胡煒彥， 李 菊， 賀智勇， 付 昆， 張榮平*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床研究院，云南昆明650500；3.云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500）

重樓皂苷Ⅰ對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7體內(nèi)外生長(zhǎng)的抑制作用

胡煒彥1，2*， 李 菊3， 賀智勇2， 付 昆1， 張榮平1*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床研究院，云南昆明650500；3.云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500）

目的探討重樓皂苷Ⅰ（PSI）對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7體內(nèi)外生長(zhǎng)的抑制作用及其作用機(jī)制。方法CCK-8法檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)MCF-7體外生長(zhǎng)的抑制作用，將其接種于正常小鼠左前肢腋窩皮下復(fù)制MCF-7荷瘤模型，然后分為模型對(duì)照組、環(huán)磷酰胺 （30mg/kg）組和PSI高、中、低劑量 （60、30、15 mg/kg）組，腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)15 d。末次給藥后處死小鼠，剝離完整的腫瘤組織，稱定質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率，Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)。結(jié)果PSI可顯著抑制MCF-7生長(zhǎng)，高、中劑量重樓皂苷Ⅰ組的作用更為明顯（P＜0.01或P＜0.05），抑制率分別為64.34%和39.86%。另外，以上兩組還可明顯下調(diào)Bcl-2、Bax，上調(diào)剪切型Caspase-3表達(dá)（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論重樓皂苷Ⅰ對(duì)MCF-7生長(zhǎng)具有抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3有關(guān)。

重樓皂苷Ⅰ；MCF-7；Bcl-2；Bax；Caspase-3

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，目前其發(fā)病率逐年上升，已成為全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，不僅嚴(yán)重威脅女性的身體健康和生活質(zhì)量，而且給全球衛(wèi)生系統(tǒng)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，已成為當(dāng)前社會(huì)的重大公共衛(wèi)生問題［1-2］。如今乳腺癌的治療手段主要是手術(shù)和化療，而化療藥物效果在一定范圍內(nèi)與劑量成正比，隨著用藥劑量增加，發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)也隨之上升。另外，手術(shù)治療又會(huì)給患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和身心傷害。因此，從天然植物中尋找安全有效的抗腫瘤藥物是近年來的研究熱點(diǎn)，中藥及其有效成分的相關(guān)研究也已經(jīng)取得很大進(jìn)展［3］。研究發(fā)現(xiàn)［4-5］，中藥活性成分能對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的相關(guān)基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，直接或間接地影響細(xì)胞周期改變，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，中藥在預(yù)防乳腺癌及控制復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面也有著不可忽視的作用。

重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.Mazz.或七葉一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根莖，有小毒，具有清熱解毒、消腫止痛等功效，用于治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛等癥狀，其活性成分主要是甾體皂苷［6］。本實(shí)驗(yàn)采用人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，建立小鼠荷瘤模型，觀察重樓中的主要成分重樓皂苷Ⅰ（PSI）對(duì)MCF-7體內(nèi)外生長(zhǎng)的抑制作用，為乳腺癌治療提供新的途徑。

1 材料

重樓皂苷Ⅰ （PSI，云南植物藥業(yè)有限公司研發(fā)中心，純度為95%）。提取分離方法為云南重樓粗粉用75%乙醇提取，提取液減壓濃縮后經(jīng)大孔樹脂柱層析，分離得到總皂苷類成分，再經(jīng)正相和反相硅膠柱層析，即得；環(huán)磷酰胺 （CTX，云南省腫瘤病醫(yī)院）。

清潔級(jí)C57小鼠60只，8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g（昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK［滇］-2011004）。

