何 娟， 曹文富，2*， 王海蘭， 韓仕慶

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥研究室，重慶400016）

川芎含藥血清對大鼠肝星狀細胞大麻素受體1相關(guān)信號通路的影響

何 娟1， 曹文富1，2*， 王海蘭1， 韓仕慶1

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥研究室，重慶400016）

目的觀察川芎含藥血清對血小板源生長因子（PDGF-BB）活化的大鼠肝星狀細胞（HSCs）大麻素受體1（CB1）、黏著斑激酶 （FAK）及磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 （p-Akt）蛋白表達的影響，探討其抗纖維化的作用機制。方法制備川芎含藥血清，MTT法檢測川芎含藥血清對肝星狀細胞增殖情況，Western blot法分析肝星狀細胞CB1、FAK、p-Akt蛋白的表達。結(jié)果與正常對照組相比，PDGF-BB作用24 h能刺激HSCs增殖，上調(diào)CB1、FAK、p-Akt蛋白的表達；川芎含藥血清、秋水仙堿及大麻素受體1抑制劑AM251均能明顯抑制上述效應(yīng)；且加入AM251后，川芎含藥血清對上述效應(yīng)的抑制效果增強，且作用呈劑量依賴性。結(jié)論川芎含藥血清可能通過大麻素相關(guān)信號通路抑制HSCs增殖，從而發(fā)揮防治肝纖維化的作用。

川芎含藥血清；肝纖維化；肝星狀細胞；大麻素受體1相關(guān)信號通路；黏著斑激酶；磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endogenous cannabinoid system，ECS）是由內(nèi)源性大麻素、大麻素受體及參與生物合成、降解的酶組成，主要分布于腦部，在外周組織也有分布，包括肝臟。在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)、能量代謝等方面均發(fā)揮著重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，整個肝臟均有CB1（cannabinoid receptor 1）、CB2低水平表達，在肝臟受損時表達水平明顯上調(diào)，并在慢性肝病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［1］。具有活血化瘀功能的中藥川芎在防治肝纖維化方面一直是研究的熱點，本實驗以血小板源生長因子（PDGF-BB）為刺激因子，觀察川芎含藥血清對大鼠HSCs（hepatic stellate cells）增殖及CB1、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）及磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，p-Akt）表達的影響，進一步闡明川芎抗纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 肝星狀細胞 大鼠肝星狀細胞購買于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科。在含體積分數(shù)為10%胎牛血清、含青鏈霉素各100 U/mL的改良型1640培養(yǎng)基、37℃、CO2體積分數(shù)5%、飽和濕度的條件下培養(yǎng)細胞，用0.25%胰酶消化傳代。

1.1.2 主要試劑 血小板源性生長因子（PDGFBB）購自美國PEPROTECH公司，大麻素受體1抑制劑（AM251）購自美國Selleck公司，兔抗人CB1多克隆抗體、兔抗人FAK多克隆抗體、兔抗人p-Akt多克隆抗體購自北京博奧森公司，胎牛血清、0.25%胰酶、改良型1640購自Hyclone公司。

1.1.3 中藥水煎劑的制備 川芎購于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，按 “動物與人體的千克體質(zhì)量折算系數(shù)表” （成人與大鼠折算系數(shù)為6.25），計算大鼠灌胃劑量，得出大鼠相對于成人臨床等效劑量為1.06 g/kg，按照2倍、4倍來選擇劑量，得出小劑量為2.12 g/kg，大劑量為4.24 g/kg。加水煎煮，濾過備用。秋水仙堿由西雙版納藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn) （國藥準字H53021369）。

