葉日貴， 白梅榮， 包明蘭， 拉喜那木吉拉， 佟玉風(fēng)， 巴根那

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000）

梔子化學(xué)成分的LC-MSD Trap與UV分析

葉日貴， 白梅榮， 包明蘭， 拉喜那木吉拉， 佟玉風(fēng)， 巴根那*

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000）

目的采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和紫外檢測(cè)法，對(duì)蒙藥梔子的化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為其藥理作用的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法色譜分離采用Venusil MPC18色譜柱（4.6 mm×300 mm，5μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和甲醇，梯度洗脫；體積流量為1.0mL/min；質(zhì)譜定性采用多級(jí)離子阱質(zhì)譜，負(fù)離子模式掃描；紫外檢測(cè)范圍為210～400 nm。結(jié)果在優(yōu)化后的液質(zhì)聯(lián)用條件下，通過(guò)液相色譜/離子阱質(zhì)譜 （LC/MSD Trap）法檢測(cè)出梔子中的13個(gè)成分。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，化合物3、5、6、8、11為首次經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用從梔子中得到。結(jié)論LC/MSD Trap聯(lián)用技術(shù)為分離和鑒定梔子中的化學(xué)成分確定一種快速、科學(xué)的分析方法。

梔子；化學(xué)成分；LC/MSD Trap；UV

梔子是一味重要的蒙藥藥材，別名莫斯勒，是茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的成熟干燥果實(shí)，產(chǎn)于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省，以湖南、江西產(chǎn)為佳，10月果實(shí)成熟，果皮呈黃色時(shí)采摘，除去果柄及雜質(zhì)，曬干或烘干即得［1］。梔子味苦，性涼，效鈍、糙，具有清血熱、明目、祛巴達(dá)干希日、滋補(bǔ)、調(diào)元等功效，主治血熱、肝熱、面目發(fā)黃、血希日性眼病、腎熱、膀胱熱、口渴等癥狀［1］。

關(guān)于梔子的化學(xué)成分分離、結(jié)構(gòu)鑒定研究、藥理作用研究已成為時(shí)下熱門的研究項(xiàng)目［2-6］。研究表明，梔子中含有環(huán)烯醚萜類、三萜類、香豆素類、有機(jī)酸類、西紅花酸類、黃酮類、木脂素類、揮發(fā)油、多糖、皂苷及其他類化合物［7-9］。其中，具有代表性，并有藥理作用的化合物主要為環(huán)烯醚萜類、西紅花酸類、三萜類、有機(jī)酸類、黃酮類、木脂素類和揮發(fā)油［10-12］。諸多藥理實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)烯醚萜類成分具有保肝利膽、抗腦缺血損傷、抗焦慮、抗癡呆、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血栓等活性［13］；揮發(fā)油具有止咳祛痰、平喘、消炎、解熱鎮(zhèn)痛、解痙、健胃、利尿、降壓、強(qiáng)心、殺蟲和抗癌等作用［14］；木脂素具有促進(jìn)血液循環(huán)、消炎殺菌、活化身體機(jī)能細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞等功能［15］。其中，環(huán)烯醚萜類成分尤為重要，并且其藥理作用也很顯著［16］。

本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜/離子阱質(zhì)譜（LC/MSD Trap）聯(lián)用技術(shù)，為鑒定梔子化學(xué)成分建立一種快速、科學(xué)的分析方法。

1 儀器和材料

Agilent1100 series LC-MSD液質(zhì)聯(lián)用儀，包括Agilent SL型多級(jí)離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、二級(jí)管陣列檢測(cè)器 （DAD）、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、Chemistation化學(xué)工作站等（美國(guó)Agilent Technologies公司）。梔子（山東嘉泰中藥飲片有限公司，批號(hào) 120310340）。甲醇、甲酸均為色譜純（美國(guó)Tedia公司）；水為娃哈哈純凈水 （杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 Venusil MP C18色譜柱（4.6 mm×300 mm，5μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫 （0～10 min，10%～20%B；10～20 min，20%～40%B；20～40 min，40%～60%B；40～60 min，60%～75% B；60～80 min，75%～85%B；80～90 min，85%～100%B）；柱溫35℃；進(jìn)樣體積30μL；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm。