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所），本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)，生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，再置于37℃恒溫，5%CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜DMSO（中生華美北京科技有限公司）；CCK-8試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；β-actin抗體（美國(guó)Sigma公司）；Bcl-2、Bax抗體（美國(guó)BD公司）；Caspase-3、cleaved Caspase-3抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；RIPA蛋白提取液（150 mmol/L NaCl、1.0%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS、50 mmol/L Tris-HCl，pH為8，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 CCK-8檢測(cè)PSI對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7體外生長(zhǎng)的抑制作用 將培養(yǎng)好的MCF-7配成1×105個(gè)/mL密度的單細(xì)胞懸液，接種到96孔板上，每孔100μL，然后置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2濃度下培養(yǎng)24 h。然后，將不同質(zhì)量濃度的PSI溶液 （5、10、20、40、80、160μg/mL）和CTX溶液 （5、10，20、40、80、160μg/mL）依次加到預(yù)先鋪好細(xì)胞的96孔板上，每孔100μL，設(shè)置3個(gè)平行孔。藥物分別處理24和48 h后，每孔加入CCK-8溶液20μL，設(shè)置加入相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液，但沒有加入細(xì)胞的孔作為試劑空白對(duì)照，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，450 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞活力，公式如下。

各組細(xì)胞活力=各組吸光度/溶劑空白對(duì)照組吸光度×100%

2.2 復(fù)制荷瘤動(dòng)物模型 將培養(yǎng)好的MCF-7配成1×107個(gè)/mL密度的單細(xì)胞懸液，取其中0.2 mL接種于正常小鼠左前肢腋窩皮下，制備荷瘤模型。

2.3 動(dòng)物分組與給藥 接種24 h后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型對(duì)照組 （生理鹽水）、CTX（30 mg/kg）組和PSI高、中、低劑量 （60、30、15 mg/kg）組。每天上午9點(diǎn)腹腔注射給藥，給藥量為20mL/kg，連續(xù)15 d。

2.4 抑瘤率的測(cè)定 末次給藥24 h后，脫頸法處死小鼠，無菌條件下剝?nèi)⊥暾哪[瘤組織，稱定質(zhì)量，并按下列公式計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率 （%）=（1-給藥組平均瘤質(zhì)量/模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）×100%。

2.5 蛋白質(zhì)表達(dá)的測(cè)定

2.5.1 蛋白質(zhì)的提取 將各組腫瘤組織樣本在冰塊上充分碾磨后，置于1.5mL離心管中，加入蛋白裂解液 （1 mL/ 100 mg，使用前加入1%的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）。4℃下?lián)u床震搖1 h，后離心15 min（4℃，13 000 r/m in），收集上清液。測(cè)定蛋白濃度后，將蛋白提取液按4∶1的體積比加入5×電泳樣品緩沖液，沸水浴中煮5 min，使蛋白質(zhì)充分變性，-80℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定 蛋白定量采用BCA試劑盒，按照說明書步驟操作，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白濃度，用Model 2550 EIA reader在600 nm下讀取OD值。

2.5.3 蛋白質(zhì)的分離檢測(cè) 5%濃縮膠和12%SDS-PAGE分離總蛋白，之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，封閉后的膜用TBST洗滌3次，加入一抗在4℃下孵育過夜，使抗原和抗體充分結(jié)合。接著，再用TBST洗滌3次，放入新雜交袋中，加入二抗以結(jié)合一抗，室溫下孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照成像，目的蛋白灰度值除以內(nèi)參β-actin灰度值以校正誤差，所得結(jié)果即為某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，并使用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素ANOVA（方差分析）法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 重樓皂苷Ⅰ（PSI）對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7體外生長(zhǎng)的抑制作用 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，重樓皂苷Ⅰ對(duì)MCF-7具有明顯的抑制作用，并呈一定的劑量依賴性。PSI處理24 h、48 h后的IC50分別為22.95、10.25 μg/mL；CTX處理24 h、48 h后的IC50分別為18.95、9.04 μg/mL，見圖1。

圖1 重樓皂苷Ⅰ和環(huán)磷酰胺對(duì)M CF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

