張大雷 ，張吉林，才志成，陳 奇，廖林川

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.黑龍江省公安廳刑事技術(shù)總隊(duì)，哈爾濱 150008；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所，哈爾濱 150076）

4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺（2C-B）1974 年由Alexander Shulgin 首次合成并發(fā)現(xiàn)其有精神作用[1]。上世紀(jì)90 年代開(kāi)始，一些國(guó)家先后發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)出現(xiàn)被濫用的情況，隨即WHO 和美國(guó)、瑞士等國(guó)家相繼將其列為管制藥品并禁止使用[2-4]；我國(guó)于2001 年將其列入Ⅰ類(lèi)精神藥品品種目錄[5]。有報(bào)道稱(chēng)該化合物具有興奮和致幻雙重精神作用，強(qiáng)度是4-溴-2, 5-二甲氧基苯丙胺強(qiáng)的10 倍。隨著服用劑量的升高，首先出現(xiàn)興奮、松弛、消極的精神感覺(jué)，并隨著劑量的增加不斷增強(qiáng)，同時(shí)各種感官出現(xiàn)不同程度的欣快、興奮，最后直至出現(xiàn)幻覺(jué)或達(dá)到妄想的狀態(tài)，持續(xù)時(shí)間可達(dá)到6h左右，會(huì)引起身體嚴(yán)重的毒性副作用[1,3,6]。4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of 4-bromo-2,5-dimethoxyphenethylamine

目前國(guó)際上對(duì)生物檢材中的4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的檢測(cè)方法報(bào)道不多，主要是采用液-液或固相萃取的方法提取生物檢材后，采用氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS）、高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC/MS）分析4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺原體成分[6-9]。國(guó)內(nèi)尚無(wú)血液中檢測(cè)方法報(bào)道。鑒于生物檢材的基質(zhì)干擾及該化合物的信號(hào)響應(yīng)低等情況，為提高檢驗(yàn)的靈敏度，本文擬建立衍生化GC/MS 法檢測(cè)血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的方法，為今后法醫(yī)毒物分析和吸毒人員檢測(cè)提供靈敏、快速的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀 器：7890A/5975C 氣 質(zhì) 聯(lián) 用 儀， 配EI源（美國(guó)Agilent 公司）；TJ-6 高速離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN 公 司）；VORTEX-GENIE 2 旋 渦 混 合器（美國(guó)Scientific Industries 公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）；AB135-S 分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司，0.01mg）；pH 計(jì)（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；DSY-Ⅱ型自動(dòng)快速濃縮儀（北京金科精華苑技術(shù)研究所）；CNW 12 固相萃取裝置（德國(guó)CNW 公司）；Bond Elut Centify?SPE 柱（填料：C8 和苯磺酸，3mL，美國(guó)Agilent 公司）。

試劑：4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺鹽酸鹽（純度95%，黑龍江大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院合成）；4-苯基丁胺（SIGMA-ALDRICH 公司，純度 98%，密度 0.944）；甲醇、二氯甲烷、異丙醇、乙酸乙酯（DIKMA 公司）；氨水、三氟乙酸酐、NaH2PO4（SIGMA-ALDRICH 公司）。

1.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent DB-1MS（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升溫：110 ℃開(kāi)始，保持2min，以10℃/min 升至280℃，保持15min；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：高純He，流速1mL/min；進(jìn)樣量：1μL。

質(zhì)譜條件: MSD 傳輸線溫度270℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子轟擊源能量：70eV；溶劑延遲時(shí)間：3.5min；全掃描模式（40～500，m/z）；選擇離子掃描 m/z 242（4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺），m/z 91（4-苯基丁胺）。

1.3 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱(chēng)取4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺鹽酸鹽0.01201g 于10mL 容量瓶中，甲醇定容，配成濃度為1mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；臨用時(shí)用甲醇稀釋 成0.5，25，50，100，150，200，250μg/mL 的 系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱(chēng)取4-苯基丁胺2.700mL 于25mL 容量瓶中，甲醇定容，配成濃度為0.1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.4 樣品處理

提?。喝⊙簶悠?.5mL，加入2μg 4-苯基丁胺（內(nèi)標(biāo)），去離子水稀釋4 倍，8000r/min 離心20min，取上清液，加入NaH2PO4緩沖溶液（pH 值為6.0）2mL，混勻。

凈化：依次用2mL 甲醇，2mLNaH2PO4緩沖溶液（pH 值為6.0）活化固相萃取柱。將處理過(guò)的血液樣品加載過(guò)柱后，依次用1.0 mol/L 乙酸溶液1mL，去離子水3mL 淋洗，甩干小柱；再用甲醇6mL 淋洗，8000r/min 離心5min，甩干小柱；3mL 二氯甲烷/異丙醇/氨水（78/20/2，V/V/V）混合溶液洗脫，40℃空氣流下?lián)]干。

