丁曉燕，朱鵬飛，王敏強，曲凌云*

(1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島 266061)

海水常見革蘭氏陰性病原菌Ⅲ型分泌系統的研究進展

丁曉燕1，2，朱鵬飛2，王敏強1，曲凌云2*

(1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島 266061)

許多革蘭氏陰性病原細菌借助細菌的Ⅲ型分泌系統(Type Ⅲ secretion system，T3SS)傳遞與致病有關的毒性因子和效應子來發(fā)揮病原細菌的毒性。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是海水中3種常見革蘭氏陰性病原細菌。這3種細菌不僅廣泛引起海水養(yǎng)殖生物的病害，還經常導致人類腸胃炎等其他危害，而Ⅲ型分泌系統也與它們的致病性密切相關。對海水中這3種常見革蘭氏陰性病原菌Ⅲ型分泌系統的組成、功能及相關轉錄調控機制進行了綜述。

革蘭氏陰性病原菌；Ⅲ型分泌系統；毒力因子

海水養(yǎng)殖環(huán)境中存在多種具有條件致病性的革蘭氏陰性菌，比如副溶血弧菌。副溶血弧菌是一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，不僅能引起人類食物中毒性腸胃炎，還可引起水生動物(如海鯛、對蝦、九孔鮑、文蛤等[1])疾病。嗜水氣單胞菌屬于弧菌科氣單胞菌屬，在自然界廣泛分布，可以感染多種水生及陸生動物，是一種重要的人、獸、魚共患病病原菌[2]。遲緩愛德華氏菌是一種革蘭氏陰性腸道病原菌，感染宿主范圍廣，在水產養(yǎng)殖生物中該菌是魚類鰻、鲇和鲆等的重要致病菌[3]。目前，對病原菌的致病機理研究較多，溶血素、粘附因子和胞外蛋白等多種胞外物質被認為與病原菌的毒力有關，然而這些毒力因子不足以引起嚴重的致病癥狀，可能存在其他毒力較強的致病因子[4-6]。關于細菌毒力因子的鑒定和特征分析已取得許多進展，盡管如此不同毒力因子之間的聯系以及進入宿主細胞的順序仍然未確定[7]。

細菌分泌系統的發(fā)現是近年來細菌致病機制研究的重要進展。系統發(fā)育和遺傳進化分析表明，細菌是通過幾種分泌機制將蛋白性質的毒力因子分泌出去的。到目前為止，共發(fā)現7種類型的分泌系統，它們以各自特有的方式參與細菌的致病過程[8]。其中，Ⅲ型分泌系統(Type Ⅲ secretion system，T3SS)與動植物革蘭陰性病原菌的毒力因子分泌有關，因此備受關注。Ⅲ型分泌系統首次發(fā)現于小腸結腸炎耶爾森菌中，由George P.C.Salmond和Philip J.Reeves[9]于1993年首次命名，該系統廣泛存在于革蘭氏陰性菌(如志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌、弧菌、假單胞菌和植物病原菌歐文氏菌屬、黃單胞菌屬等)中。海水環(huán)境中的某些革蘭陰性病原菌中也發(fā)現具有T3SS系統，Kwon-Sam Park等[10]證實副溶血弧菌T3SS具有對真核細胞的細胞毒性和腸毒性；Tan等[11]發(fā)現將遲緩愛德華氏菌T3SS相關基因突變后，突變株在魚類巨噬細胞中的存活、復制和殺死魚類細胞的能力都減弱；G.A.Carvalho-Castro等[12]利用PCR 技術檢測從病魚中分離的嗜水氣單胞菌的T3SS，結果表明完整T3SS的存在增加了嗜水氣單胞菌的毒性。多位生物學家通過試驗證實副溶血弧菌、遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的Ⅲ型分泌系統對真核細胞有較強的細胞毒性[13-16]，Ⅲ型分泌系統的存在與否直接影響病原菌的毒性強弱[15，17-18]。 筆者以副溶血弧菌、遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌3種水產養(yǎng)殖環(huán)境中常見的革蘭陰性病原菌為研究對象，對其Ⅲ型分泌系統的組成、相關結構蛋白、效應蛋白的功能以及相關表達調控過程的研究進展進行了綜述。