1.1.4 川芎含藥血清的制備 清潔級SD雄性大鼠40只 （購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SYXK（渝）2012-0001），體質(zhì)量180～220 g。隨機分為空白對照組、川芎小劑量組、川芎大劑量組、秋水仙堿組，每組10只，川芎灌胃小劑量為2.12 g/kg，大劑量為4.24 g/kg，空白對照組給予等量的生理鹽水，秋水仙堿以0.1 mg/kg灌胃，各組均按每天1 mL/100 g給藥，1次/d，連續(xù)10 d，最后1次給藥1 h后乙醚麻醉，無菌條件下心臟采血，靜置后離心10 min，吸取血清，血清用0.22μm濾器過濾，即為藥物血清；所有血清均經(jīng)56℃、30 min滅活，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 肝星狀細胞實驗分組 實驗分為8組，AM251終濃度為10μmol/L、PDGF-BB終質(zhì)量濃度為10 ng/m L，每組血清添加量為10%。正常對照組 （A組）細胞給予正常大鼠血清；模型組 （B組）細胞給予正常大鼠血清+PDGF-BB；AM251組（C組）細胞給予正常大鼠血清+PDGF-BB+ AM251；秋水仙堿組 （D組）細胞給予秋水仙堿血清+PDGF-BB；川芎小劑量組（E組）細胞給予川芎小劑量含藥血清+PDGF-BB；川芎大劑量組（F組）細胞給予川芎大劑量含藥血清+PDGF-BB；川芎小劑量+AM251組 （G組）細胞給予川芎小劑量含藥血清+AM251+PDGF-BB；川芎大劑量+ AM251組 （H組）細胞給予川芎大劑量含藥血清+AM251+PDGF-BB；含藥血清與AM251同時加入除正常對照組外，各組分別處理細胞1 h后再用PDGF-BB刺激。

1.2.2 Western blot法檢測AM251對CB1蛋白表達的影響 將傳代培養(yǎng)的HSC按常規(guī)方法1×106個/m L接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每孔2 m L，培養(yǎng)24 h后，待細胞近鋪滿孔底80%時，吸棄上清，將細胞分為6組，即空白組、模型組、1μmol/L組、3 μmol/L組、5μmol/L組、10μmol/L組；除正常對照組外，各組分別處理細胞1 h后再加入刺激劑PDGF-BB，培養(yǎng)24 h后分別收集細胞。經(jīng)蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗4℃過夜、漂洗、加入二抗、孵育、漂洗。采用化學(xué)發(fā)光法進行顯色反應(yīng)，重復(fù)3次，結(jié)果用光密度掃描儀記錄，并進行統(tǒng)計分析。以GAPDH表達水平為內(nèi)參照。目標蛋白的表達量以目標蛋白與內(nèi)參照蛋白灰度值的相對比值表示。

1.2.3 MTT法測定細胞增殖情況 取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化后用含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1×105個/mL接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后吸棄孔內(nèi)上清液，按實驗分組加入相應(yīng)血清及試劑，培養(yǎng)1 h后加入刺激因子。每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT溶液（5 g/L）20μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入200μL DMSO，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上取570 nm波長，測定各孔吸光度 （OD）值。

1.2.4 Western blot法檢測CB1、FAK及p-Akt蛋白的表達情況 將傳代培養(yǎng)的HSC按常規(guī)方法1× 106個/mL接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后，待細胞近鋪滿孔底80%時，吸棄上清，按前述細胞實驗分組處理細胞，培養(yǎng)24 h后分別收集細胞。經(jīng)蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗4℃過夜，TBST漂洗30 min，分別加入二抗，37℃孵育，TBST漂洗30 min。采用化學(xué)發(fā)光法進行顯色反應(yīng)，重復(fù)3次，結(jié)果用光密度掃描儀記錄，并進行統(tǒng)計分析。以GAPDH表達水平為內(nèi)參照。目標蛋白的表達量以目標蛋白與內(nèi)參照蛋白灰度值的相對比值表示。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，以 （x±s）表示均數(shù)間差異的實驗結(jié)果，采用One-Way ANOVA檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AM251對肝星狀細胞CB1表達的影響 與空白對照組比較，PDGF-BB刺激作用24 h后CB1表達顯著上調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，1μmol/L組、3μmol/L組、5μmol/L組、10μmol/L組CB1表達明顯降低 （P＜0.05），且呈劑量依賴關(guān)系（P＜0.05），具體見表1，Western blot圖片見圖1。

2.2 川芎含藥血清對HSCs增殖的影響 PDGFBB（10 ng/mL）作用于培養(yǎng)的大鼠肝星狀細胞24 h后，應(yīng)用MTT檢測，模型組吸光度OD值明顯高于對照組 （P＜0.05）。經(jīng)秋水仙堿、AM251、川芎小劑量與大劑量處理后，各組OD值明顯降低（P＜0.05），且川芎大劑量組比小劑量組抑制作用更明顯 （P＜0.05）。加入AM251后，川芎小、大劑量含藥血清對肝星狀細胞增殖作用的抑制更強（P＜0.05），且呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系 （P＜0.05），見表2。

表1 AM 251對肝星狀細胞CB1表達的影響(x±s,n=4)Tab.1 Effects of AM 251 on CB1 in Hepatic Stellate Cells (x±s,n=4)