2.1.2 質(zhì)譜條件 ESI電離源，負(fù)離子模式檢測(cè)；掃描范圍50～800 m/z；干燥氣溫度350℃；干燥氣流量9.0 L/min；霧化氣壓強(qiáng)35.0 psi（1 psi= 6.895 kPa）；毛細(xì)管電壓4 kV。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Data Analysis軟件處理。

2.2 供試品溶液的制備 取梔子藥材適量，粉碎后稱取1 kg，依次加入10倍量、8倍量、6倍量的水進(jìn)行加熱提取，加熱時(shí)間分別為1.5、1、1 h，合并3份藥液，加熱濃縮，烘干后得到浸膏。精密稱取梔子浸膏0.25 g，倒入50 mL錐形瓶中，加25 mL甲醇后密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，冷卻后用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，靜置1 h。精密吸取上清液2 mL，置于10 m L量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液，“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行分析。

2.3 梔子化學(xué)成分表格的制作 查閱有關(guān)梔子化學(xué)成分的文獻(xiàn)，結(jié)果共找到118個(gè)成分，包括環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類、黃酮類、香豆素類、西紅花酸類等。接著，制作梔子化學(xué)成分表格，包括分子質(zhì)量、分子式、結(jié)構(gòu)等信息。

3 紫外吸收分析

化合物1～5、7～10、13均為環(huán)烯醚萜類。其中，化合物1、2、13的λmax均為236 nm；化合物3～5的λmax均為238 nm；化合物7～10的λmax均為240 nm，即為分子中發(fā)色團(tuán)α，β-不飽和酯的羰基吸收，與文獻(xiàn) ［17］報(bào)道一致，并且化合物9與對(duì)照品溶液的紫外吸收?qǐng)D一致。

化合物6、11、12為有機(jī)酸類，共有兩處強(qiáng)吸收。其中，化合物6的 λmax為300 nm，λ次吸收為245 nm；化合物11的λmax為310 nm，λ次吸收為237 nm；化合物12的λmax為314 nm，λ次吸收為232.5 nm，即為有機(jī)酸類、酯類、醛類等成分的紫外吸收，與文獻(xiàn) ［17-18］報(bào)道一致。

4 結(jié)果與討論

4.1 提取溶劑的選擇 因本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)臨床用藥，故選擇用水回流來(lái)提取梔子藥材。

4.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)在考察乙腈-水和甲醇-水兩種體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙腈的效果相當(dāng)，考慮到成本因素，選擇甲醇作為有機(jī)相。另外，還比較了質(zhì)譜檢測(cè)方式，發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下，質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)，并且峰容量更大，故選擇ESI負(fù)離子模式。

4.3 鑒定過(guò)程 在優(yōu)化后的 “2.1”項(xiàng)條件下，共得到13個(gè)峰 （圖1和表1），并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)這些化合物均為環(huán)烯醚萜類或有機(jī)酸類成分。首先，精確計(jì)算出ESI-MS上所得化合物的分子質(zhì)量，再通過(guò)建立的數(shù)據(jù)庫(kù)查看是否有同樣分子質(zhì)量者，初步鑒定梔子的化學(xué)成分。然后，選擇合適的分子離子峰進(jìn)行裂解，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜裂解方式，獲得與化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子，再對(duì)比其他碎片信息，結(jié)合紫外吸收波長(zhǎng)、分子質(zhì)量、碎片離子峰、保留時(shí)間等參數(shù)，進(jìn)一步推斷其結(jié)構(gòu)，共鑒定出9個(gè)化合物，見(jiàn)圖2。

