彭 昕， 吉慶勇， 李玉蘭*， 張煜炯

（1.浙江醫(yī)藥高等專科學校，浙江寧波315100；2.麗水市農業(yè)科學研究院，浙江麗水323000）

瀕危藥用植物三葉青ISSR分子標記的建立

彭 昕1， 吉慶勇2， 李玉蘭1*， 張煜炯1

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W校，浙江寧波315100；2.麗水市農業(yè)科學研究院，浙江麗水323000）

目的對三葉青的簡單重復序列-聚合酶鏈式反應 （ISSR-PCR）體系和擴增程序進行優(yōu)化，并將其應用于野生三葉青種質資源的遺傳分子標記。方法采用單因素試驗，對三葉青ISSR-PCR反應條件中的Mg2+、dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶濃度和退火溫度等因素進行篩選，之后結合正交試驗來選擇多態(tài)性高、重復性好的ISSR引物。結果建立了ISSR-PCR最佳反應體系，為25μL反應體系中含有2.5 mmol/L Mg2+、0.2μmol/L引物、0.25 mmol/L dNTP、50 ng DNA模板、0.5U TaqDNA聚合酶，并利用U810等16條引物，初步構建了15份三葉青種質資源的ISSR指紋圖譜，平均多態(tài)條帶百分率達57.0%。結論該反應體系的穩(wěn)定性和多態(tài)性良好，可滿足對三葉青野生資源的遺傳變異水平和結構分析的研究考察。

三葉青；ISSR；單因素試驗；正交試驗；遺傳多樣性

三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg是我國特有的葡萄科崖爬藤屬珍稀藥用植物，主要分布于浙江、廣西、江西等少數省份［1］，以地下塊根或全草入藥。它可用于治療高熱、肝炎、風濕性關節(jié)炎及病毒性腦膜炎等多種疾病，而且其主要活性成分黃酮對肝癌、腸癌、胃癌和血癌細胞株具有促凋亡作用［2-3］。目前，三葉青的野生資源瀕臨滅絕，亟待保護，其組培快繁和栽培技術雖已有一些探索［4-7］，但技術尚未完全成熟，遠不能滿足臨床需求。研究物種居群間的遺傳變異水平可為基因資源保護策略的制定、品種鑒別、良種選育等提供科學依據，而目前關于三葉青種質資源保護方面的研究尚未見報道。

如今，在遺傳多樣性評價中使用最廣泛的DNA標記技術有RFLP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP、SRAP和SNP。其中，簡單重復序列ISSR（inter-simple sequence repeats）標記是利用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的3′端或5′端加上2～4個隨機核苷酸，對錨定引物互補的間隔不大的SSR基因片段進行聚合酶鏈式反應 （PCR）擴增［7］。該技術具有操作簡便、多態(tài)性好、重復性高、無需預先知道任何靶序列的DNA背景信息、模板需要量少等優(yōu)點，廣泛應用于遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析等方面的研究［8-10］，但作為一種基于PCR技術的分子標記，其反應條件受到模板DNA及Taq DNA聚合酶用量、Mg2+、dNTP、引物濃度、退火溫度等因素的影響，故為了實現分析結果的可靠性和重復性，進行ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化是非常必要的。本實驗利用單因子和正交試驗相結合的方法，對以上各因素進行系統(tǒng)研究，并篩選出一批多態(tài)性好、重復性高的引物，建立了一套穩(wěn)定的三葉青ISSR-PCR反應體系，并對其穩(wěn)定性和重復性進行了檢測，為關于三葉青的遺傳多樣性分析和物種保護研究奠定技術基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料 所用試劑及DNA Marker S plus（包括100、250、500、750、1 000、1 500、2 000、3 000、5 000 bp 9個條帶）均購自上海生工生物工程有限公司；100條UBC 801-UBC900 ISSR引物（加拿大哥倫比亞大學公布其序列及編號），上海生工生物工程有限公司合成。

本實驗所用的三葉青藥材均為野生品種，經麗水市農科院吉慶勇高級農藝師和浙江醫(yī)藥高等專科學校楊雄志教授鑒定為三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg。然后，利用表1中編號為jx1的材料對反應體系進行優(yōu)化，并選取外觀性狀及居群生境差異較大的zj2、gx1和jx1材料用于有效引物的篩選，所有材料均用于優(yōu)化后反應體系的穩(wěn)定性檢測。