1 Ⅲ型分泌系統

Ⅲ型分泌系統存在于革蘭氏陰性菌中，廣泛參與革蘭氏陰性菌毒力因子的分泌，編碼T3SS的基因通常成簇地以毒力島(Pathogenicity island，PI)的形式存在于細菌的染色體或質粒上。與基因組其他部分相比，該分泌系統基因的GC含量較低或較高，目前認為是可轉移的外源基因插入成分，通過水平傳遞而獲得[19]。

所有已知動植物致病菌的Ⅲ型分泌系統都有許多高度保守的主要結構成分。Ⅲ型分泌系統由20種以上的蛋白質組成，是所有已知的蛋白質分泌系統中最復雜的[20]，其組分包括分泌蛋白、伴侶蛋白、結構蛋白和調節(jié)蛋白。調節(jié)蛋白對Ⅲ型分泌系統的基因表達起調節(jié)作用。分泌蛋白需要小的、通常是酸性、位于細胞質膜的附屬蛋白，特異性地與之結合，這種附屬蛋白質被稱為伴侶蛋白[21]。分子伴侶能夠穩(wěn)定細胞質內相應的底物，阻止相應底物自身及其他效應蛋白或轉位子蛋白未成熟前的同種或異種蛋白的結合，這種結合可能會導致結合蛋白的失活[22]。

Ⅲ型分泌系統的外排裝置由幾種完整的膜蛋白組成，橫跨細胞內、外膜，并延伸形成一個針狀結構通向胞外。各菌的Ⅲ型分泌系統在分泌功能上具有相似性，組織結構上卻各有不同。雖然Ⅲ型分泌系統附屬組件的結構和對稱性是多元化的，但研究表明這些系統是由同源蛋白分子組裝而成[23]。從圖1可以看出，通用結構為多環(huán)基底結構嵌入內、外膜和細胞周質間隙中，基底端與胞內的外排裝置和復雜ATP酶系統接觸，末端針狀的結構轉運毒力蛋白，通過周質和胞外環(huán)境直接進入宿主細胞。Ⅲ型分泌系統分泌裝置與鞭毛結構上有相似之處，可能由細菌鞭毛進化而來[24]。

Ⅲ型分泌系統受到接觸誘導后分泌與毒力有關的多種蛋白質注入宿主細胞內，這些蛋白稱為效應蛋白。Ⅲ型分泌系統可釋放幾種效應蛋白，刺激宿主細胞的信號轉導途徑，導致一系列的細胞效應[9]，如肌動蛋白的變構導致細胞骨架的重排、轉錄因子的激活、離子通道的刺激、在某些細胞會出現細胞凋亡等。這個分泌和轉移過程是由非常復雜的轉錄和轉錄后的機制調控的。

2 副溶血弧菌的Ⅲ型分泌系統

2.1 副溶血弧菌T3SS的組成2002年Tagomori[25]完成第1株副溶血弧菌全基因組測序，發(fā)現該菌含有2套Ⅲ型分泌系統(T3SS)，分別為T3SS1和T3SS2，后者是關鍵的毒力系統，可以細分為T3SS2ɑ和T3SS2β。T3SS1位于染色體1上，有30個開放閱讀框，序列與其他革蘭氏陰性菌的T3SS相關基因有一定同源性。T3SS1存在于所有的副溶血弧菌分離株中，其GC含量與基因組其他區(qū)域有差別，被認為是該菌的遺傳標記之一[26]。T3SS1的分泌裝置由一系列結構蛋白組成，包括內膜蛋白VcrD1、外膜蛋白VscC1以及細胞周質蛋白VscN1[10]。 Ono T[13]等利用二維凝膠電泳對副溶血弧菌T3SS1突變株及其親本株的分泌蛋白進行了對比分析，發(fā)現了T3SS1的4個分泌蛋白，分別為VP1656(VopD)、VP1680、VP1686和VPA450。Waddell B等[27]鑒定出VPA0451是VPA0450的特異性分子伴侶。VPA0451與已知的T3SS1分子伴侶結構相似，VPA0450轉運進入宿主細胞需要VPA0451的協助。VPA0451直接結合于VPA0450，25～100位氨基酸是VPA0451的活性部位。因此，確定VPA0451是迄今為止發(fā)現的T3SS1的第2個分子伴侶。