圖1 AM 251對肝星狀細胞CB1表達的影響Fig.1 Effects of AM 251 on CB1 in Hepatic Stellate Cells

表2 川芎含藥血清對PDGF-BB刺激的HSCs增殖的影響(x±s,n=4)Tab.2 Effects of Ligusticum chuanxiong Hort d rug-containing serum on the proliferation in HSCs stimulated by PDGF-BB(x±s,n=4)

2.3 川芎含藥血清對大鼠肝星狀細胞CB1、FAK、p-Akt蛋白表達的影響 與對照組比較，HSCs經(jīng)PDGF-BB刺激24 h后CB1、FAK、p-Akt蛋白表達顯著上調(diào) （P＜0.05）。與模型組比較，秋水仙堿組、AM251組、川芎小劑量組與大劑量組CB1、FAK、p-Akt蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05），且川芎大劑量組比川芎小劑量組下調(diào)更明顯 （P＜0.05）。加入AM251后，川芎含藥血清對所測蛋白的抑制作用更顯著 （P＜0.05），且呈劑量依賴關(guān)系（P＜0.05），見表3，Western blot圖片見圖2。

表3 川芎含藥血清對肝星狀細胞CB1、FAK、p-Akt蛋白的影響(x±s,n=4)Tab.3 Effects of Ligusticum chuanxiong Hor t drug-containing serum on CB1,FAK and p-Akt in HSCs(x±s,n=4)

圖2 川芎含藥血清對大鼠肝星狀細胞CB1、FAK、p-Akt蛋白的影響Fig.2 Effects of Ligusticum chuanxiong Hort drugcontaining serum on CB1,FAK and p-Ak t in HSCs

3 討論

肝纖維化是由各種致病因素所致慢性肝病的重要病理特征，其特征是細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積于肝臟，也是“慢性肝病-肝纖維化-肝硬化”發(fā)展的中間環(huán)節(jié)［2-4］?；罨母涡菭罴毎歉卫w維化時ECM的主要細胞來源，在肝纖維化中起關(guān)鍵作用［5-7］。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng) （ECS）是由內(nèi)源性大麻素、大麻素受體及參與生物合成、降解的酶組成，主要通過大麻素受體發(fā)揮作用，目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)主要有大麻素受體1（CB1）和大麻素受體2（CB2）兩種。以往學(xué)者對ECS的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等方面，總結(jié)出它與神經(jīng)系統(tǒng)、記憶、能量代謝、腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和心血管系統(tǒng)等疾病密切相關(guān)［8］。近期研究發(fā)現(xiàn)，整個肝臟均有CB1、CB2低水平表達，在肝臟受損時表達水平明顯上調(diào)，并在慢性肝病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。CB1和CB2在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的作用不同，前者具有促進肝纖維化的作用，后者具有抗肝纖維化的作用［9］。

PI3-K/Akt信號通路通過調(diào)控基因表達，在細胞的生長、增殖、分化和凋亡等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［10］，尤其在肝纖維化的進展中，此通路發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。它主要由FAK-PI3KAkt-p70S6激酶等連接而成。FAK是一種介導(dǎo)多種信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的非受體酪氨酸蛋白激酶，它是細胞內(nèi)多條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點。具有絲氨酸、蘇氨酸激酶活性的Akt，又稱蛋白激酶B，它是PI3K通路下游的一個重要靶激酶［11］。它主要通過磷酸化含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物發(fā)揮各種生物學(xué)效應(yīng)，如促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等。活化的PI3K可使蛋白激酶C、Akt和p70S6K等多種激酶激活［12］，激活的Akt主要作用于p70S6K，使其活化，從而影響HSCs增殖［13］。因此，阻斷PI3K/ Akt信號通路為防治肝纖維化的重要途徑。

研究證明，CB1為G蛋白偶聯(lián)受體，它與Gi/o蛋白偶聯(lián)后，由Gi/o蛋白介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Gi/o蛋白活化后，其亞單位α和βγ分離。而Gβ/γ亞單位可激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3-K），使PI-3K/ PKB/Akt信號增強，從而促進細胞的生長分化［14］；或者通過對ERK1/2磷酸化的調(diào)節(jié)，促進髓鞘的再生。綜上所述，CB1可能通過激活PI3-K/PKB/Akt信號通路影響HSCs的增殖而在肝纖維化過程中起著重要作用。

