王法琴， 陸兔林， 毛春芹， 張 寧

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210023；2.江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇泰州225300）

3種比色法測(cè)定五味子中多糖

王法琴1， 陸兔林2*， 毛春芹2， 張 寧3

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京210023；2.江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇泰州225300）

目的建立定量測(cè)定五味子中多糖的比色方法。方法采用硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、3，5-二硝基水楊酸法（DNS）三種顯色方式，在相應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)其吸收值并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、3，5-二硝基水楊酸法 （DNS）測(cè)定五味子多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果分別為91.3、83.5、97.6mg/g。結(jié)論硫酸苯酚法操作簡(jiǎn)單易行，測(cè)定五味子多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

五味子；比色方法；多糖；苯酚硫酸法；蒽酮硫酸法；3，5-二硝基水楊酸法

五味子，習(xí)稱北五味子，為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效［1］。研究發(fā)現(xiàn)，北五味子含木脂素、有機(jī)酸、揮發(fā)油、多糖等成分。其中，五味子多糖具有保肝、抗疲勞、免疫促進(jìn)、抗氧化及抗衰老和抗腫瘤等藥理作用，具有較好的臨床療效［2-4］。由于多糖質(zhì)量是保證五味子臨床療效的重要前提，因此就對(duì)五味子中多糖的質(zhì)量評(píng)價(jià)，尤其是其質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的準(zhǔn)確性有了更高的要求［5］。

目前檢測(cè)五味子中多糖的方法主要有高效液相色譜法和比色法，前者因高純度的五味子多糖對(duì)照品難以獲得等因素的制約而較少使用，而后者作為測(cè)量多糖的經(jīng)典方法，操作簡(jiǎn)單易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在五味子多糖的研究中得到了廣泛的應(yīng)用［6-8］。目前測(cè)量五味子多糖的比色法主要有硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、3，5-二硝基水楊酸法（DNS）等［9］，均是以葡萄糖為對(duì)照品，計(jì)算出樣品中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其中硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法是通過硫酸水解多糖，脫水生成糠醛或其衍生物，與相應(yīng)的顯色劑顯色后在特定波長(zhǎng)處有最大吸收［10］，而DNS法是通過DNS試劑與還原糖共熱產(chǎn)生棕紅色化合物，并在特定波長(zhǎng)處有最大吸收，然后測(cè)定總糖供試液和單糖供試液中的單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算時(shí)再將單糖供試液的單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從總糖供試液的單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)中減去，最終算出多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)［11］。本研究旨在通過對(duì)硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、DNS法的對(duì)比，選定一種適合測(cè)定五味子多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比色方法。

1 材料與儀器

TU-1901紫外分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；FA1104N電子分析天平 （上海精科天平儀器廠）；HH-S恒溫水浴鍋 （鞏義市英峪予華儀器有限責(zé)任公司）；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

乙醇、葡萄糖、苯酚、蒽酮，亞硫酸氫鈉，氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉，濃硫酸等均為分析純；3，5-二硝基水楊酸為化學(xué)純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

五味子購(gòu)于無錫李同豐天然藥物有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陸兔林教授鑒定為木蘭科植物五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）的果實(shí)。

3，5-二硝基水楊酸試液根據(jù)唐冰等［12］報(bào)道的方法配制，將制成的試液儲(chǔ)存于棕色瓶中，7 d后使用。

2 方法與結(jié)果

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇 紫外分光光譜顯示，五味子多糖與葡萄糖分別用硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、DNS法顯色后，最大吸收峰位一致，即硫酸苯酚法的最大吸收峰位在490 nm處，硫酸蒽酮法的最大吸收峰位在624 nm處，DNS法的最大吸收峰位在502 nm處。見圖1～3。

圖1 硫酸苯酚法Fig.1 Phenol-sulfuric acid method

2.2 五味子多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱量葡萄糖對(duì)照品25 mg，置于250 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

圖2 硫酸蒽酮法Fig.2 anthrone sulfuric acid method

圖3 DNS法Fig.3 3，5-dinitrosalicylic acid method

2.2.2.1 硫酸苯酚法 精密吸取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于干燥的具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2 mL，精密加入5%苯酚1 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出后迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外分光光度法，在490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程為：y= 54.902x+0.008 8，r=0.998 30。在0.002 54～0.012 7 mg/mL之間，葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.2 硫酸蒽酮法 精密吸取0.1 mg/m L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分別置于干燥的具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2 m L，精密加入硫酸蒽酮試液 （取蒽酮0.1 g，加80%硫酸100 m L溶解）6 mL，置沸水浴中反應(yīng)15 min，取出后迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外分光光度法，在624 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程為：y=37.508x+0.006 8，r=0.998 85。在0.002 54～0.015 24 mg/mL之間，葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.3 DNS法 精密吸取0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于干燥的具塞試管中，分別精密加入DNS試液2 mL混勻，置于沸水浴中加熱5 min，取出，立即冷卻至室溫，加水補(bǔ)足至8 mL搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外分光光度法，在502 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程為：y= 10.159x+0.046 4，r=0.996 24。在0.012 7～0.076 2 mg/mL之間，葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 供試品溶液的制備及比色條件