T3SS2位于染色體2的毒力島上[28]。副溶血弧菌KP+株擁有2種tdh基因，分別是tdhA和tdhS，不能同時擁有trh基因[29-31]；KP-株則擁有trh基因或者trh和tdh基因[10，32]。Okada N 等[33]對trh+副溶血弧菌TH3996株測序，發(fā)現在trh基因附近100 kb左右的DNA區(qū)域存在1種新的T3SS基因，經過動物試驗及PCR分析發(fā)現這種T3SS基因存在于所有的被檢測的trh+菌株中，并且對于細菌的胞外毒性必不可少，系統進化分析表明這種T3SS與KP+的T3SS2雖然有很近的關系，但卻屬于不同的系，這種新的T3SS2即T3SS2β。擬態(tài)弧菌和霍亂弧菌也存在T3SS2ɑ和T3SS2β基因，并且擬態(tài)弧菌與霍亂弧菌的關系更近。擬態(tài)弧菌和霍亂弧菌的T3SS2基因可能是通過水平基因轉移得到的[34]。與T3SS1相似，副溶血弧菌vcrD2、vscC2和vscN2分別編碼了T3SS2的內膜蛋白，外膜蛋白和細胞周質蛋白[10]。ZHOU等[28]用二維凝膠電泳方法對親本株(敲除T3SS1結構基因vscN1的菌株)和突變株(敲除掉T3SS1和T3SS2的結構基因vscN1、vscN2的菌株)所分泌的蛋白進行對比分析，其中VopL、 VopT、VopA、VopV 和 VopC是已知的效應蛋白，VopB2、 VopD2 和VopW是T3SS2易位子的組成部分，是分泌裝置的一部分，VopcC 是VopC的分子伴侶，另外還有VPA1336(VopZ)、 VPA1350、VPA1343；VPA1343 是T3SS2的分泌裝置，VPA1350在轉運過程中起結構或調節(jié)作用。Akeda Y等[35]研究發(fā)現VocC是T3SS2效應蛋白VopC和VopL的分子伴侶。

2.2 副溶血弧菌T3SS的作用副溶血弧菌T3SS1主要貢獻對宿主細胞的細胞毒性，介導宿主細胞的自體吞噬作用，最后導致細胞死亡。T3SS1的分泌蛋白中VopQ/A(VP1680)是T3SS1介導真核細胞毒性的最主要蛋白，具有對Hela細胞的細胞毒性。Sreelatha A等[36]研究表明即使環(huán)境中存在自噬的化學抑制劑，VopQ也足以引發(fā)宿主細胞的快速自噬，VopQ在溶酶體膜表面形成小孔，使溶酶體釋放小于350 D的分子，從而誘導宿主細胞自噬。VopD也具有對Hela細胞的毒性，此外還具有溶血活性。VP1686不僅能通過抑制NF-JB的活性來介導巨噬細胞死亡[37]，還能通過抑制RhoB的鳥苷三磷酸酶及下游的信號傳導，阻止被感染細胞肌動蛋白的聚集和巨噬細胞肌動蛋白的快速重排，有助于抵抗巨噬細胞對病原菌的吞噬作用[38-40]。

