吳友蘋， 張 升

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，浙江杭州310003；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州310015）

桑葉水提液的急性毒性和遺傳毒性研究

吳友蘋1， 張 升2

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，浙江杭州310003；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江杭州310015）

目的初步評價桑葉水提液安全性。方法通過小鼠急性毒性試驗、鼠傷寒沙門氏菌試驗 （Ames試驗）、中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞 （CHL）染色體畸變試驗和小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗，考察桑葉水提液急性毒性和遺傳毒性。結(jié)果桑葉水提液40 g/kg小鼠灌胃給藥未出現(xiàn)死亡，體質(zhì)量與正常對照組比較無明顯差異 （P＞0.05）。經(jīng)A-mes試驗、CHL細(xì)胞染色體畸變試驗、小鼠微核試驗，桑葉水提液的結(jié)果均為陰性。結(jié)論本實驗條件下，桑葉水提液的小鼠灌胃給藥最大給藥劑量為40 g/kg，且未表現(xiàn)出遺傳毒性。

桑葉水提物；急性毒性；遺傳毒性

桑葉始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉，味甘、苦、性寒，歸肝經(jīng)；具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目的功效。據(jù)本草綱目記載： “桑葉乃手足陽明之藥，汁煎代茗，能止消渴，明目長發(fā)?！爆F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桑葉富含多糖、黃酮等活性成分，有降血壓、抑制血糖上升、抗菌、消炎等功效，具有良好的藥用價值［1-3］。桑葉還是我國目前已批準(zhǔn)的既是食品又是藥品的物品原料，但目前有關(guān)桑葉的研究報道多為其藥理作用及化學(xué)成分分析研究［4-6］，未見其毒理研究報道。我國傳統(tǒng)的中草藥原料有些具有毒性甚至較高毒性，因此對于這類中藥原料的毒性應(yīng)引起足夠重視。為了解桑葉水提取液安全性，本實驗對其進(jìn)行了相關(guān)毒理學(xué)實驗研究，為后續(xù)綜合開發(fā)利用桑葉資源提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物與環(huán)境 SPF級ICR小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號SCXK（滬）2007-0005，動物合格證號為0037907。小鼠飼養(yǎng)于浙江大學(xué)實驗動物中心，許可證號SYXK（浙）2007-0098。環(huán)境溫度20.8～23.7℃，相對濕度48.7%～58.9%，壓力33.4～46.8 Pa，換氣次數(shù)為＞15次/h，明暗交替12 h/12 h。

1.2 藥物 桑葉購自浙江杭州九洲大藥房，產(chǎn)自廣東，批號110501。取桑葉適量，以10倍體積的水煎煮1 h，提取2次，濾過并將濾液濃縮至相當(dāng)于生藥量1 g/mL，即得桑葉水提取液（MWE）。進(jìn)行Ames試驗和細(xì)胞試驗前，用孔徑0.22μm一次性濾器過濾，備用。

1.3 試驗菌株和細(xì)胞株 組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535）均購自美國Moltox公司。中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL）購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.4 試驗儀器 超低溫冰箱 （702，美國Thermo公司）；高壓滅菌鍋（HVE-50，美國Thermo公司）；液氮罐（Cryosysterm 2000，MVE公司）；超凈工作臺（Nu-425-400E，NUARE）；正置顯微鏡及圖像分析系統(tǒng) （DM4000/ DM2500/DM1000，德國Leica公司）；倒置顯微鏡（DMIL，德國Leica公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（3111，美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 小鼠急性毒性試驗 取符合要求的SPF級ICR小鼠40只，雌雄各半。按體質(zhì)量隨機分成兩組，每組20只。采用最大給藥量法，設(shè)定桑葉水提取液 （1 g/mL）組和蒸餾水對照組，直接灌胃 （ig）給予，灌胃容量為0.4 mL/ 10 g。給藥后連續(xù)觀察3 h，后每天觀察1次，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠死亡情況及中毒體征，處死并進(jìn)行尸檢。

2.2 Ames試驗［7-8］采用標(biāo)準(zhǔn)Ames法，2種平板摻入試驗條件 （非代謝活化-S9和代謝活化+S9），TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535為試驗用菌株。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)定含有不同桑葉水提取液 （5 000、1 000、200、40、8μg/皿），和蒸餾水陰性對照 （100μL/皿）、標(biāo)準(zhǔn)陽性對照敵克松 （50μg/皿，-S9）、疊氮鈉 （2μg/皿，-S9）、二氨基芴 （20μg/皿，+S9）、環(huán)磷酰胺 （200μg/皿，+ S9），分別加入含0.1mL增菌液的2mL頂層培養(yǎng)基中混勻倒入底層培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)48 h，計算每皿回變菌落數(shù)。

