馬錦錦， 林娟娜， 魏崧丞， 葉開和， 劉清霞， 王小康， 葉春玲

（暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州510632）

葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及構(gòu)效分析

馬錦錦， 林娟娜， 魏崧丞， 葉開和， 劉清霞， 王小康， 葉春玲*

（暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州510632）

目的觀察葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響，并分析其構(gòu)效關(guān)系。方法以蔗糖作為底物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立α-葡萄糖苷酶-蔗糖篩選模型，觀察葛根異黃酮類化合物 （0.1、1、10、100μmol/L）對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結(jié)果大豆素、刺芒柄花素、大豆苷、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，其中大豆素、刺芒柄花素在100μmol/L時(shí)對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯強(qiáng)于阿卡波糖（P＜0.01），其抑制率分別達(dá)37.56%和32.11%。3＇-羥基葛根素在0.1μmol/L時(shí)的抑制作用較強(qiáng)，但在100μmol/L的作用減弱。經(jīng)構(gòu)效分析發(fā)現(xiàn)：在大劑量時(shí)，異黃酮母核的3位和5位的取代基為羥基且其他位未被取代時(shí)，其抑制作用增強(qiáng)；4位取代基為糖氧基，活性將減弱；若為多糖氧基，其活性會(huì)更弱；6位為取代基為羥基，在低濃度時(shí)有較強(qiáng)的抑制作用，而在高濃度下作用很弱；若6位為甲氧基時(shí)，且4位被糖氧基取代時(shí)，活性減弱。結(jié)論葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性具有一定抑制作用，其中大豆素、刺芒柄花素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用較強(qiáng)。

葛根；異黃酮類化合物；α-葡萄糖苷酶；抑制；構(gòu)效關(guān)系

葛根（Pueraria Radix）為豆科植物野葛Pueraria Lobata（wild）Ohwi或甘葛藤Pueraria Thomsonii Benth的干燥根。葛根化學(xué)成分中的異黃酮類包括大豆素、大豆苷、3＇-甲氧基葛根素、3＇-羥基葛根素、刺芒柄花素、葛根素等［1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，異黃酮類化合物具有抗氧化，降血糖，降血脂，保護(hù)心肌，擴(kuò)張冠狀血管以及抗血栓等藥理作用［2-3］。異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性是否有影響，目前均尚未清楚，因此，本實(shí)驗(yàn)建立α-葡萄糖苷酶-蔗糖篩選模型，觀察葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響，并對其進(jìn)行構(gòu)效分析。

1 材料

1.1 藥物與試劑 葛根異黃酮類化合物大豆素、大豆苷、刺芒柄花素、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-羥基葛根素、大豆苷元-8-C-芹糖 （1→6）葡萄糖、3＇-甲氧基葛根素，均由暨南大學(xué)中藥與天然藥物化學(xué)研究所提供。α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）、DMSO均購自美國Sigma公司，蔗糖（Sucrose）購自廣州化學(xué)試劑廠，阿卡波糖（Acarbose）購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司，無水碳酸鈉購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，PBS購自博士德生物工程有限公司，葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器 BL255型電子天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Tecan safire2全波長多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan集團(tuán)）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；QL-901型渦旋混合器 （海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 （美國Corning公司）；單道移液器（德國Eppendorf公司）；PHS-3C數(shù)字式酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

2 方法

2.1 葡萄糖的測定 葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和過氧化氫，后者在過氧化物酶的作用下，將還原性4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)合成可被分光光度計(jì)測定的醌類化合物。用0.1 mol/L PBS（pH 6.8）將葡萄糖測定試劑盒中5.55 mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mmol/L，分別取不同濃度的葡萄糖溶液50μL，加入150μL葡萄糖工作液，充分混勻，置于37℃水浴15min，于酶標(biāo)儀為505 nm波長處，以空白調(diào)零，檢測吸光度 （A），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性反應(yīng)體系的建立 反應(yīng)體系總體積為200μL，在70μL PBS（pH 6.8）中加入α-葡萄糖苷酶20μL，37℃預(yù)熱10 min，加入蔗糖10μL，37℃反應(yīng)30 min，再加入0.1 mol/L Na2CO3溶液100μL終止反應(yīng)，取上述反應(yīng)液50μL，加入150μL葡萄糖工作液充分混勻，于37℃水浴15 min，于505 mm波長檢測吸光度 （A）。以不加酶液作為空白對照組，其他組分保持不變，分別改變蔗糖濃度、酶濃度，優(yōu)化反應(yīng)體系。確定反應(yīng)體系后，以阿卡波糖作為陽性藥物，觀察阿卡波糖在濃度為10～104μmol/L時(shí)對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

2.3 葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的測定按 “2.2”項(xiàng)方法優(yōu)化反應(yīng)體系，結(jié)果為：PBS（pH 6.8）50μL，待測樣品20μL，1 U/mLα-葡萄糖苷酶20μL，37℃預(yù)熱10 min，加入0.8mmol/L蔗糖10μL，37℃反應(yīng)30 min，再加入Na2CO3溶液100μL終止反應(yīng)。觀察葛根異黃酮類化合物 （終濃度分別為 0.1、1、10、100 μmol/L）對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。實(shí)驗(yàn)分組及操作過程見表1，每個(gè)濃度做4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

