李 琛， 師 哲， 馮 薇， 牛麗穎， 王鑫國(guó)*

(1. 河北中醫(yī)學(xué)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊050091;2. 邢臺(tái)市人民醫(yī)院藥劑科，河北 邢臺(tái)054000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是嚴(yán)重威脅中老年人群，尤其是絕經(jīng)后女性的一種全身性骨代謝疾病，研究表明雌激素缺乏是絕經(jīng)后婦女骨丟失的重要原因［1］。異黃酮類植物雌激素因其具有與內(nèi)源性雌激素相似的結(jié)構(gòu)，但少有雌激素樣副作用的發(fā)生，在防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究中備受關(guān)注。中藥淡豆豉是由豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr. 的成熟種子(黑色者)和青蒿、桑葉經(jīng)發(fā)酵加工而成，主要有效成分為異黃酮類。課題組前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用大鼠去卵巢的方法模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，發(fā)現(xiàn)淡豆豉能夠糾正骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的異常，改善骨微細(xì)結(jié)構(gòu)及骨生物力學(xué)性能，提高骨質(zhì)量［2-3］，但其作用機(jī)制尚不明確?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(estrogen receptor，ER)對(duì)調(diào)控骨形成和骨吸收的平衡有著重要作用，其表達(dá)水平與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)。本研究以淡豆豉異黃酮為研究對(duì)象，觀察淡豆豉異黃酮對(duì)大鼠成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)增殖及ERβ表達(dá)變化的影響，為淡豆豉抗骨質(zhì)疏松機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 出生24 h 以內(nèi)SD 大鼠，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)1112001)。

1.2 藥物與試劑 淡豆豉異黃酮，由本實(shí)驗(yàn)室自行分離純化，工藝為淡豆豉藥材用石油醚(60 ～90℃)脫脂，將脫脂后的淡豆豉用8 倍量70% 乙醇回流提取3 次，每次2 h，合并提取液回收乙醇，濃縮至每1 mL 含0.225 g 生藥。將0.225 g 生藥/mL 的濃縮液調(diào)pH 4.5 作為上樣液，以1.125 g 生藥/mL樹脂的最大上樣量，4 BV/h 的上樣流量通過(guò)ADS-7 大孔吸附樹脂，先用5 BV 水洗脫，繼以8 BV 70% 乙醇4 BV/h 洗脫，收集洗脫液，置減壓干燥箱中烘至完全干燥，取出，粉碎成80 目粉末，即得，紫外分光光度法測(cè)定總異黃酮含有量為40%。將淡豆豉異黃酮以DMSO 配制100 g/L 的母液，臨用前用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)工作濃度;大豆異黃酮，本實(shí)驗(yàn)室自制，總異黃酮含有量50%，配制方法同上。17β-雌二醇、ICI 182780(美國(guó)Santa Cruz 公司);低糖DMEM (美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(美國(guó)Hyclone 公司);胰蛋白酶、MTT (美國(guó)Amresco 公司);膠原酶Ⅱ(美國(guó)Invitrogen 公司);RT-PCR 試劑盒(天根生化科技北京有限公司);PCR 引物由上海生物工程有限公司合成，序列為ERβ (317 bp)正向引物5'-TGCCAATCATCGCTCCTCTA-3'，反向引物5'-CGCCGGTTCTTGTCTATGGT-3';GAPDH (450 bp)正向引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反向引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。ERβ Rabbit mAb (美國(guó)Santa Cruz 公司);HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Rabbit Anti-β-Actin (北京博奧森生物技術(shù)有限公司);ECL 發(fā)光檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierec 公司);其余試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要儀器 KHB ST-360 酶標(biāo)分析儀(上海科華生物工程股份有限公司);MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);Motic AE 倒置顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);PCR 儀(德國(guó)Eppendorf公司);電泳儀、電泳槽(北京六一生物科技有限公司);FR-200A 凝膠掃描系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 參照文獻(xiàn)［4］，采用改良組織塊法分離培養(yǎng)新生SD 大鼠顱骨成骨細(xì)胞。用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液(青霉素1 ×105U/L，鏈霉素1 ×105U/L，pH 7.2 ～7.4)進(jìn)行傳代，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳至第5 代，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及堿性磷酸酶染色鑒定(使用南京建成cAKP 試劑盒，按說(shuō)明書步驟操作)，5 ～6 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 成骨細(xì)胞增殖能力測(cè)定(MTT) 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，1、10、100、1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮組，淡豆豉異黃酮(1 000 μg/L) + ICI 182780(10 nmol/L)組(ICI 182780 于淡豆豉異黃酮干預(yù)前2 h 進(jìn)行孵育)，1 nmol/L 17β-雌二醇(E2)組，1 000 μg/L 大豆異黃酮(ISO)組。細(xì)胞傳至第5代，調(diào)整細(xì)胞密度為5 ×107個(gè)/L，接種至96 孔培養(yǎng)板，藥物干預(yù)，分別于48 h 和72 h 吸除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液和20 μL MTT (5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在492 nm 處檢測(cè)OD 值。