2.2.3.1 硫酸苯酚法 取干燥五味子粉末5 g，用80%乙醇60 m L回流提取2 h，趁熱過濾，藥渣加60 mL純化水回流提取2 h，趁熱過濾，合并濾過液，定容至100 mL［13-15］。精密吸取1.0 mL，置于50 m L量瓶?jī)?nèi)，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1 mL置于干燥的具塞試管中，加水1.0 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自 “各精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/m L），計(jì)算，即得。

2.2.3.2 硫酸蒽酮法 取干燥五味子粉末5 g，用80%乙醇60 mL回流提取2 h，趁熱過濾，藥渣加60 m L純化水回流提取2 h，趁熱過濾，合并濾過液，定容至100 mL［13-15］。精密吸取五味子多糖溶液1.0 mL，置于50 mL量瓶?jī)?nèi)，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1 mL置于干燥的具塞試管中，加水1.0 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自 “精密加入硫酸蒽酮試液 （取蒽酮0.1 g，加80%硫酸100 mL溶解）6 mL”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的質(zhì)量濃度 （mg/mL），計(jì)算，即得。

2.2.3.3 DNS法 （1）總糖溶液［11］：取干燥五味子粉末5 g，用80%乙醇60mL回流提取2 h，趁熱過濾，藥渣加60 mL純化水回流提取2 h，趁熱過濾，合并濾過液，定容至100 mL［13-15］。精密量取1.0 mL置于50 mL磨口三角燒瓶中，加3 mol/L鹽酸溶液20 mL，混勻，密塞，置于沸水浴中加熱30min，用流水冷卻后加酚酞指示液1滴，用20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至微紅色，全部轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液3 mL置于干燥的具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“分別精密加入DNS試液2 mL混勻”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的質(zhì)量濃度 （mg/mL），計(jì)算，即得。

（2）單糖溶液的制備［11］：取干燥五味子粉末5 g，用80%乙醇60 mL回流提取2 h，趁熱過濾，藥渣加60 m L純化水回流提取2 h，趁熱過濾，合并濾過液，定容至 100 mL［13-15］。精密量取 2.0 mL，置于25 mL量瓶?jī)?nèi)，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液5 mL置于干燥的具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自 “分別精密加入DNS試液2 mL混勻”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/m L），計(jì)算，即得。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取葡萄糖對(duì)照品溶液以及相應(yīng)的供試品溶液，分別按照硫酸苯酚法，硫酸蒽酮法，DNS法測(cè)其吸光度，連續(xù)測(cè)定6次。各方法對(duì)照品、供試品精密度RSD結(jié)果，硫酸苯酚法為0.2%、0.3%；硫酸蒽酮法為0.1%、0.3%；DNS法為0.2%、0.1%（總糖）、0.5%（單糖）。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取葡萄糖對(duì)照品溶液以及相應(yīng)的供試品溶液，分別按照硫酸苯酚法，硫酸蒽酮法，DNS法測(cè)其吸光度，每間隔10 min測(cè)定一次，共測(cè)6次。硫酸苯酚法對(duì)照品、供試品穩(wěn)定性RSD為0.8%、0.6%；硫酸蒽酮法為0.8%、0.8%；DNS法為1.7%、0.4% （總糖）、2.7% （單糖）。結(jié)果表明：硫酸苯酚法，硫酸蒽酮法，DNS法的對(duì)照品和供試品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 各精密稱取5份干燥五味子粉末5 g，按 “2.2.3”項(xiàng)下硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、DNS法的供試品溶液制備方法制備供試品液，顯色后測(cè)其吸光度，并計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果5份樣品用硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、DNS法測(cè)得多糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：91.3 mg/g、83.5 mg/g、97.6 mg/g（總糖-單糖）。RSD分別為1.6%、2.1%、1.2%。結(jié)果表明，硫酸苯酚法，硫酸蒽酮法，DNS法的重復(fù)性良好。