圖1 梔子的負(fù)離子模式總離子流圖Fig.1 Negative total ion ch romatogram of extracts of Gardenia jasm inoides Ellis

表1 梔子化學(xué)成分的鑒定Tab.1 Iden tification of chem ical constituents from Gardenia jasm inoides Ellis

以雞屎藤次苷甲酯為例。首先，通過(guò)該峰的準(zhǔn)分子離子峰m/z 403.5，可確定其目標(biāo)分子量為404.5，通過(guò)對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)后發(fā)現(xiàn)，它與雞屎藤次苷甲酯、去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷對(duì)應(yīng)，由于這3種化學(xué)成分都是環(huán)烯醚萜類，且結(jié)構(gòu)相似，故其紫外吸收沒(méi)有意義。然后，根據(jù)m/z403.5的二級(jí)質(zhì)譜裂解圖進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得二級(jí)質(zhì)譜圖（圖3）中有明顯的m/z 240.9［M-H-C6H10O5］-、127［M-H-C6H10O5-C5H6O3］-等碎片離子信息，從而推斷出其裂解途徑，見(jiàn)圖4。結(jié)合保留時(shí)間、紫外吸收波長(zhǎng)、碎片離子等參數(shù)，最終確定該峰為雞屎藤次苷甲酯。采用類似的方法，對(duì)其他化學(xué)成分也進(jìn)行相應(yīng)的鑒定。

圖2 化合物結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of com pounds

圖3 雞屎藤次苷甲酯二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 Two stagemass spectrum of scandosidemethyl ester

圖4 雞屎藤次苷甲酯裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of scandosidemethyl ester

5 結(jié)論

經(jīng)液相色譜/離子阱質(zhì)譜（LC/MSD Trap）聯(lián)用分析，并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配、紫外吸收和二級(jí)質(zhì)譜分析，本實(shí)驗(yàn)對(duì)蒙藥梔子中的化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果確定了9個(gè)化合物，包括環(huán)烯醚萜類和有機(jī)酸類，為今后對(duì)梔子的進(jìn)一步研究、臨床用藥及質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

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Analysis of chem ical constituents from Gardenia jasm inoides by LC-MSD Trap and UV

Yerigui， BAIMei-rong， BAO Ming-lan， Laxinamujila， TONG Yu-feng， Bagenna*
（College of Mongolian Medicineand Phamacy，Inner Mongolia University for the Nationalities，Tongliao 028000，China）

AIMTo analyze the structures of chemical constituents from traditionalmongolianmedicine Gardenia jasminoides Ellisby LC-MSD Trap and UV，providing scientific basis for further study and clinical application of its pharmacological activities.METHODSVenusilMPC18Column（4.6mm×300 mm，5μm）was used.The mobile phase consisted of0.1%formic acid in water andmethanolwas used in gradient elution；the flow rate was 1.0 m L/min；multistage electrospray ion trap mass spectrometry was applied for qualitative analysis under negative ion mode；the UV detection rangewas210-400 nm.RESULTSUnder optimized conditions，13 constituents in Gardenia jasminoides Elliswere identified by liquid chromatography/ion trapmass spectrometry（LC/MSD Trap）. Through the literature search，compounds3，5，6，8，11were firstly isolated from Gardenia jasminoides Ellis by thismethod.CONCLUSIONA fast and scientific analysismethod is established，which can isolate and identify the chemical constituents of Gardenia jasminoides Ellis.

Gardenia jasminoides Ellis；chemical constituents；LC/MSD Trap；UV

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1503-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.023

2014-08-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81360673）

葉日貴 （1988—），女 （蒙古族），碩士生，研究方向?yàn)槊伤幣c方劑學(xué)。Tel：15947159161，E-mail：yerigui0205@163.com

*通信作者：巴根那 （1960—），男 （蒙古族），博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊伤幣c方劑學(xué)。Tel：（0475）8313130，E-mail：bagenna@126.com