本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，經(jīng)PDGF-BB作用24 h后，HSCs明顯增殖（P＜0.05），CB1、FAK、p-Akt蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿組、AM251組、不同劑量川芎含藥血清組及不同劑量川芎含藥血清+AM251組均能明顯抑制HSCs增殖（P＜0.05），且明顯下調(diào)CB1、FAK、p-Akt蛋白的表達（P＜0.05）；與川芎小劑量組相比，川芎大劑量組HSCs增殖及CB1、FAK、p-Akt蛋白表達情況明顯受到抑制 （P＜0.05）；與AM251組比較，不同劑量川芎含藥血清+AM251組HSCs增殖及CB1、FAK、p-Akt蛋白表達情況明顯降低 （P＜0.05），且呈劑量依賴關(guān)系 （P＜0.05）；與川芎小劑量組比較，川芎小劑量+AM251組HSCs增殖明顯降低（P＜0.05），且CB1、FAK、p-Akt蛋白表達明顯下調(diào) （P＜0.05）；與川芎大劑量組比較，川芎大劑量+AM251組HSCs增殖亦明顯降低（P＜0.05），且明顯抑制CB1、FAK、p-Akt蛋白的表達（P＜0.05）。上述結(jié)果顯示，PDGF-BB作用24 h能刺激HSCs增殖，上調(diào)CB1、FAK、p-Akt蛋白的表達；秋水仙堿、AM251及川芎含藥血清均能明顯抑制上述效應(yīng)；且加入AM251后的川芎含藥血清比單獨使用相應(yīng)劑量的川芎含藥血清對HSCs增殖及CB1、FAK、p-Akt蛋白表達的抑制效果更強，作用呈劑量依賴性。由此說明，川芎含藥血清影響肝星狀細胞的增殖可以通過抑制大麻素受體1進而影響PI3-K/Akt信號通路來實現(xiàn)，最終發(fā)揮抗纖維化的作用，但具體機制仍未完全清晰，臨床應(yīng)用仍局限于激動劑與拮抗劑的使用，且作用于臨床的藥物實驗較少，不良反應(yīng)尚未完全明確，因此，尚須對大麻素受體在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用進行更深入全面的研究，以期為肝纖維化的治療提供新的途徑和靶點。

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Effects of serum containing Ligusticum chuanxiong on CB1 related signaling pathway in rat hepatic stellate cells

HE Juan1， CAOWen-fu1，2*， WANG Hai-lan1， HAN Shi-qing1
（1.School of TCM，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Research Laboratory of TCM，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

AIMTo investigate the effects of serum containing Ligusticum chuanxiong on cannabinoid receptor 1（CB1），focal adhesion kinase（FAK）and extracellular regulated protein kinase（p-Akt）in rat hepatic stellate cells（HSCs）stimulated by platelet-derived growth factor（PDGF-BB）and to explore themechanism of hepatic fibrosis.METHODSThe effect of prepared s erum containing Ligusticum chuanxiong on the proliferation of HSCs was detected by MTT assay；the protein levels of CB1，F(xiàn)AK，and p-Akt were analyzed by Western blot.RESULTSCompared to the normal control group，24 hours treatment of PDGF-BB promoted the proliferation of HSCs significantly and increased the protein levels of CB1，F(xiàn)AK，and p-Akt；serums containing Ligusticum chuanxiong，colchicine and AM251 could distinctly inhibit the above effects in HSCs.After adding AM251，the inhibitory effectof serum containing Ligusticum chuanxiong wasmore apparent and showed a dose-dependentmanner.CONCLUSIONThe serum containing Ligusticum chuanxiong plays the role in the prevention and treatment ofhepatic fibrosis by inhibiting the proliferation of HSCs through CB1 related signaling pathway.

serum containing Ligusticum chuanxiong；hepatic fibrosis；hepatic stellate cells；cannabinoid receptor 1（CB1）related signaling pathway；focal adhesion kinase（FAK）；extracellular regulated protein kinase（p-Akt）

R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1397-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.002

2014-09-18

國家自然科學(xué)基金預(yù)研項目 （NSFYY-2011）

何 娟 （1987—），女，碩士生，主要從事腎病與內(nèi)分泌、器官纖維化研究。Tel：18223595095，E-mail：970275873@ qq.com

*通信作者：曹文富，男，教授，主要從事腎病與內(nèi)分泌、器官纖維化研究。Tel：13883658367，E-mail：13883658367@163.com