副溶血弧菌T3SS2位于染色體2的毒力島上，具有腸毒性。目前共鑒定出6種副溶血弧菌T3SS2的效應蛋白，VopA能活化激酶催化環(huán)結構中保守的賴氨酸乙?；柚笰TP的結合，最終阻止激酶的磷酸化[41]。VopT(VPA1327)具有核糖轉移酶活性，部分貢獻T3SS2對Caco-2的細胞毒性[14]。VopL(VPA1370)能誘導肌動蛋白抗壓纖維的形成，并加速肌動蛋白纖維絲的聚集[42]。VopC(VPA1321)與大腸桿菌細胞毒性壞死因子的同源性達38%[43]。Zhou等[28]首次闡明了VopZ在誘導腹瀉中發(fā)揮獨特作用，VopZ抑制絲裂原活化蛋白激酶MAP3K7(TAK1)的啟動，控制MAPK和 NF-κB信號傳導途徑，從而抑制細胞分裂。此外，N-末端玻尿酸標記的VopZ能夠在Hela細胞表面形成小孔。因此，VopZ對副溶血弧菌在腸道內的增殖作用不大，而有助于該菌在腸道內引起腹瀉和組織破壞等疾病。

副溶血弧菌T3SS2效應蛋白分泌到宿主細胞中需要通過3種蛋白質形成的膜通道，分別為轉運蛋白 VopB2、VopD2和VopW。Zhou X等[18]研究表明VopW幫助另外2種蛋白質插入宿主細胞膜形成膜通道，對效應蛋白分泌到宿主細胞必不可少。利用vopW基因的缺失菌株感染動物，發(fā)現菌株無法轉運已知的T3SS2分泌蛋白到宿主細胞中，也無法檢測到其他轉運蛋白插入到宿主細胞膜中，而且在感染動物模型試驗中缺失株是無毒的，這些結果結合VopW的大小和預測的二級結構，揭示VopW是副溶血弧菌的親水性轉運成分，引導VopD2 和VopB2 組裝并插入到宿主細胞膜孔。另外，VopW自身可以轉運到宿主細胞的細胞質，可能既是轉運蛋白又是效應蛋白。

2.3 副溶血弧菌T3SS的主要調控因子及調控機制副溶血弧菌ExsA與ExsD能夠調控T3SS1基因簇的轉錄表達，ExsA為正向轉錄調控，ExsD為負向轉錄調控[44]。Zhou X等[45]通過不同抗原標記的重組蛋白共表達試驗表明ExsC結合ExsD，并且ExsC的N-末端對結合十分必要?？乖瓨擞浀腅xsA和ExsD的共表達和純化試驗表明ExsD直接結合ExsA，猜測這種結合阻止了ExsA與T3SS1基因啟動區(qū)的結合。總體而言，這些試驗結果說明ExsD 結合ExsA阻止T3SS1的表達，ExsC結合ExsD 釋放ExsA，從而允許T3SS1的表達，副溶血弧菌ExsA、ExsC和ExsD與銅綠假單胞菌調節(jié)因子在功能上有直系同源性。

3 嗜水氣單胞菌Ⅲ型分泌系統

3.1 嗜水氣單胞菌T3SS的組成Yu等[46]首次報道了嗜水氣單胞菌AH-1株中存在T3SS，利用基因步移法克隆了全長的T3SS序列，其中包括5個啟動子和25個開放閱讀框表達25種T3SS組分蛋白。AexT和AexU是嗜水氣單胞菌的效應蛋白。AopN 蛋白是T3SS的重要組成部分，它是外在膜蛋白，ascV和aopB基因的編碼產物是嗜水氣單胞菌T3SS的必要構成成分，前者編碼與T3SS固定在細菌內膜有關的蛋白，后者編碼的蛋白是易位子的組裝成分。Sha等[47]根據耶爾森菌T3SS基因yscV設計探針，在嗜水氣單胞菌人源腹瀉分離株SSU基因組文庫中檢測到全長26 855 bp的T3SS，共35個開放閱讀框。通過對嗜水氣單胞菌AH-1株和SSU株的T3SS序列的比較發(fā)現，二者的同源性不高。基因序列的變化可能會改變蛋白質構象，從而產生不同的效應蛋白和結構蛋白，這也解釋了雖然包括無毒株在內的許多嗜水氣單胞菌都含有T3SS，但其結構不完全相同，也許決定了它們毒力方面的差異。