2.3 中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞 （CHL）染色體畸變試驗［9-10］

采用桑葉水提液IC50（2.00 mg/m L）作為染色體畸變試驗的最高試驗質(zhì)量濃度，以下設(shè)1.00、0.50 mg/mL兩個試驗濃度組，同時設(shè)定陰性對照組（RPMI1640，0.1 mL/孔）和陽性對照（環(huán)磷酰胺50μg/mL，絲裂霉素0.2μg/mL）。在活化 （+S9）條件下各劑量組處理CHL細(xì)胞6 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。在非活化 （-S9）條件下，各劑量組處理CHL細(xì)胞6 h，24 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。終止培養(yǎng)前4 h加10μg/mL秋水仙素溶液。常規(guī)消化、收獲CHL細(xì)胞。經(jīng)0.075 mol/L KCl低滲，固定液（甲醇-冰醋酸為3：1）預(yù)固定、固定、再固定等步驟后，將細(xì)胞滴在預(yù)冷的潔凈載玻片上。染色，沖洗，晾干，備鏡檢。

2.4 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗［11］采用桑葉水提取液40、20、10 g/kg 3個劑量組，同時設(shè)陰性對照組 （蒸餾水，40mL/kg）和陽性對照組 （環(huán)磷酰胺，50 mg/kg），采用經(jīng)口灌胃30 h染毒法進(jìn)行試驗。在0 h、24 h各組均灌胃1次，末次灌胃后6 h，將小鼠頸椎脫臼處死，剪取雙側(cè)股骨用小牛血清稀釋涂片，經(jīng)甲醇固定，Giemsa染色后雙盲閱片。每只小鼠計數(shù)2 000個嗜多染紅細(xì)胞 （PEC）的微核發(fā)生率 （MN‰），同時計數(shù)200成熟紅細(xì)胞 （RBC）中PEC/RBC值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均計算組平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，急性毒性試驗和致突變結(jié)果采用t檢驗，誘發(fā)微核作用和染色體畸變比較采用χ2檢驗。

3 結(jié)果

3.1 小鼠急性毒性試驗 給藥后30 min內(nèi)桑葉水提取液組小鼠主要出現(xiàn)梳理毛發(fā)、活動減少和豎毛情況，其他行為活動均正常，給藥后1 h行為活動無明顯異常。蒸餾水對照組小鼠給予蒸餾水30 min后出現(xiàn)豎毛現(xiàn)象，其余活動均正常。觀察期間兩組小鼠均未出現(xiàn)死亡，體質(zhì)量隨著觀察時間延長而增加。桑葉水提取液組小鼠體質(zhì)量與蒸餾水組比較無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0.05）。詳見表1。觀察期結(jié)束對小鼠進(jìn)行病理解剖，肉眼觀察心臟、肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、胃腸道等均未見明顯異常。試驗結(jié)果表明桑葉水提取液最大給藥量為40 g/kg。

表1 桑葉水提液小鼠急性毒性試驗體質(zhì)量影響 （，n=20）

表1 桑葉水提液小鼠急性毒性試驗體質(zhì)量影響 （，n=20）

D2 D4 D6 D8 D10 D12 D14蒸餾水對照組組別觀察期小鼠體質(zhì)量/g 22.5±1.3 25.5±1.5 27.5±2.1 28.7±2.5 29.7±3.0 31.1±3.5 32.1±3.6桑葉水提液組22.6±1.3 25.3±1.9 27.0±2.3 28.2±2.9 29.4±3.4 30.5±3.7 31.7±3.9

3.2 Ames試驗 陽性對照組均顯著增加相應(yīng)菌株的回變菌落數(shù)，與陰性對照組比較有顯著性差異 （P＜0.01），且回復(fù)突變菌落數(shù)均高于陰性對照組兩倍以上，表明本測試系統(tǒng)符合測試要求。在非活化系統(tǒng)條件下，桑葉水提取液5 000μg/皿、1 000μg/皿和200μg/皿劑量組TA97菌株回變菌落數(shù)與陰性對照組比較減少，且有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0.05）。活化代謝條件下，除TA102菌株外，5 000μg/皿劑量組各菌株回復(fù)突變數(shù)與陰性對照組比較顯著減少（P＜0.05）。未見桑葉水提取液誘發(fā)基因回復(fù)突變作用，詳見表2。