2.2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 各精密稱取9份干燥五味子粉末2.5 g，置于圓底燒瓶中，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的葡萄糖對(duì)照品溶液 （硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、DNS法使用的對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為230.19、210.56、250.34、15.62 mg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，按 “2.2.3”項(xiàng)下硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、DNS法的供試品溶液制備方法制備供試品液，并測(cè)其吸光度，外標(biāo)兩點(diǎn)法 （各方法線性回歸方程分別為：y=62.02x-0.080；y=40.65 x-0.029；y=11.57x+0.007）計(jì)算各方法準(zhǔn)確度結(jié)果。硫酸苯酚法：平均回收率為99.8% （n=9）；RSD為1.1%。硫酸蒽酮法：平均回收率為99.2%（n=9）；RSD為1.6%。DNS法：總糖平均回收率為99.1% （n=9），RSD為1.5%；單糖平均回收率為99.6% （n=9）；RSD為1.8%。見表1～表4。

表1 硫酸苯酚法準(zhǔn)確度考察結(jié)果Tab.1 Accu racy results for phenol sulfu ric acid method

表2 硫酸蒽酮法準(zhǔn)確度考察結(jié)果Tab.2 Accuracy results for anthrone sulfuric acid method

表3 DNS法總糖準(zhǔn)確度考察結(jié)果Tab.3 Accuracy results of total amoonosaccharide for DNS

表4 DNS法單糖準(zhǔn)確度考察結(jié)果Tab.4 Accuracy results of amoonosaccharide for DNS

2.2.8 樣品中五味子多糖測(cè)定 分別取3批北五味子樣品，各精密稱取5份干燥五味子粉末5 g，按 “2.2.3”項(xiàng)下硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、DNS法的供試品溶液制備方法制備供試品液，顯色后測(cè)其吸光度，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表5。

表5 五味子中多糖樣品測(cè)定結(jié)果Tab.5 Content results of polysaccharide from three batches of Fructus Schisandrae

3 討論

對(duì)在相同質(zhì)量濃度下，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的吸光度值進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，硫酸苯酚法大于硫酸蒽酮法及DNS法，因此可認(rèn)為此法測(cè)定結(jié)果更為靈敏。

硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法顯色原理大致相同，均是多糖在強(qiáng)酸性條件下水解成單糖，單糖再進(jìn)一步脫水形成糖醛衍生物而顯色。然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法測(cè)定五味子中多糖的結(jié)果相差近10%，原因可能是組成該成分的不同單糖與硫酸苯酚或硫酸蒽酮試劑在反應(yīng)條件方面有不同，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。有關(guān)五味子單糖的組成及兩種顯色方法的最佳反應(yīng)條件尚有待進(jìn)一步研究。

用DNS法測(cè)定單糖供試品溶液中單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其吸收值極小，幾乎可以忽略不計(jì)。這一結(jié)果表明五味子多糖提取液中單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，原因可能是本工藝在水提取五味子多糖前用80%乙醇回流，去除木脂素，單糖等雜質(zhì)，消除了它們對(duì)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的影響，因此用DNS法的優(yōu)勢(shì)不明顯。

從各方面的數(shù)據(jù)分析比較后發(fā)現(xiàn)，采用苯酚法測(cè)定結(jié)果比較穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單易行，因而可認(rèn)為此法是測(cè)定五味子中多糖較為理想的方法。但因苯酚容易氧化，見光或遇氧即逐漸氧化成淡紅色物質(zhì)，因此在測(cè)定中應(yīng)該避光，且操作要迅速。

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Determ ination of polysaccharides from Schisandrae chinensis Fructus by three colorim etric m ethod

WANG Fa-qin1， LU Tu-lin2*， MAO Chun-qin2， ZHANG Ning3

（1.College of Pharmacy，Nanjing University of Traditional ChineseMedicine，Nanjing 210023，China；2.Key Research Laboratory of ChineseMedicine Processing of Jiangsu Province，Nanjing 210023，China；3.College of Hanlin，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Taizhou 225300，China）

Schisandrae chinensis Fructus；colorimetric method；polysaccharide；phenol-sulfuric acid method；anthrone sulfuric acid method；3，5-dinitrosalicylic acid method

R284.1

A

1001-1528（2015）04-0814-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.026

2014-06-11

中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 （2012ZX09304005003）；江蘇省中醫(yī)藥管理局“基于一測(cè)多評(píng)及其對(duì)照提取物的五味子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)模式構(gòu)建”（LZ13022）；江蘇省2013年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目，南京中醫(yī)藥大學(xué) “基于微透析技術(shù)的五味子醋制入肝效應(yīng)機(jī)制研究”（CXLX13_597）

王法琴（1982—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及新藥。Tel：18913857699，E-mail：wangfaqin429@163.com

*通信作者：陸兔林 （1963—），男，教授，研究方向?yàn)橹兴幣谥萍爸兴庯嬈|(zhì)量。Tel：（025）85811835