3.2 嗜水氣單胞菌T3SS的作用現已證實，嗜水氣單胞菌存在2個效應蛋白(AexT[43，48]和AexU)，殺鮭氣單胞菌存在4個效應蛋白(AexT[49]、AopP[50]、AopH和AopO)。AexT是嗜水氣單胞菌中發(fā)現的第1個效應蛋白，也是最小的效應蛋白。Vilches S等[45]對嗜溫的嗜水氣單胞菌AH-3 株T3SS分泌的ADP-核糖基化毒素(AexT)進行克隆和測序，發(fā)現AexT與殺鮭氣單胞菌AexT的前半部分具有同源性。AexT具有ADP-核糖轉移酶活性，aexT基因缺失株的毒性與野生株相比輕微減小，而T3SS基因缺失株的毒性則大大降低。

Sierral等[15]證實嗜水氣單胞菌SSU株AexU作為ADP-核糖化轉移酶和GTP酶活化蛋白，參與宿主細胞的凋亡和肌動蛋白的分解，AexU可以阻止c-Jun、JNK和JκB的磷酸化并抑制Hela細胞1L-6和1L-8的分泌，從而抑制NF-κB和Rho GTP酶的活性。AexU與銅綠假單胞菌ExoT/S同源，氨基末端與耶爾森氏菌YopE活性相似，AexU 約有67%的序列與 AexT相似，然而其羧基端序列不與任何已知的蛋白質序列同源[44]。AexU羧基端的單核苷酸替換率約為17%，而AexT則要保守得多，其單核苷酸替換率在4%左右，或許AexU羧基端是獨立于氨基端進化的，這不僅能產生不同的等位基因，而且產生多種 AexU效應蛋白以適應宿主體內不斷變化的環(huán)境。此外，溫和氣單胞菌AexU共定位β4-整合蛋白，產生應對宿主細胞的細胞毒素[51]。

ascV和aopB基因是嗜水氣單胞菌T3SS的必要構成成分，前者編碼與T3SS固定在細菌內膜有關的蛋白，后者編碼的蛋白是易位子的組裝成分。G.A.Carvalho Castro等[12]利用PCR技術從T3SS中檢測ascV和aopB基因，估測2種基因在嗜水氣單胞菌病原菌和環(huán)境分離株中的頻率，2種基因有3種存在方式：ascV+/aopB+、ascV+/aopB-和ascV-/aopB-。檢測到的64株病魚分離菌ascV+/aopB+頻率最高(62.5%)，說明ascV+/aopB+病原菌能夠引起魚類極高的死亡率。環(huán)境分離株雖然有T3SS結構，但是毒力很低。PCR技術可以有效鑒定T3SS，并且可以將嗜水氣單胞菌的毒力因子進行分類。謝振宣等[52]利用自殺性質粒成功構建了嗜水氣單胞菌J-1株ascV基因的缺失突變株，該突變株許多胞外產物缺失，毒力消失，說明AscV在嗜水氣單胞菌J-1株的致病過程中發(fā)揮重要作用。