1.2 儀器 Eppendorf Master cycler PCR儀（德國Eppendorf公司）；Gel Doc XR+紫外凝膠成像分析儀、Sub-Cell系統(tǒng)水平電泳槽（美國Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機 （浙江納德科學儀器有限公司）。

表1 材料來源Tab.1 Sources ofmaterials

2 方法

2.1 植物材料采樣及DNA提取 每種藥材取樣5株，每株取4～6 g新鮮葉片放入密封塑料袋，硅膠干燥，冷藏于-80℃超低溫冰箱中，供提取DNA用?？侱NA提取采用改良CTAB法［11］，0.8%瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測儀檢查總DNA的完整性及純度，并將其濃度稀釋至50 ng/μL備用。

2.2 PCR擴增及引物篩選 ISSR原初擴增反應的體系為25μL PCR反應體積中含10×Taq酶配套緩沖液2.5μL、MgCl22.5 mmol/L、Taq酶2U、模板DNA 50 ng、引物0.3μmol/L、dNTP 0.1 mmol/L。原初擴增程序為95℃下預變性5 min（95℃45 s、50℃60 s、72℃60 s），進行40個循環(huán)，72℃下延伸10 min。PCR產物經含有5 mg/L溴化乙錠（EB）的2%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外凝膠成像分析儀內觀察并拍照。

2.2.1 單因素試驗 先根據原初的PCR反應條件進行引物初篩，選擇能看到清晰條帶的引物U810（序列為GAG AGA GAG AGA GAG AT），對其退火溫度 （采用梯度PCR儀自動生成的8個梯度）、Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度、模板DNA量、TaqDNA聚合酶用量這6個因素逐一設計單因素試驗，見表2。在對某單一因素進行試驗時，其他因素均保持不變，以探討各因素對反應體系的影響，并篩選出最佳條件，每個試驗重復3次。

表2 單因素試驗中所采用的各因素和水平 (25μL反應體系)Tab.2 Single factor test design for the factors and levels of ISSR-PCR reaction

2.2.2 正交試驗 優(yōu)化PCR反應體系時采用L9（34）設計，根據 “2.2.1”項下方法初步篩選合理的范圍，對Mg2+、引物、dNTP和模板DNA進行4因素3水平篩選，見表3。本試驗設計9個處理，每個處理重復3次，利用Quantity one分析軟件，并按照特異性條帶強弱，對試驗結果進行標記處理。其中，條帶數量豐富、清晰度高、特異條帶最強的記為1分，最差的記為9分，其他情況與其相比，取整數值，從低到高依次打分［12-13］。

表3 ISSR-PCR反應L9(34)正交設計Tab.3 L9(34)orthogonal design for the factors and levels of ISSR-PCR reaction

2.2.3 引物篩選 采用 “2.2.2”項下優(yōu)化的擴增條件 （除退火溫度項需對每個引物逐一篩選外），對100條 ISSR引物進行篩選。以擴增出的條帶數量多、多態(tài)性好、清晰度高、重復性好為原則，確定有效引物。

2.3 體系穩(wěn)定性驗證及ISSR圖譜建立 將“2.2.3”項方法篩選出的引物采用 “2.2.2”項下優(yōu)化的擴增條件，對15份三葉青材料反應體系的穩(wěn)定性進行驗證，每個材料重復3次，建立ISSRPCR擴增圖譜。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果 本實驗先根據原初的PCR反應條件進行引物初篩，選擇能看到清晰條帶的引物U810來確定退火溫度，其對擴增結果的影響見圖1。由圖可知，雖然各溫度均能擴增出條帶，但其數量及清晰度有明顯區(qū)別。45℃時雖然能擴增出較多條帶，但均非常彌散；53.8～56℃時雖然一些條帶亮度增加，但中分子質量區(qū)的條帶數明顯減少，之間出現彌散現象，而且大分子質量區(qū)出現了一些非特異性弱帶，背景較高；49.4～51.8℃時擴增出的條帶數量最多，而且其清晰度和亮度較高。考慮到較高退火溫度有利于減少雜帶的產生，因此本實驗選擇52℃為引物U810用于三葉青ISSR擴增的最佳退火溫度。