2.3 淡豆豉異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞ERβ mRNA 及蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 RT-PCR 檢測(cè)不同質(zhì)量濃度淡豆豉異黃酮干預(yù)后成骨細(xì)胞ERβ mRNA 表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，1、10、100、1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮不同質(zhì)量濃度組。細(xì)胞接種、藥物干預(yù)72 h，Trizol法提取成骨細(xì)胞總RNA;將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。ERβ 擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min;GAPDH 擴(kuò)增條件同ERβ。反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，用Quantity One 圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)各組ERβ 及GAPDH 電泳帶的光密度值，以兩者之比代表ERβ mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

2.3.2 Western blot 檢測(cè)不同質(zhì)量濃度淡豆豉異黃酮干預(yù)后成骨細(xì)胞ERβ 蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同“2.3.1”項(xiàng)。細(xì)胞接種、藥物干預(yù)72 h、細(xì)胞收集，加入含1% PMSF 的RIPA 裂解液，冰上靜置30 min使細(xì)胞充分裂解，收集蛋白。100 ℃煮樣5 min 使蛋白變性，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)目的蛋白分子質(zhì)量配制8% SDS-PAGE 凝膠，調(diào)整上樣量一致進(jìn)行電泳。常規(guī)濕轉(zhuǎn)操作。室溫下5% 脫脂牛奶封閉2 h。ERβ 抗體按1 ∶400 稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜，HRP 標(biāo)記的二抗1 ∶1 000 稀釋，室溫孵育2 h。暗室中加ECL 顯色。曝光、顯影、定影，Quantity One 圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)各組ERβ 及內(nèi)參βactin 光密度值，以兩者之比代表ERβ 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 ICI 182780、E2及ISO 對(duì)成骨細(xì)胞ERβ mRNA 及蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 RT-PCR 檢測(cè)ICI 182780、E2及ISO 干預(yù)后成骨細(xì)胞ERβ mRNA 表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮組，淡豆豉異黃酮(1 000 μg/L) + ICI 182780 (10 nmol/L)組(ICI 182780 于淡豆豉異黃酮干預(yù)前2 h 進(jìn)行孵育)，1 nmol/L E2組及1 000 μg/L ISO 組。其余方法同“2.3.1”項(xiàng)。

2.4.2 Western blot 檢測(cè)ICI 182780、E2及ISO 干預(yù)后成骨細(xì)胞ERβ 蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同“2.4.1”項(xiàng)。方法同“2.3.2”項(xiàng)。

3 結(jié)果

3.1 成骨細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定 傳代細(xì)胞培養(yǎng)3 d后形狀基本穩(wěn)定，呈三角形、纖維束狀、條索狀(圖1 A)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，可見(jiàn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)融合，呈“鋪路石”狀。第5 代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色后顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)有紫藍(lán)色顆粒，呈陽(yáng)性反應(yīng)，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為成骨細(xì)胞(圖1 B)。

圖1 大鼠成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及堿性磷酸酶染色鑒定(×200)Fig.1 Typical morphology observation of cultured rat osteoblasts and identification by Alkaline phosphatase staining (× 200)

3.2 淡豆豉異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組相比，淡豆豉異黃酮在質(zhì)量濃度為1 μg/L時(shí)處理48 h 促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖(P ＜0.01)，在質(zhì)量濃度為10、100、1 000 μg/L 時(shí)處理48 及72 h均顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖(P ＜0.01);1 000 μg/L ISO 干預(yù)48 及72 h 促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖(P ＜0.01或P ＜0.05);1 nmol/L E2處理48 h 促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖(P ＜0.01)。MTT 結(jié)果提示，干預(yù)48 h 后1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖作用被10 nmol/L ICI 182780 明顯拮抗(P ＜0.01)，干預(yù)72 h 后1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮促增殖作用被ICI 182780 完全拮抗，與空白對(duì)照組細(xì)胞增殖情況無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)。且干預(yù)72 h 后，1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮作用優(yōu)于同劑量ISO 組(P ＜0.05)(表1)。

表1 不同質(zhì)量濃度淡豆豉異黃酮、E2 及ISO 對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of different concentrations of ISSP，E2 and ISO on the proliferation of rat osteoblasts (±s，n=6)

表1 不同質(zhì)量濃度淡豆豉異黃酮、E2 及ISO 對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of different concentrations of ISSP，E2 and ISO on the proliferation of rat osteoblasts (±s，n=6)

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與1 000 μg/L ISSP 比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 OD 值48 h 72 h空白對(duì)照組0.203 ±0.012 0.276 ±0.013 1 μg/L 淡豆豉異黃酮 0.263 ±0.014＊＊ 0.295 ±0.015 10 μg/L 淡豆豉異黃酮 0.271 ±0.012＊＊ 0.304 ±0.024＊＊100 μg/L 淡豆豉異黃酮 0.266 ±0.009＊＊ 0.310 ±0.025＊＊1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮 0.273 ±0.009＊＊ 0.320 ±0.017＊＊1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮+ICI 182780 0.235 ±0.024＊＊## 0.289 ±0.010##1 nmol/L E2 0.250 ±0.026＊＊ 0.290 ±0.021 1 000 μg/L ISO 0.253 ±0.030＊＊ 0.298 ±0.017*#