衍生：向揮干洗脫液的試管中加入乙酸乙酯、三氟乙酸酐（TFAA）各30μL，密封，60 ℃水浴30min，取出揮干，50μL 乙酸乙酯定容。

2 結(jié) 果

2.1 總離子流色譜圖

空白血液中添加一定濃度4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺工作液和內(nèi)標(biāo)，按1.4 項(xiàng)操作，研究了不同初始溫度和升溫速率對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，得到1.2 項(xiàng)條件符合4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺檢測(cè)的需要，見(jiàn)圖2。同空白血液同法操作后比較，結(jié)果為4-溴-2,5-二甲氧基苯乙胺衍生產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)4-苯基丁胺衍生產(chǎn)物的保留時(shí)間分別為13.3min 和8.7min，理論塔板數(shù)按4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生產(chǎn)物計(jì)算不低于1.0×104，血液中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)。

2.2 質(zhì)譜分析

在優(yōu)化好的條件下，分析后得到4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)4-苯基丁胺衍生產(chǎn)物的特征質(zhì)譜圖，如圖3。采用選擇離子監(jiān)控模式（SIM）進(jìn)行定量分析，其定量離子分別為m/z 242 和m/z 91。

2.3 線性關(guān)系及檢測(cè)限

精密量取空白血液0.5mL，分別加入不同濃度的4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL、內(nèi)標(biāo)工作液20μL，制成血漿中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺濃度分別為0.02、1、2、4、6、8、10 μg/mL的血液添加樣品。按1.4 項(xiàng)下方法操作處理，分別記錄分析所得數(shù)據(jù)。以4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺濃度為橫坐標(biāo)，4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，以最小二乘法回歸運(yùn)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y = 0.299X + 0.05，r = 0.9993。結(jié)果表明，4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺在此色譜條件下0.02～10μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，可以滿足臨床藥物監(jiān)測(cè)和法醫(yī)毒物分析實(shí)際工作需要。

按信噪比為1: 3 確定最低檢測(cè)限、信噪比為1: 10確定定量限。測(cè)得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺最低檢測(cè)限為6ng/mL，定量限為17ng/mL。

2.4 精密度與穩(wěn)定性

取空白血液0.5mL，按照2.3 方法配制4-溴-2,5-二甲氧基苯乙胺高、中、低3 個(gè)濃度（分別為10、4、0.02μg/mL）的質(zhì)控樣品，按1.4 項(xiàng)操作處理，測(cè)定3d，得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值，按照線性回歸方程計(jì)算準(zhǔn)確度、日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1，高、中、低濃度（10、4、0.02μg/mL）血樣測(cè)定準(zhǔn)確度分別為101%，95%和97%，日內(nèi)和日間RSD 均小于10%。

表1 血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺的精密度、提取回收率（n=5）Table 1 Precision and recovery of 4-bromo-2,5-dimethoxyphenethylamine in human blood (n=5)

2.5 回收率

取空白血液0.5mL，按照2.3 方法配制4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺高、中、低3 個(gè)濃度（分別為10、4、0.02μg/mL）的血液樣品各5 份，按1.4 項(xiàng)操作處理，得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生物峰面積A1。取空白血液 0.5mL，直按1.4 項(xiàng)操作處理后，添加相應(yīng)4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺標(biāo)準(zhǔn)工作液各5 份，衍生化、吹干、溶解后進(jìn)樣，得4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺衍生物峰面積A2。

回收率公式為：回收率= A1/ A2×100%。按照公式計(jì)算，測(cè)得的回收率見(jiàn)表1，平均回收率為69.5%。

3 討 論

本方法選用應(yīng)用廣泛的GC/MS 作為分析儀器，適應(yīng)當(dāng)前藥物檢測(cè)和法醫(yī)毒物分析工作的需要，經(jīng)過(guò)反復(fù)進(jìn)樣分析，確定起始溫度為110℃，升溫速率不宜過(guò)快，為10℃/min，較好地保證了被檢測(cè)組分的完全分離。結(jié)果表明，GC/MS 對(duì)該化合物的響應(yīng)值好，檢測(cè)靈敏度高，適用于血液樣品中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺成分的分析。

4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺屬于苯乙胺類(lèi)化合物，由于結(jié)構(gòu)中含有氨基，化合物呈堿性，選用陽(yáng)離子交換SPE 柱進(jìn)行樣品的提取、凈化處理，可消除血液中酸性、中性化合物對(duì)檢測(cè)的干擾。Theobald DS 等曾報(bào)道過(guò)體內(nèi)生物樣品中堿性藥品使用堿性陽(yáng)離子交換SPE 柱進(jìn)行樣品的前處理方法，這與本方法選用varian Bond Elut Centify?SPE 柱處理樣品的原理相同[10-12]。本研究選用該SPE 柱處理4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺可以達(dá)到較好的樣品前處理效果，血液添加樣品的提取回收率高，效果較好。

圖2 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺（1）和4-苯基丁胺（2）血液樣品總離子流圖。A：空白血液； B：血液 + 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺和4-苯基丁胺。Fig.2 Total ion chromatography of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine (1) and 4-Phenylbutylamine (2) in blood. A: blank blood; B: blank blood + 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine and 4-Phenylbutylamine.