圖1 退火溫度對三葉青ISSR擴增的影響Fig.1 Effect of annealing tem perature on T.hem sleyanum ISSR amplification

確定退火溫度后，逐一改變Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度、模板DNA量、TaqDNA聚合酶用量這5種因素的水平，結果見圖2。由圖可知，當Mg2+濃度小于2 mmol/L時，不能擴增出條帶；濃度為3 mmol/L時，擴增出的條帶多，而且背景清晰。當dNTP濃度上升時，其PCR擴增產物的量增加，但達到0.3 mmol/L時，高分子質量區(qū)的主帶旁邊出現1條雜帶，因此選擇0.2 mmol/L為最佳濃度。當引物濃度低于0.2μmol/L時，雖然擴增出的條帶較清晰，但中等及低相對分子質量區(qū)擴增出的條帶數目明顯減少，亮度降低，而且高分子質量區(qū)出現較多雜帶；濃度為0.3μmol/L時，低分子質量區(qū)出現疑似引物二聚體的雜帶，因此選擇0.2μmol/L的引物濃度為PCR反應體系的最佳濃度。當模板DNA用量在50～75 ng時，條帶數目最多，清晰度高；用量在50 ng以下時，條帶清晰度和產量明顯提高；用量在100 ng時，擴增產物的產量雖然也明顯提高，但高分子及低分子質量區(qū)分別出現1條非特異性雜帶。

圖2 M g2+、引物、dNTP和模板DNA濃度對三葉青ISSR擴增的影響Fig.2 E ffect of M g2+,dNTP,primer and tem p late DNA concentration on T.hemsleyanum ISSR am p lification

從圖3可以清晰地看出，在所選擇的4個濃度范圍內，Taq酶對條帶數量及清晰度沒有明顯影響，故從實驗成本考慮，選擇0.5 U為最佳用量。

3.2 PCR正交設計結果 圖4為正交設計ISSR擴增結果，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對其進行方差分析，見表4。由表可知，Mg2+濃度、dNTP、引物濃度對實驗結果有顯著影響 （P＜0.05），而模板DNA濃度的影響不明顯 （P＞0.05）。均方差結果顯示，這4個因素對其影響的主次順序依次為Mg2+濃度＞dNTPs＞引物濃度＞DNA模板濃度，與極差分析的結果相同。然后，進一步對各因素的不同水平進行多重比較，發(fā)現Mg2+濃度在3個水平之間的差異均有統(tǒng)計學意義，P值分別為0.011（2.5和3.0 mmol/L之間）、0.000（2.5和3.5 mmol/L之間）和0.000（3.5和2.5 mmol/L之間），結合表5中的PCR結果均值可知，Mg2+濃度在2.5 mmol/L下最適合；引物濃度在0.2μmol/L時，與其他兩個水平之間有顯著差異，P值分別為0.000（0.2和0.25μmol/L之間）和0.001（0.2和0.15μmol/L之間），結合表5可知，引物濃度在0.2μmol/L下最適合；dNTP濃度在3個水平間均有顯著性差異，P值均為0.000，結合表5中可知，dNTP濃度0.25 mmol/L下最適合。同時，模板DNA濃度在3個水平間均無顯著性差異，P值分別為0.728（50和100 ng、75和100 ng之間）、0.489（50和75 ng之間）。綜上所述，Mg2+濃度2.5 mmol/L、引物濃度0.2μmol/L、dNTPs濃度0.25 mmol/L、DNA模板濃度50～100 ng為三葉青ISSR-PCR的最佳反應體系。

圖3 Taq DNA聚合酶對三葉青ISSR擴增的影響Fig.3 Effect of Taq DNA polymerase dosage on T.hemsleyanum ISSR am plification

表4 正交試驗中各因素方差分析Tab.4 Analysis of variance for factors of orthogonal design

表5 各因素不同處理水平結果均值差異顯著性Tab.5 Significance among themeans of different factor levels

