎、抗菌、抗病毒等藥理作用。蓽茇、大黃、秦艽還具有抗氧化作用以及免疫調(diào)節(jié)作用［20］。通過實(shí)驗(yàn)我們可以明確尼如哈優(yōu)化劑防治潰結(jié)癌變的生物學(xué)效應(yīng)。由此初步推測，對高危險因素的患者應(yīng)用尼如哈優(yōu)化劑可預(yù)防潰結(jié)相關(guān)癌變是有力的，具有深入研究的價值。

4.4 蒙醫(yī)藥是傳統(tǒng)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，理論基礎(chǔ)和所用的藥物與西醫(yī)有著很大的不同。治療結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌方面有獨(dú)特的療效，在許多方面可補(bǔ)西醫(yī)之不足。隨著臨床上蒙西醫(yī)結(jié)合的廣泛開展，更加突出了蒙醫(yī)藥在治療結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的重要地位。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0883-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.044

2014-02-14

內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目 （kjt11sf07）

布圖雅 （1973—），女 （蒙古族），博士，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：13354711577；E-mail：butuyatl@126.com