表1 α-葡萄糖苷酶活性反應(yīng)體系

取上述反應(yīng)液50μL，加入150μL葡萄糖工作液充分混勻，于37℃水浴15 min，于505 min波長檢測吸光度（A）。樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的計(jì)算公式：抑制率=（A酶活性對照組-A樣品）/（A酶活性對照組-A酶空白組） ×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 （）表示。不同濃度葛根異黃酮類化合物與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 反應(yīng)體系的建立 按 “2.1”項(xiàng)方法以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線 （y= 0.570 5x+0.000 7，r2=0.999 6），見圖1。確定α-葡萄糖苷酶的濃度后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蔗糖的濃度為0.8 mol/L時(shí)，OD值到達(dá)最高值。因此，選擇0.8 mol/L蔗糖作為反應(yīng)體系的底物濃度，見圖2。以0.8mol/L蔗糖作為底物，當(dāng)酶濃度為1.0 U/mL時(shí)，OD值開始到達(dá)平臺期，葡萄糖生成量也較平緩。因此，選擇1.0 U/mL的α-葡萄糖苷酶作為反應(yīng)體系的酶濃度，見圖3。確定蔗糖濃度和酶濃度后，改變阿卡波糖的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在濃度為10～1×104μmol/L的范圍內(nèi)，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，隨著濃度增加，其抑制率逐漸增大，其IC50為623μmol/L，見圖4。

3.2 葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 反應(yīng)體系蔗糖的濃度

葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，阿卡波糖在100μmol/L時(shí)的抑制率為15.82%。大豆素、刺芒柄花素、大豆苷、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用很強(qiáng)，其中大豆素、刺芒柄花素在100μmol/L時(shí)對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯強(qiáng)于阿卡波糖 （P＜0.01），其抑制率分別達(dá)37.56%和32.11%。而大豆苷、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素在100μmol/L時(shí)的抑制作用增強(qiáng)，與阿卡波糖相比無顯著性差異（P＞0.05）。3＇-羥基葛根素在0.1μmol/L時(shí)的抑制作用較強(qiáng)，但在100μmol/L的作用減弱。詳見圖5。

圖3 反應(yīng)體系酶濃度

圖4 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖5 葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響

3.3 葛根異黃酮類化合物抑制α-葡萄糖苷酶的構(gòu)效關(guān)系葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用可能存在以下的構(gòu)效關(guān)系。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在大劑量時(shí)，異黃酮母核的3位和5位取代基均為羥基且其它位未被取代時(shí)，其抑制作用增強(qiáng)，大豆素比刺芒柄花素或大豆苷的抑制作用更強(qiáng)。若4位取代基為糖氧基，活性將減弱；若為多糖氧基，其活性會(huì)更弱，大豆素的抑制作用強(qiáng)于葛根素，而葛根素又強(qiáng)于大豆苷元-8-C-芹糖 （1→6）葡萄糖；若6位取代基為甲氧基時(shí)，且4位被糖氧基取代時(shí)，活性減弱，3＇-甲氧基大豆素的抑制作用強(qiáng)于3＇-甲氧基葛根素，見表2、圖6。

表2 異黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖6 異黃酮的結(jié)構(gòu)式

4 討論

糖尿病是以高血糖為顯著特征的慢性代謝性疾?。?-5］，餐后高血糖是2型糖尿病早期糖代謝異常的指標(biāo)［6］，因此，降低餐后血糖是防治糖耐量受損 （IGT）、2型糖尿病以及其并發(fā)癥的重要因素［7-8］。α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）存在于小腸黏膜細(xì)胞刷狀緣，是食物中絕大部分碳水化合物消化的一種關(guān)鍵酶，將多糖、雙糖水解成單糖，然后被機(jī)體吸收［9-10］。

α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，減少淀粉和蔗糖的水解，延緩糖的吸收，降低餐后血糖和HbA1c水平，進(jìn)而改善餐后高血糖和高胰島素血癥，這對糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防及治療具有重要的意義［11-12］。一個(gè)理想的葡萄糖苷酶抑制劑往往具有以下幾個(gè)特征：含陽離子、三角形的異頭碳中心、并且有一個(gè)共價(jià)連接的環(huán)形成半椅狀或椅狀構(gòu)型，以及恰當(dāng)?shù)牧u基構(gòu)象。因此，帶有可以質(zhì)子化基團(tuán)的抑制劑可以與酶優(yōu)先結(jié)合，并且這個(gè)質(zhì)子一般是處于環(huán)內(nèi)氧的位置或取代異頭碳，或是在糖苷鍵連接的位點(diǎn)［13-14］。目前上市的 α-葡萄糖苷酶抑制劑具有以上特征，主要有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，具有作用溫和持久、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)［15］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，其中大豆素、刺芒柄花素在100 μmol/L的作用較強(qiáng)，甚至強(qiáng)于阿卡波糖。葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用，這可能與葛根異黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。葛根異黃酮類化合物的基本母核為3-苯基色原酮，經(jīng)構(gòu)效分析發(fā)現(xiàn)：在大劑量時(shí)，異黃酮母核的3位和5位取代基均為羥基且其他位未被取代時(shí)，其抑制作用增強(qiáng)；4位取代基為糖基，其活性減弱；若為多糖基，其活性會(huì)更弱；6位取代基甲氧基時(shí)，且4位被糖氧基取代時(shí)，活性減弱。這與良好的葡萄糖苷酶抑制劑所具有的特征有些差別，但大豆素、刺芒柄花素抑制作用較強(qiáng)，有可能成為潛在的葡萄糖苷酶抑制劑，其有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，抑制α-葡萄糖苷酶，降低餐后血糖，可能也是葛根異黃酮類化合物的降血糖的作用機(jī)制之一。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0858-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.037

2014-01-10

廣東省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目 （cxzd1111）

馬錦錦（1988—），女，碩士生，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌藥理學(xué)。Tel：13719425254，E-mail：majin569@163.com

*通信作者：葉春玲 （1963—），博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閮?nèi)分泌藥理學(xué)。Tel：（020）85223843，E-mail：yechunling2005@163.com