3.3 嗜水氣單胞菌T3SS的主要調控因子及調控機制從圖2可以看出，嗜水氣單胞菌Ⅲ型分泌系統的表達與其他毒力因子之間存在復雜的聯系，如脂多糖、ahyIR群體感應系統、PhoPQ雙組份系統和復雜的丙酮酸脫氫酶等。PhoPQ系統對胞外鎂離子濃度敏感，低濃度鎂離子激活PhoPQ的轉錄，高濃度則抑制其轉錄，PhoPQ抑制T3SS的表達。為了研究嗜水氣單胞菌T3SS在體內的表達，Vilches S等[53]用綠色熒光蛋白標記和實時定量PCR方法分析aopN-aopD和aexT基因啟動區(qū)的活性，結果發(fā)現環(huán)境因子誘導嗜水氣單胞菌AH-3菌株T3SS的表達，其中鈣的消耗和高濃度鎂離子是誘導T3SS表達最主要的因素，溫度升高也能促進其表達。同時，發(fā)現嗜水氣單胞菌脂多糖結構與T3SS效應蛋白的產生有關，O-抗原結構的改變影響細菌表面的親水特性，從而影響T3SS機制活化的信號感知。鞭毛基因的突變也降低了aopN-aopD和aexT啟動子的活性，說明鞭毛和T3SS之間存在交叉調控[54]。RpoN基因對于嗜水氣單胞菌AH-3 的極性和橫向鞭毛的產生是必不可少的。PDHc基因的突變降低了T3SS的表達，說明PDHc對于T3SS的表達是必不可少的。嗜水氣單胞菌AH-3株T3SS調節(jié)子群體感應系統正向調節(jié)T3SS結構蛋白的生成[50]。在誘導T3SS表達的情況下，嗜水氣單胞菌AH-3axsA基因突變株的T3SS活性與野生株相比大幅下降，而AxsA與銅綠芽胞桿菌ExsA區(qū)域相似[55]，存在類似的結合位點，說明AxsA 是嗜水氣單胞菌AH-3 株T3SS的主要調節(jié)因子。由于T3SS結構基因和aexT基因不在同一基因組區(qū)域，所以AxsA的調控是一個通用調控途徑，而AopN的缺失打開T3SS通道，激活正向反饋機制，從而激活AxsA，而AxsA促進T3SS的表達[50]。細菌存在一個復雜的調控網絡中，能將T3SS的生成和細菌功能聯系起來，說明毒力因子表達的精確時間與協調性對于感染過程十分必要。

4 遲緩愛德華氏菌Ⅲ型分泌系統

4.1 遲緩愛德華氏菌T3SS的組成Tan等[11]利用染色體步移技術和蛋白質組學方法鑒定遲緩愛德華氏菌T3SS基因，鑒定出35個開放閱讀框，編碼T3SS結構蛋白、分子伴侶、效應蛋白和調節(jié)蛋白。遲緩愛德華氏菌T3SS基因與沙門氏菌毒力島2(SPI2)編碼的T3SS基因同源，遲緩愛德華氏菌3種效應蛋白分別與沙門氏菌效應蛋白SseB、C、D同源，于是分別命名為EseB、C、D。T3SS編碼區(qū)域有30 756 bp，GC含量高于Ed.tarda染色體組，而SPI2的GC含量則低于染色體組。遲緩愛德華氏菌的效應蛋白基因為eseB、eseC、eseD和eseE，伴侶蛋白基因為escA、escB和escC，雙組分調節(jié)系統基因為esrA-esrB，轉錄調節(jié)因子基因為esrC。

4.2 遲緩愛德華氏菌T3SS的作用插入失活調節(jié)蛋白基因esrA和esrB，裝置蛋白基因esaC，分子伴侶基因escA，分別觀察細菌在魚類巨噬細胞的存活和復制能力、對無吞噬能力的EPC細胞的粘附和內化能力以及魚類的半數致死量。研究發(fā)現，與野生株相比，突變株的存活、復制和殺死魚類細胞的能力都減弱；esrA和esrB突變株降低遲緩愛德華氏菌對細胞的粘附和內化能力[17]。李杰等[56]利用框內缺失突變技術進行esaC定點突變，研究發(fā)現esaC基因的缺失影響效應蛋白EseB、EseC和EseD的分泌，但不影響在胞內的表達。這可能是因為esaC的缺失影響遲緩愛德華氏菌T3SS孔道結構的完整性，從而影響蛋白的正常分泌。