表2 桑葉水提液Ames試驗結(jié)果（）

表2 桑葉水提液Ames試驗結(jié)果（）

注：與陰性對照組比較，+表示超過兩倍以上，視為陽性；t檢驗，*P＜0.05，**P＜0.01

TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 5 000（-S9） 10.2±2.1** 2.2±0.5* 16.7±6.5**劑量組別（μg/皿）259.7±9.7 9.7±3.2 1 000（-S9） 89.7±4.9* 5.7±5.1 84.7±5.0 284.3±53.3 10.0±4.0 200（-S9） 86.0±5.6* 11.0±5.0 86.3±3.8 288.3±11.1 8.3±1.5 40（-S9） 106.3±9.1 12.7±3.1 105.3±14.2 266.0±35.4 8.7±3.1 8（-S9） 107.0±6.2 14.0±2.0 106.7±7.6 295.0±24.6 12.0±2.0陽性組（-S9） 1 026.7±47.2**+ 659.3±40.2**+ 650.7±20.0**+ 1 114.0±100.0**+ 585.7±189.4**+陰性組（-S9） 107.0±7.9 16.0±6.6 96.3±17.9 284.3±30.8 14.7±4.2 5 000（+S9） 18±1.7** 9.7±0.2** 42.0±4.6* 188.0±59.0 3.3±1.5*1 000（+S9） 89.3±15.6 18.3±2.2 86.0±25.1 255.0±5.6 7.7±2.5 200（+S9） 99.3±13.7 23.7±4.2 95.3±1.5 275.0±60.7 8.3±3.1 40（+S9） 101.3±6.7 20.7±8.7 89.7±13.3 259.7±17.9 8.7±1.5 8（+S9） 96.7±9.9 23.0±3.6 97.7±15.7 258.3±7.6 9.0±2.6陽性組（+S9） 781.0±102.1**+ 936.3±121.2**+ 644.7±149.5**+ 771.3±88.5**+ 240.3±16.5**+陰性組（+S9）104.7±13.6 16.7±2.5 92.3±22.8 246.0±31.1 9.7±2.5

3.3 CHL細(xì)胞染色體畸變試驗 桑葉水提取液高、中、低劑量的中期相染色體結(jié)構(gòu)畸變率均＜5%，與陰性對照組比較無顯著性差異 （P＞0.05）。而陽性對照組，染色體結(jié)構(gòu)畸變率均＞10%，明顯高于陰性對照組 （P＜0.01），顯示陽性結(jié)果。因此，在活化和非活化條件下，桑葉水提取液質(zhì)量濃度小于2 mg/m L對CHL細(xì)胞無明顯的染色體畸變作用。詳見表3。

表3 桑葉水提取液對中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞染色體畸變作用

3.4 小鼠骨髓微核試驗 陽性對照組較蒸餾水對照組微核率顯著增加 （P＜0.01），顯示陽性結(jié)果。桑葉水提取各劑量組微核率與蒸餾水對照組比較無顯著性差異 （P＞0.05），表明桑葉水提取劑量小于40 g/kg灌胃對小鼠的微核形成無明顯影響。且各組嗜多染紅細(xì)胞與總紅細(xì)胞比值（PCE/RBC）范圍處于0.36～0.60間，表明PCE形成正常，試驗結(jié)果可靠，詳見表4。

表4 桑葉水提液對小鼠骨髓PCE微核率的影響

4 討論

文獻(xiàn)報道，桑葉水提物對金黃色葡萄球菌（ATCC26001）、金黃色葡萄球菌耐藥株、大腸桿菌（ATCC25—922）、綠膿桿菌 （ATCC10104）、甲型溶血性鏈球菌（ATCC32205）、乙型溶血性鏈球菌（ATCC32210）均有一定的的抗菌作用，且隨著濃度增加，其抑菌率明顯增高［12-14］。本次Ames試驗觀察到桑葉水提取液高劑量組各試驗菌株回復(fù)突變菌落數(shù)明顯小于自發(fā)回變數(shù)，提示桑葉水提取液對沙門氏菌有明顯抑制作用，與文獻(xiàn)報道一致［15］。

隨著人們生活水平的提高，糖尿病成為繼心腦血管疾病、癌癥之后危害人類健康的第三大疾病之一?；瘜W(xué)藥物降血糖作用較好，但治療并發(fā)癥方面有明顯不足，且多易產(chǎn)生不良反應(yīng)和耐藥性，而天然藥物桑葉不良反應(yīng)小，在降血糖的同時還可對抗糖尿病并發(fā)癥，有著西藥不可替代的綜合優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用空間。我國桑樹資源豐富，為預(yù)測其對人體潛在的威脅，本實驗從體外到體內(nèi)，從微生物到離體細(xì)胞，再到體細(xì)胞對桑葉水提液進(jìn)行毒性研究。測試體系符合國際標(biāo)準(zhǔn)化要求，試驗結(jié)果表明桑葉水提液在本實驗劑量范圍內(nèi)未見明顯毒性作用，無致突變作用，安全性高，本研究也將為桑葉資源進(jìn)一步開發(fā)利用及臨床安全使用提供科學(xué)依據(jù)。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0876-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.042

2014-02-04

浙江省實驗動物科技計劃 （2011C37097）

吳友蘋 （1982—），女，醫(yī)學(xué)碩士，藥劑師，主要從事藥物臨床前安全性評價及醫(yī)院藥學(xué)服務(wù)。Tel：（0571）88022520，E-mail：woyaojizu@126.com