圖4 L9(34)正交設計ISSR擴增結果Fig.4 Electrophoresis of L9(34)orthogonal design

3.3 體系穩(wěn)定性驗證及ISSR圖譜多態(tài)性分析 經篩選確定的有效引物見表6，而且從圖5和圖6可知，U810和U811引物能從表1所列的15份種質材料中擴增出清晰度高、多態(tài)性豐富、重復性好的DNA條帶，表明優(yōu)化后的ISSR-PCR反應體系穩(wěn)定可靠，在此基礎上，以擴增出的條帶數量多、多態(tài)性好、清晰度高、重復性好為原則，從100個ISSR引物中篩選出16個擴增穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物（表6）。同時，它們又共擴增出135個條帶，長度為200～2 000 bp，每條引物平均產生8.4個條帶，其中多態(tài)性帶77條，平均多態(tài)率達57.0%。由此可知，ISSR指紋能在居群水平中提供適量的多態(tài)性，可滿足對三葉青資源遺傳多樣性、遺傳結構分析和種質資源鑒定的研究考察。

表6 篩選出的三葉青ISSR標記分析的引物序列及其擴增結果Tab.6 Primer sequence screened for ISSR analysis of T.hemsleyanum and their amplification results

圖5 引物U810對15份三葉青DNA擴增結果Fig.5 Amplification results of 15 DNA samp les from T.hemsleyanum with primer U810

圖6 引物U 811對15份三葉青DNA擴增結果Fig.6 Am p lification results of 15 DNA sam p les from T.hemsleyanum w ith primer U811

4 討論

ISSR是在基因組中由1～6個核苷酸組成的，基本單位重復多次構成的DNA無意義區(qū)域片段，廣泛分布于基因組的不同位置，容易受氣溫、日照等環(huán)境條件的影響而出現變異，并且進化變異速度快，蘊含的多態(tài)性位點多，具有很高的多態(tài)性檢測效率［8］。目前，ISSR分子標記技術被廣泛應用于遺傳多樣性的評價［14］、品種鑒別［15］、指紋圖譜庫建立［16］、物種間親緣關系及系統(tǒng)進化［17］等領域。

PCR擴增容易受到Mg2+、引物、dNTP、DNA模板的濃度與純度，以及擴增程序等諸多因素影響。Mg2+濃度過低會降低Taq酶活性，而過高則會引起非特異性擴增，而且它還能與體系中的dNTP、引物、模板結合，影響模板與引物的結合率，產生非特異性條帶［12］，本實驗也發(fā)現Mg2+是對擴增結果影響最大的因素，這與東方百合ISSR反應體系相似［18］。dNTP是PCR反應中的原料，濃度過低導致擴增產量不足，而濃度過高則導致PCR錯配，出現非特異性擴增，而且會對Mg2+產生拮抗作用，使反應中的有效Mg2+濃度下降，從而影響聚合酶活力［19］，本實驗中dNTP濃度上升時，其PCR擴增產物隨之增加，但濃度達到0.3 mmol/L時產生非特異性擴增。一般認為，引物濃度過低時，擴增的條帶較弱，數量也比較少，但濃度過高時會產生引物二聚體和非特異性擴增［18］，但本實驗中引物濃度過低時也產生了非特異性擴增，推測可能是因為過低的引物濃度與模板目標片段結合的競爭力不足，擴大了引物在基因組上配對的隨機性，從而形成了一些分子質量較大的非特異性產物。研究［18，20-21］表明，模板DNA的濃度適用范圍較寬，對ISSR-PCR反應的影響不大，25～200 ng之間均能擴增出較清晰的條帶，本實驗中雖然DNA模板濃度在一定范圍內對條帶的產量及多態(tài)性影響不大，但濃度達到100 ng時會產生非特異性擴增，與夏枯草ISSR-PCR反應體系［13］相似，而且在所選擇的用量范圍內，Taq酶對PCR產物量及條帶數量幾乎沒有影響，這與一些研究［12，19］相一致，而東方百合ISSR體系［18］中的Taq酶對結果影響非常顯著，可能與所使用酶的生產質量等因素有關。一般認為，退火溫度過高時，引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降，產生的條帶較少；溫度過低時，可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加［12］。本實驗發(fā)現，退火溫度過低時，條帶彌散，目標產物的產量低，而退火溫度過高時，雖然產生的條帶有一部分缺失，但同時也出現個別非特異性條帶。在實際操作過程中，一般參考引物理論Tm值來確定最佳退火溫度，但同一引物對于不同物種時，退火溫度可能不同，甚至差異較大，如瓜蔞ISSR分析時［22］，引物810所采用的退火溫度為53.6℃；王玉山等［23］用引物810對長葉紅砂ISSR分析時發(fā)現，最佳退火溫度為48℃；本實驗三葉青ISSR體系中，引物810的最佳退火溫度為52℃。因此，退火溫度需要在參考引物理論Tm值的基礎上加以適當調整，以期得到穩(wěn)定可靠的實驗結果。

