楊雪瑩，曹海丹，裴 黎，徐 鵬

（1.公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室，北京100038；2.長春理工大學(xué)，長春 130022）

近期在世界很多國家和地區(qū)出現(xiàn)一種新興毒品，形態(tài)與茶葉相似，吸食方法與大麻（Cannabis sativa）相同，燃燒會揮發(fā)出類似四氫大麻酚的物質(zhì)（THC），其主要成分是JWH-073（1-丁基-3-（1-萘甲?；┻胚幔┖蚃WH-018（1-戊基-3-（1-萘甲酰基）吲哚）的一種烷基同系物。這兩種化合物均為合成大麻素，能夠與大麻素類似的受體結(jié)合，產(chǎn)生的效力比天然大麻強4～10 倍，能夠迅速地從肺部轉(zhuǎn)移到血液，到達全身各器官，吸食者可出現(xiàn)嘔吐、妄想、精神恍惚和情緒失控等癥狀，嚴重者會感到呼吸困難、心跳加速、激動和瞳孔放大等。這種毒品由多種植物混合制成，吸毒者把它稱作“香料”[1-3]。本研究使用DNA 條形碼鑒定技術(shù)，采用ITS2 DNA 條形碼片段，對新型“香料”毒品的植物成分進行鑒定研究，為“香料”毒品中有效成分的分析提供更確切的信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料為某市查獲的疑似毒品物質(zhì)，查獲的部分樣品外包裝袋上標識為“spike 99”，“K2”，“7 號”。樣品均為干燥植物成份，“K2”取兩種不同顏色樣本各1 份（“K2”-1, “K2”-2）、“spike 99”、“7 號”各取1 份，每種樣本各取30mg，研磨成粉末，利用QIAGEN DNeasy plant mini kit 提取基因組DNA。

1.2 PCR 擴增及序列測定

采用正向引物5'-GCGATACTTGGTGTGAAT-3'，反向引物5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'擴增ITS2 片段。PCR 反應(yīng)總體積為25μL，體系內(nèi)含PCR mix 12.5μL（Tiangen Biotech Co., 中國）、引物各1μL（2.5μmol/L），總DNA 1μL。PCR 反應(yīng)程序為94℃，預(yù)變性5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，40 個循環(huán)；72℃延伸10min。純化PCR 產(chǎn)物并使用ABI公司的3730XL 測序儀（美國Applied Biosystems公司）進行雙向測序[4-5]。

1.3 序列分析

將測序得到的峰圖應(yīng)用CodonCode Aligner V3.71（美國CodonCode 公司Dedham, MA）序列分析軟件進行校正拼接，ITS2 序列用HMMer 注釋法切除5.8S 和26S 端，保留ITS2 的全長，應(yīng)用BLAST方法在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對。

2 結(jié)果與分析

以植物樣本基因組DNA 為模板，擴增ITS2 基因片段得到了清晰的PCR 產(chǎn)物，空白對照無條帶，見圖1。

圖 1 測試樣品PCR 產(chǎn)物電泳圖。M：2000bp 分子量標準品；1-4 依次為“spike 99”、“K2”-1、“K2”-2、“7 號”PCR產(chǎn)物。Fig.1 Amplification of ITS2 from 4 samples. M: 2000bp molecular marker; Lane 1-4: “spike 99”，“K2”-1，“K2”-2，“7#”.

將PCR 產(chǎn)物純化后經(jīng)3730XL 測序儀進行測序，將序列用HMMer 注釋法切除5.8 和26S 端，保留ITS2 的全長，最終得到5 條220～235bp 的序列。經(jīng)BLAST 比對，同源性分析，發(fā)現(xiàn)所檢測的樣本“K2”-1 ITS2 片段序列與啤酒花（Humuluslupulus）ITS2 序列的同源性高達100%（見圖2），“K2” -2 ITS2 片段序列與黃蜀葵（Abelmoschusmanihot）ITS2序列的同源性高達100%，“7 號” ITS2 片段序列與大麻（Cannabis sativa） ITS2 序列的同源性高達100%，“spike 99”ITS2 片段序列與紫花苜蓿（Medicago sativa）ITS2 序列的同源性高達100%。