圖3 4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺TFAA 衍生物（A）及4-苯基丁胺TFAA 衍生物（B）質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine (A) and 4-Phenylbutylamine (B) derivatives with TFAA

三氟乙酸酐作為常用的衍生化試劑運(yùn)用于本方法中，不僅可以提高產(chǎn)物的氣化效果，而且可以增加質(zhì)譜的響應(yīng)值，進(jìn)而提高了檢測(cè)靈敏度。有報(bào)道稱(chēng)應(yīng)用三氟乙酸酐衍生化的方法檢測(cè)生物樣品中甲基苯丙胺、氯胺酮等毒品成分，使檢測(cè)的靈敏度有較大提高[13-14]。研究選用三氟乙酸酐作為衍生化試劑，衍生化產(chǎn)物產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好，其他干擾物質(zhì)衍生化產(chǎn)物不影響4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺定性、定量分析。

目前，4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺作為新興毒品成分，已在我國(guó)發(fā)現(xiàn)并有逐步擴(kuò)大濫用的趨勢(shì)。建立血液樣品中該成分的分析方法勢(shì)在必行，本研究建立了固相萃取方法提取、凈化血液中4-溴-2, 5-二甲氧基苯乙胺成分，采用衍生化GC/MS 全掃描方法進(jìn)行定性分析，選擇離子模式進(jìn)行定量分析。方法簡(jiǎn)便、靈敏、可靠，適用于吸毒人員臨床藥物監(jiān)測(cè)和法醫(yī)毒物分析的需要。

[1] Shulgin A, Shulgin A. Pihkal. A chemical love story [M].Berkeley: Transform Press, 1992. 503-506.

[2] Giroud C, Augsburger M, Rivier L, et al. 2C-B: A new psychoactive phenylethylamine recently discovered in ecstasy tablets sold on the swiss black market [J]. J Anal Toxicol, 1998, 22(5): 345-354.

[3] Boer D, Bosman I. A new trend in drugs-of-abuse: the 2C-series of phenethylamine designer drugs [J]. Pharm World Sci, 2004, 26(2): 110-113.

[4] Babu K, Boyer EW, Hernon C, et al. Emerging drugs of abuse [J]. Clin Ped Emerg Med, 2005, 6(2): 81-84.

[5] 張潤(rùn)生，龔飛君，曾立波，等. 氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)精神藥品2C-B 和芬特明[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2004，25(增刊):147-148.

[6] 于忠山，張春水，王朝虹，等. BDMPEA 毒品的GC/MS 分析[J]. 刑事技術(shù)，2004(1): 13-14.

[7] Kanamori T, Inoue H, Iwata Y, et al. In vivo metabolism of 4-Bromo-2, 5- dimethoxyphenethylamine (2C-B) in the rat: Identification of urinary metabolites [J]. J Anal Toxicol,2002, 26(2): 61-66.

[8] Carmo H, Boer D, Remiao F, et al. Metabolism of the designer drug 4-bromo-2, 5- dimethoxyphenethylamine(2C-B) in mice, after acute administration [J]. J Chromatogr B, 2004, 811(2): 143-152.

[9] Pichini S, Pujadas M, Marchei E, et al. Liquid chromatography-atmospheric pressure ionization electrospray mass spectrometry determination of "hallucinogenic designer drugs" in urine of consumers [J]. J Pharmaceut Biomed,2008, 47(2): 335-342.

[10] 裴茂清，王俊新，伍海亮. 固相萃取法在苯丙胺類(lèi)藥物提取中的應(yīng)用[J]. 刑事技術(shù). 2002, 4: 21-22.

[11] 邸玉敏，朱軍，常靖，等. SPE-GC/MS、GC/NPD 法檢測(cè)血液中苯丙胺類(lèi)毒品[J]. 刑事技術(shù)，2010, 3: 11-14.

[12] Rohanova M, Palenicek T, Balikova M. Disposition of 4-bromo-2, 5-dimethoxyphenethylamine (2C-B) and its metabolite 4-bromo-2-hydroxy-5-methoxyphenethylamine in rats after subcutaneous administration [J]. Toxicol Lett,2008, 178(1): 29-36.

[13] 李雯佳，廖林川，陳禮莉，等. GC 法檢測(cè)血液和尿液中甲基苯丙胺和咖啡因[J]. 中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2009,24(1): 11-14.

[14] Weinmarm W, Renz M, Vogt S, et al. Automated solid-phase extraction and two-step derivatisation for simultaneous analysis of basic illicit drugs in serum by GC/MS [J]. Int J Legal Med, 2000, 113(4): 229-235.