與多因素試驗相比，單因素試驗可較為直觀地分析各因素對試驗結果的影響，易篩選出各因素的最佳水平，但可能會遺漏各因素之間的互作效應，根據其優(yōu)化組合而形成的試驗體系可能在某種程度上偏離真正的最佳條件［19］。而且，單因素試驗無法考察各因素不同水平對擴增結果影響的差異顯著性，而正交試驗設計在同時檢驗多個因素的同時，能縮小試驗規(guī)模，并可通過方差分析來統(tǒng)計各因素對結果影響的差異，但仍存在對各種因素的水平設計是否適當以及對試驗結果進行評價時有較大主觀性等局限。因此，本實驗結合單因素和正交兩種試驗設計，先通過單因素試驗來選定各因素的適宜水平范圍，然后參照選出的水平范圍進行正交設計，從而篩選出最佳反應體系。結果發(fā)現，ISSR指紋圖譜能夠在居群水平上提供豐富的多態(tài)性，表明經過優(yōu)化后建立的ISSR-PCR反應體系具有較好的穩(wěn)定性，可以滿足對三葉青野生資源的遺傳變異水平和結構分析的研究考察。

［1］韋樹根，董青松，韋 瑩，等.廣西瀕危珍稀中藥材三葉青資源調查研究［J］.北方園藝，2011，（21）：162-164.

［2］Xu C J，Ding G Q，Fu JY，et al.Immunoregulatory effects of ethyl-acetate fraction of extracts from Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg on immune functions of ICR mice［J］.Biomed Fnviron Sci，2008，21（4）：325-331.

［3］王小莉，曾 娟，周 輝.三葉青提取物對肺癌細胞株A549的影響［J］.腫瘤藥學，2012，2（5）：347-349.

［4］Dai Y J，Shen ZG，Liu Y，etal.Effectsof shade treatmentson the photosynthetic capacity，chlorophyll fluorescence，and chlorophyll content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg［J］. Fnviron Fxp Bot，2009，65（2-3）：177-182.

［5］彭 昕，張 劍，何軍邀，等.三葉青松散型和致密型愈傷組織懸浮培養(yǎng)及黃酮積累的比較研究［J］.中草藥，2012，43（3）：577-580.

［6］Peng X，Zhou SL，He JY，et al.Influence of rare earth elements on metabolism and related enzyme activity and isozyme expression in Tetrastigma hemsleyanum cell suspension cultures［J］.Biol Trace Flem Res，2013，152（1）：82-90.

［7］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprintingby simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics，1994，20（2）：176-183.

［8］Wang Z，Wang JE，Wang X M，et al.Assessment of genetic diversity in Galega officinalis L.using ISSR and SRAPmarkers［J］.Genet Resour Crop Fvol，2012，59（5）：865-873.

［9］鄭道君，謝良商，曾建華，等.海南龍血樹ISSR-PCR反應體系建立與有效引物篩選［J］.熱帶亞熱帶植物學報，2011，19（2）：177-183.

［10］陳大霞，王 鈺，張 雪，等.ISSR分析3種類型黃連的遺傳多樣性和遺傳結構［J］.中草藥，2012，43（8）：1595-1598.

［11］Wang M，Oppedijk B J，Lu X，et al.Apoptosis in barley aleurone during germination and its inhibition by abscisic acid［J］. Plant Mol Biol，1996，32（6）：1125-1134.