3.2 重樓皂苷Ⅰ對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用 與模型對(duì)照組比較，PSI高、中劑量組的瘤質(zhì)量顯著減輕 （P＜0.01或P＜0.05），而且高、中、低劑量組的抑瘤率分別為64.34%、39.86%、20.28%，表明其對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤作用呈劑量依賴性，見表1。

3.3 重樓皂苷Ⅰ對(duì)腫瘤組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響 與模型對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅰ高、中劑量組Bcl-2、Bax水平明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），其剪切型Caspase-3水平明顯上升 （P＜0.05），總Caspase-3水平無明顯變化，cleaved Caspase-3/Caspase-3比值顯著增加 （P＜0.01或P＜0.05），見圖2。

表1 PSI對(duì)模型小鼠的抑瘤作用(x±s,n=10)

圖2 重樓皂苷Ⅰ對(duì)腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (n=3)

4 討論

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，乳腺癌居女性癌癥發(fā)病的第1位，死亡率居女性癌癥死因的第6位，其患病率逐年上升，大中城市尤為突出［2，7］。目前，皂苷抗腫瘤機(jī)制為中藥抗腫瘤研究熱點(diǎn)之一。Cheng等［8］證實(shí)，大豆皂苷具有抗癌性。尤玲玲等［9］報(bào)道，苦瓜皂苷具有抗腫瘤細(xì)胞增殖的活性。重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于臃腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、涼風(fēng)抽搐等癥狀的治療。除此之外，它作為民間抗癌藥，還廣泛應(yīng)用于治療惡性淋巴瘤、肺癌、鼻咽癌、腦腫瘤及消化系統(tǒng)腫瘤等［10］。

重樓皂苷為重樓的主要活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、消炎、止血、抗氧化、促進(jìn)子宮收縮和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等藥理作用。文獻(xiàn) ［11］報(bào)道，它具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用，能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞及移植瘤，并誘導(dǎo)其凋亡。PSI是從重樓中提取的甾體皂苷，研究表明它在體內(nèi)外均具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用［12-13］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)重樓皂苷Ⅰ體內(nèi)外抑制乳腺癌MCF-7生長(zhǎng)的情況進(jìn)行了研究。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ在體外能顯著抑制MCF-7生長(zhǎng)，并呈一定的時(shí)間和劑量依賴性，處理24 h、48 h后的IC50分別為22.95、10.25μg/mL。另外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PSI能顯著抑制MCF-7荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，高、中劑量重樓皂苷Ⅰ對(duì)其抑制率分別為64.34%、39.86%。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，高、中劑量重樓皂苷Ⅰ可明顯降低腫瘤組織中Bcl-2和Bax水平，同時(shí)上升剪切型Caspase-3水平。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡在腫瘤治療中有著重要意義，已有許多研究證實(shí)，重樓抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)是通過凋亡途徑來實(shí)現(xiàn)的。Xiao等［12］發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ通過線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制裸鼠卵巢癌移植瘤模型的腫瘤生長(zhǎng)。高冬等［14］報(bào)道，重樓可能是通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。Yan等［15］研究表明，重樓皂苷能顯著誘導(dǎo)肺腺癌LA795細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ能夠顯著抑制MCF-7體內(nèi)外生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，這將為乳腺癌的臨床研究和開發(fā)新的抗乳腺癌藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是，由于本實(shí)驗(yàn)僅選擇了一株人乳腺癌細(xì)胞株，相關(guān)指標(biāo)不夠全面，因此需要在以后實(shí)驗(yàn)中做更廣泛深入的研究。

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R966

：B

：1001-1528（2015）07-1582-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.043

2014-03-12

云南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目 （2011YXZD07）

胡煒彥（1978—），女，碩士，講師，從事藥學(xué)教學(xué)科研工作。E-mail：huweiyan2004@163.com *通信作者：張榮平 （1964—），男，博士，教授，從事天然產(chǎn)物研究開發(fā)工作。E-mail：zhrp@163.com