Wang Bo[57]等利用框內缺失突變法構建eseD基因突變株，與野生株相比eseD缺失突變株的效應蛋白EseC和EseB分泌水平降低，菌株的群集運動能力和接觸溶血能力衰減，但生物膜合成能力增加?；パa表達后表型恢復到與野生株類似。侵染試驗表明eseD缺失突變株復制能力降低，對魚類的毒力降低10倍。這些結果表明EseD在E.tarda致病性中有特定作用。插入失活效應蛋白基因eseB，突變株在培養(yǎng)基中的自凝聚能力下降，說明EseB可能是胞外纖毛或者附屬物的組成成分。當細菌在中性或堿性環(huán)境中培養(yǎng)時，EseB、C、D的分泌量達到最大值。研究發(fā)現，包含野生菌的吞噬體呈酸性，而包含T3SS突變體的吞噬體呈堿性，說明T3SS干擾巨噬細胞形成酸性環(huán)境對于遲緩愛德華氏菌胞內復制是十分必要的[17]。EseB、EseC和EseD蛋白是E.tardaT3SS輸送器的組成成分，在分泌到細菌細胞外后可以組成輸送器裝置。

分子伴侶對于輸送器蛋白的穩(wěn)定和分泌具有重要的作用。EscC被鑒定為EseB和EseD的伴侶蛋白，并影響EseB和EseD的分泌和穩(wěn)定性[58]。Okuda J等[59]研究發(fā)現伴侶蛋白基因escC和位于T3SS基因簇上的orf13、orf19、orf29和orf30基因對于遲緩愛德華氏菌侵染斑馬魚是必不可少的。

EscA是EseC的分子伴侶并貢獻遲緩愛德華氏菌對宿主細胞的毒力。escA基因位于eseC基因上游，框內缺失escA基因的突變株不影響eseC基因的轉錄，但是通過EseC-LacZ融合蛋白檢測到eseC在細胞內的積累水平減少。進一步研究表明，EseC蛋白31～137氨基酸殘基對于EseC-EscA的反應不可缺少[60]。

4.3 遲緩愛德華氏菌T3SS的主要調控因子和調控機制為了生存和適應外界環(huán)境的變化，細菌通過一系列的信號轉導途徑來響應環(huán)境信號并對刺激作出應答(圖3)。雙組分系統(Two-component system，TCS)是細菌最關鍵的信號轉導系統，與病原菌在宿主體內外不同環(huán)境條件下的適應能力密切相關。遲緩愛德華氏菌TCS協同全局調控蛋白和σ因子等調控元件共同作用。EsrA/EsrB系統調控T3SS蛋白的表達和分泌，值得注意的是EsrB還通過T3SS基因簇編碼的AraC家族的調控蛋白EsrC來調控T6SS和部分T3SS基因的表達[61]。此外，發(fā)現EsrB協同核酸結合蛋白Hha共同抑制溶血素基因tdhA的表達。遲緩愛德華氏菌EsrB和PhoP為主要的毒力調控因子，PhoP通過2條途徑作用毒力：①對T3SS和T6SS的調控；②對CAMP的抵抗。通過對尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶(Ugd)的功能鑒定和表達分析，揭示了PhoP通過調控Ugd介導抵抗宿主陽離子抗菌肽(CAMP)的殺傷作用[62]。 外界環(huán)境的變化也影響細菌分泌系統的表達，遲緩愛德華氏菌在感染過程中經歷了由環(huán)境溫度到宿主溫度的變化，T3SS受到溫度的調控，研究表明在37 ℃條件下細菌生長快，T3SS結構蛋白表達量較低[63]；在28 ℃條件下，T3SS的結構蛋白表達最高。在28和37 ℃的培養(yǎng)條件下，中性和堿性分別適合細菌的生長和T3SS結構蛋白的表達。遲緩愛德華氏菌群體感應系統 QesB-QseC影響由鞭毛和纖毛形成的細菌表面結構，并通過介導腎上腺素信號調控鞭毛合成元件及分泌系統元件的表達，影響菌株的運動能力和對宿主細胞的粘附能力[58]。