3.3 不同質(zhì)量濃度淡豆豉異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞ERβ mRNA 及蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，淡豆豉異黃酮(1、10、100、1 000 μg/L)可以明顯上調(diào)ERβ mRNA 的表達(dá)水平(P ＜0.01)(圖2 A)。與空白對(duì)照組比較，淡豆豉異黃酮(1、10、100、1 000 μg/L)可以明顯上調(diào)ERβ 蛋白表達(dá)水平(P ＜0.01)(圖2 B)。

圖2 不同質(zhì)量濃度淡豆豉異黃酮對(duì)大鼠成骨細(xì)胞ERβ mRNA 及蛋白表達(dá)的影響(±s，n=3)Fig.2 Effects of different concentrations of ISSP on the expressions of ERβ mRNA and protein in rat osteoblasts (±s，n=3)

3.4 ICI 182780、E2及ISO 對(duì)成骨細(xì)胞ERβ mRNA及蛋白表達(dá)的影響

3.4.1 ICI 182780、E2及ISO 對(duì)成骨細(xì)胞ERβ mRNA 表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，1 000 μg/L淡豆豉異黃酮組ERβ mRNA 表達(dá)升高(P ＜0.05)，1 nmol/L E2組ERβ mRNA 表達(dá)升高(P ＜0.01)。10 nmol/L ICI 182780 能夠完全拮抗1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮上調(diào)ERβ mRNA 表達(dá)的作用，與空白對(duì)照組表達(dá)情況無(wú)顯著差異(P ＞0.05)(圖3A)。

3.4.2 ICI 182780、E2及ISO 對(duì)成骨細(xì)胞ERβ 蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮、1 nmol/L E2及1 000 μg/L ISO 組ERβ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P ＜0.01 或P ＜0.05)。加入拮抗劑后，1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮的上述作用被完全拮抗，與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮上調(diào)ERβ 蛋白表達(dá)的作用優(yōu)于同劑量ISO 組(P ＜0.01)(圖3 B)。

圖3 ICI 182780、E2 及ISO 對(duì)大鼠成骨細(xì)胞ERβ mRNA 及蛋白表達(dá)的影響(±s，n=3)Fig.3 Effects of ICI 182780，E2 and ISO on the expressions of ERβ mRNA and protein in rat osteoblasts (±s，n=3)

4 討論

成骨細(xì)胞起源于多能間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，負(fù)責(zé)合成骨基質(zhì)及促進(jìn)隨后的礦化，是骨形成的主要功能細(xì)胞，成骨細(xì)胞的增殖在很大程度上決定了最終形成的骨量。本實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的方法，觀察淡豆豉異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示:4 種不同質(zhì)量濃度(1、10、100、1 000 μg/L)的淡豆豉異黃酮均能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。將雌激素受體拮抗劑ICI 182780 與1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮共孵育，發(fā)現(xiàn)1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮促增殖作用被明顯拮抗，藥物干預(yù)72 h 后其促增殖效果降至空白對(duì)照組水平，推測(cè)淡豆豉異黃酮是通過(guò)雌激素受體介導(dǎo)而產(chǎn)生上述影響的。

雌激素受體屬核受體超家族成員，有ERα、ERβ兩種亞型。ERs 表達(dá)于所有關(guān)系到骨形成及骨吸收的細(xì)胞成分中，主要定位于生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中［5］。雌激素通過(guò)激活ERα 和ERβ 對(duì)成骨細(xì)胞發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)［6］。研究表明［7-8］多數(shù)植物雌激素對(duì)ER 具有一定的選擇性，往往對(duì)ERβ 的親和力大于ERα。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR 和Western blot 法檢測(cè)淡豆豉異黃酮干預(yù)后成骨細(xì)胞ERβ mRNA 及蛋白表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度淡豆豉異黃酮均明顯上調(diào)ERβ mRNA 及ERβ 蛋白表達(dá)(P ＜0.01)。與ICI 182780 共孵育時(shí)，成骨細(xì)胞ERβ mRNA 及蛋白表達(dá)被拮抗，相比單獨(dú)應(yīng)用1 000 μg/L淡豆豉異黃酮作用于成骨細(xì)胞ERβ mRNA 及蛋白表達(dá)水平下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了淡豆豉異黃酮具有雌激素樣作用，其促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的效應(yīng)可能是通過(guò)上調(diào)成骨細(xì)胞ERβ 表達(dá)完成的。

淡豆豉含有大豆中的12 種異黃酮類組分，分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩類。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)淡豆豉炮制后其中的主要異黃酮類活性成分大豆苷元和染料木素含有量升高，相應(yīng)糖苷含有量降低［9］。也有報(bào)道表明游離型苷元是大豆異黃酮在體內(nèi)發(fā)揮生物活性的主體［10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)72 h 后1 000 μg/L 淡豆豉異黃酮促成骨細(xì)胞增殖及上調(diào)ERβ 蛋白表達(dá)的作用略優(yōu)于同劑量大豆異黃酮組，這可能與炮制后苷向苷元轉(zhuǎn)化有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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