［12］孫清信，陳 堅，張 輝，等.紫云英ISSR引物的篩選及PCR反應體系的優(yōu)化［J］.植物遺傳資源學報，2012，13（5）：870-878.

［13］廖 麗，郭巧生.夏枯草ISSR分子標記技術的建立與體系優(yōu)化［J］.中草藥，2009，40（7）：1131-1135.

［14］卜 靜，王冬梅，李登武.不同產地野生玉竹種質資源多樣性與親緣關系的 ISSR分析［J］.中草藥，2012，43（9）：1824-1828.

［15］王 翀，周天華，楊 雪，等.ISSR-PCR鑒別絞股藍屬7種植物［J］.中草藥，2008，39（4）：588-5911.

［16］張 林，徐迎春，成海鐘，等.基于ISSR標記的62個朱頂紅品種的遺傳關系分析及指紋圖譜構建［J］.植物資源與環(huán)境學報，2012，21（4）：48-54.

［17］徐曉波，蔣冬花，李 杰，等.應用ISSR分子標記探討酵母菌種間親緣關系［J］.浙江師范大學學報：自然科學版，2010，33（1）：89-94.

［18］丁信譽，邱 帥，席夢利，等.東方百合ISSR-PCR反應體系的正交優(yōu)化［J］.南京林業(yè)大學學報：自然科學版，2012，36（5）：42-46.

［19］李娟玲，劉國民，曹嵩曉，等.利用單因子和正交設計雙重實驗法優(yōu)化鷓鴣茶RAPD-PCR反應體系［J］.農學學報，2011，4（6）：14-21.

［20］陳莉娉，張小平，李曉紅.青檀SRAP-PCR體系優(yōu)化設計方案［J］.生物學雜志，2012，29（5）：87-91.

［21］桂騰琴，孫 敏，喬愛民，等.正交設計優(yōu)化果梅ISSR反應體系［J］.果樹學報，2009，26（1）：108-112.

［22］王真真，韓琳娜，郭慶梅，等.瓜蔞ISSR-PCR最佳反應體系的研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2013，40（10）：2094-2096.

［23］王玉山，張穎娟.瀕危植物長葉紅砂ISSR擴增條件的優(yōu)化與引物篩選［J］.內蒙古師范大學學報：自然科學版，2008，37（3）：417-421.

Construction of ISSR molecular marker system for endangered plant Tetrastigma hemsleyanum

PENG Xin1， JIQing-yong2， LIYu-lan1*， ZHANG Yu-jiong1
（1.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China；2.Lishui Academy of Agricultural Science，Lishui323000，China）

AIMTo construct a proper ISSR-PCR reaction system and amplification process for germplasm of wild Tetrastigma hemsleyanum.METHODSSingle factor testwas applied to the optimization of the influencing factors，including annealing temperature，Mg2+concentration，dNTP concentration，template DNA dosage，Taq DNA polymerase dosage，primer concentration.Orthogonal design was applied to the selection of stable and repeatable ISSR primers.RESULTSThe optimal reaction system for ISSR analysis contained 2.5mmol/LMgCl2，0.2 μmol/L ISSR primers，0.25 mmol/L dNTP，50 ng of template DNA，and 0.5 U of Taq DNA polymerase in 25 μL total volume.Based on 16 primers such as U810，the molecularmarker system of 15 samples of T.hemsleyanum was established withmore than 57.0%of average polymorphic bands.CONCLUSIONThe ISSR-PCR reaction system constructed in this study is highly polymorphic and has high reliability and stability，which could be used to detect the genetic diversity and investigate the genetic structure of T.hemsleyanum.

Tetrastigma hemsleyanum；ISSR；single factor test；orthogonal design；genetic diversity

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1507-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.024

2014-08-07

2013年浙江省公益性技術資助項目 （2013C32103）；2013年浙江省教育廳高?？蒲许椖?（Y201330174）

彭 昕（1980—），女，碩士，副教授，研究方向為藥用植物分子生物學。E-mail：pengx@mail.zjpc.net.cn *通信作者：李玉蘭（1963—），女，教授，研究方向為分子生物學。E-mail：LiyL@mail.zjpc.net.cn