5 小結

近年來，海水養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，為人們創(chuàng)造巨大經濟效益的同時也帶來了負面影響，比如細菌病害的泛濫。這是由于目前國內對水產病原菌的治療主要依靠抗生素，隨著抗生素的大量使用，細菌的耐藥廣譜越來越大，并且引起了環(huán)境污染的問題，因此抗生素的作用也受到限制。因此，亟待解決的問題是找到一種環(huán)境危害小、方便又高效的方法來防治水產疾病。

副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌都是嚴重的魚類致病菌，其中T3SS是重要的毒力因子。自發(fā)現T3SS以來，國內外學者對其結構蛋白、分泌蛋白和調控機制等進行了深入研究，認識水平有了很大提高。作為一種病原菌向宿主細胞內靶向轉運毒力蛋白的系統，T3SS是病原菌與宿主相互作用的重要界面，當受到接觸誘導后分泌多種效應蛋白到宿主細胞，導致一系列細胞效應，如通過抑制細胞信號傳導，阻止被感染肌細胞動蛋白的聚集和巨噬細胞肌動蛋白的快速重排，從而抑制巨噬細胞的吞噬；肌動蛋白的變構導致細胞骨架的重排、轉錄因子的激活、離子通道的刺激、在某些細胞會出現細胞凋亡；抑制NF-κB和Rho GTP酶的活性，從而誘導宿主細胞凋亡和肌動蛋白的分解等，分泌和轉移過程是由非常復雜的調節(jié)機制調控的。這些研究結果對研制新的抗菌感染藥物和疫苗等策略提供了可能性。Rosenzweig J A等[16]在評估A.HydrophilaAexU對小鼠毒性和免疫原性的貢獻時發(fā)現A.hydrophilaΔaexU突變株對小鼠的致死率明顯下降，并且ΔaexU突變株在被感染的小鼠體內不會擴散到肺和脾臟等器官，rAexU 突變株對小鼠提供保護性免疫原性，試驗結果為研發(fā)A.Hydrophila疫苗提供了可行性；Xiao J等[64]將E.tardaEIB202突變株WED作為研究對象，WED是將T3SS的eseB、eseC、eseD基因和分枝酸合成基因aroC缺失，并將內源質粒pEIB202去掉的菌株。研究發(fā)現WED的半數致死量是野生株的5700倍；將WED作為疫苗接種到大菱鲆5個周后，大菱鲆能夠免于E.tardaEIB202野生株毒力因子的作用，產生低水平的特異性抗體和免疫相關因子，結果表明WED作為大菱鲆的活體減毒疫苗具有可行性。

目前，依然存在許多亟待解決的問題(如鑒定出誘導和抑制T3SS表達的環(huán)境和宿主信號因子、解釋效應蛋白與宿主細胞的相互作用等)，對于研究T3SS復雜的調節(jié)機制，闡明其致病機理，設計針對T3SS表達的治療藥物和方法，都具有極其重要的意義。

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Research Progress of Type Ⅲ Secretion System in Common Mariculture Gram-negative Pathogenic Bacterium

DING Xiao-yan1,2, ZHU Peng-fei2, WANG Min-qiang1, QU Ling-yun2*

(1. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai, Shandong 264005; 2. The First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao, Shandong 266061)

Many Gram-negative pathogenic bacteria develop their virulence factors or effectors to eukaryotic host cells through their type Ⅲ secretion systems(T3SSs).Vibrioparahaemolyticus,EdwardsiellatardaandAeromonashydrophilaare three common Gram-negative pathogens in marine aquaculture, which not only infect aquaculture animals but also cause gastroenteritis in humans. T3SS are suggested to be closely related to bacteria pathogenicity in these three pathogens. The recent progresses in the composition, function and regulation mechanism study of the T3SSs in those three pathogens were summarized.

Gram-negative pathogens; Type Ⅲ secretion system; Virulence factors

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201105007-1)；國家科技支撐計劃項目(2012BAD17B01)。

丁曉燕(1990- )，女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導師，從事海水養(yǎng)殖動物病原微生物學研究。

2015-03-23

S 917.1

A

0517-6611(2015)13-156-06