圖2 “K2”-1 ITS2 比對結(jié)果Fig.2 Sequence alignment of “k2”-1 with ITS2 sequences in NCBI database

3 討 論

DNA 條形碼技術(shù)是一種新興的物種鑒定方法，因其操作簡單、通用性強、技術(shù)統(tǒng)一，近年來逐漸成為物種鑒定研究的熱門方法[6]。ITS2 序列是位于核基因的一小段序列, 該序列在綠色植物中分布廣泛, ITS2 具有序列短、容易擴增、鑒定能力強等多個DNA 條形碼應(yīng)有的優(yōu)點, 是植物的DNA 條形碼研究中最受關(guān)注的序列之一[4]。

本研究基于ITS2 條形碼序列針對案件中繳獲的“spike 99”、“K2”、“7 號”物質(zhì)中的植物成分進行DNA 提取，通過PCR 擴增，獲得了高純度的ITS2 基因片段，在Gen-Bank 通過BLAST 搜索、比對，確定“spike 99”中植物成分與紫花苜蓿ITS2 基因序列的部分片段的同源性高達100%；“K2”中檢出兩種植物成分分別與啤酒花、黃蜀葵的同源性為100%，“7 號”與大麻的同源性為100%。其中黃蜀葵與大麻外形相似，為毒品原植物大麻的易混淆品種，但它與紫花苜蓿、啤酒花均是有經(jīng)濟實用價值和藥用價值的植物, 均不含有毒成分。針對本案例中繳獲的“spike 99”、“K2” 、“7 號”物質(zhì)中的化學(xué)成分應(yīng)用GC-MS 方法分析結(jié)果顯示，“K2”的主要活性成分是JWH-018, “spike 99” 主要的活性成分是JWH-073 和JWH-018，“7 號”的主要活性成分是大麻[7,8]。綜上所述，在本研究中，“spike 99”、“K2”中未檢出天然大麻成分，為非毒品原植物添加入人工合成大麻素成分制成的新型毒品，這與化學(xué)成分分析結(jié)果一致。由于研究樣本量有限，而且形態(tài)不規(guī)則，應(yīng)用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)很難確定其植物成分，DNA 條形碼技術(shù)因此成為植物形態(tài)學(xué)分類的有效補充，可為物種鑒定提供更準確的信息，相信隨著該技術(shù)的日益成熟，將會成為各類案件中的未知植物樣本鑒定的有效手段。

[1] 徐鵬，王一，錢振華，等.“K2”香料的GC/MS 檢驗1例[J]. 中國法醫(yī)學(xué)雜志，2011，26(3) : 250-251.

[2] Uchiyama N, Kikura-Hanajiri R, Ogata J, et al. Chemical analysis of synthetic cannabinoids as designer drugs in herbal products [J]. Forensic Sci Int, 2010, 198(1-3): 31-38.

[3] Hiroyuki K, Nahoko U, Jun O, et al. Chemical constituents and DNA sequence analysis of a psychotropic herbal product [J]. Forensic Toxicol, 2010, 28(2): 77-83.

[4] Chen S L, Yao H, Han J P, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species [J/OL]. PLoS One, 2010, 1(5): 8613.

[5] Gao T, Yao H, Song J Y, et al. Evaluating the feasibility of using candidate DNA barcodes in discriminating species of the large Asteraceae family [J/OL]. BMC EvolBiol,2010(10): 324.

[6] Hebert P D, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological identification through DNA barcodes [J/OL]. ProcBiolSci, 2003,270(1512): 313-321.

[7] 徐鵬，李曉娜，劉克林，等. 超快速液相色譜法測定新型“K2”香料中JWH-018 的含量[J]. 中國藥物依賴性雜志，2012, 21(4) : 282-284.

[8] 徐鵬，王一，錢振華，等. 新型香草香料“毒品”的GC/ MS 檢驗1 例[J]. 刑事技術(shù), 2011(3): 60-61.